分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)動(dòng)植物檢疫專(zhuān)業(yè)2021, 2分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)本卷須知1 .課前要提早預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，理清實(shí)驗(yàn)順序，制定實(shí)驗(yàn)方案沒(méi)有 方案或方案不合理者不能進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作）。2 .由于實(shí)驗(yàn)內(nèi)容多，時(shí)刻短，多數(shù)實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)或穿插進(jìn)行，一定要做好統(tǒng)籌安排。3 .實(shí)驗(yàn)課中的所有單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都屬于一個(gè)整體流程。實(shí)驗(yàn)時(shí)刻安排上沒(méi)有上下午晚上等嚴(yán)格 的作息安排，一切服從實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，必須在理論課上課期間完成。4 .實(shí)驗(yàn)的每一步都要詳細(xì)地記錄操作內(nèi)容、時(shí)刻、步驟、結(jié)果等，以備查詢(xún)！5 .對(duì)任何自己不熟悉的實(shí)驗(yàn)儀器都不要隨意操作（專(zhuān)門(mén)是微量移液器！在操作的過(guò)程中 發(fā)覺(jué)任何意外的現(xiàn)象都要及時(shí)向任課教師匯報(bào)

2、。6 .寫(xiě)作實(shí)驗(yàn)報(bào)告或?qū)嶒?yàn)論文一定要文理通順、邏輯清晰、圖表說(shuō)明詳細(xì)，討論分析透徹。7 .在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不能大聲喧嘩。8 .在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），嚴(yán)禁隨 地丟棄！專(zhuān)門(mén)注意對(duì)廢棄細(xì)菌的殺滅和有毒垃圾的定點(diǎn)投放。9 .實(shí)驗(yàn)終止后要把用過(guò)的器皿清洗后歸放整齊并清點(diǎn)數(shù)目，向教師匯報(bào)征得同意后方可離 開(kāi)實(shí)驗(yàn)實(shí)。10 .值日組的同學(xué)最后高開(kāi)，等待清掃實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生，關(guān)閉門(mén)窗水電。11 .實(shí)驗(yàn)時(shí)損壞的任何物品都要及時(shí)申報(bào)。實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的提取1.目的學(xué)會(huì)最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法。2 .原理依照共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線(xiàn)性DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離

3、。在pH 12.0-12.5 那個(gè)狹窄的范疇內(nèi)，線(xiàn)性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性。盡管在這項(xiàng)的條件下共價(jià)閉合環(huán) 狀質(zhì)粒DNA也會(huì)變性，但兩條互補(bǔ)鏈彼此互相盤(pán)繞，仍會(huì)緊密結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液使pH復(fù)原中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線(xiàn)性的染色體 DNA復(fù)性緩慢，通過(guò)離心與蛋白質(zhì)和大分子RNA 一起沉淀下去。3 .器材超凈工作臺(tái)，接種環(huán)，酒精燈，臺(tái)式離心機(jī)，旋渦混合器，微量移液取樣器，1.5ml微 量離心管，恒溫?fù)u床，搖菌試管，雙面微量離心管架，試管架，標(biāo)簽紙，磁力攪拌機(jī)。4 .試劑PMD18-T-F載體菌，LB培養(yǎng)基1000ml （含lOOug/ml疑茉青萄素

4、），簡(jiǎn)萄糖 “risZEDTA（GTE）溶液（溶液 I）, NaOH/SDS 溶液（溶液 II）, KAc 溶液（pH4.8）（溶液 III）, RNase A, 95%乙醇，70%乙醇，TE buffer （pH8.0）o 5.實(shí)驗(yàn)預(yù)備縱葦青霉素儲(chǔ)存液（無(wú)菌水配制5mg/mL分裝后-20。（2儲(chǔ)存），配制LB培養(yǎng)基（胰化 蛋白陳10g，酵母提取物5g,NaQ 10g力200mLdd water攪拌完全溶解，用約20（HiL5N NaOH 調(diào) pH 至 7.0,加 ddwater 至 IL,。C20min 滅菌）；溶液 I （50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris HC1 pH8

5、.0, lOmmol/L EDTA pH8.0）：溶液 H （0.2mol/L NaOH, 1% SDS）：溶液 HI （60mL 5mol/L Kac,加冰乙酸調(diào) pH4.8,補(bǔ) dd water 至 100ml）, 70%乙醇（-20 儲(chǔ)存），TE buffer （lOmmol/L Tris HC1 pH8.0, 1 mmol/L EDTA pH8.0）： lOmg /mL RNase A （RNA 酶 A 溶于10mmol/LTrisHClpH7.5, 15mmol/LNaQ中）；搖菌試管洗凈并蓋上棉花塞、1.5ml離心管 裝入鋁制飯盒、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒，一起高壓火菌（121

6、30min）e6 .操作步驟（1）在超凈工作臺(tái)中取5ml LB （Amp+）,加入滅菌的搖菌管中。（2）從超低溫冰箱中取出儲(chǔ)存pMD-18T-F的菌種（操作完后迅速把菌種放回超低溫冰柜 中，切不可將菌融解！），在超凈工作臺(tái)上用燒紅的接種環(huán)刮一下，再把接種環(huán)于無(wú)菌LB培 養(yǎng)液（含100ug/ml氨茉青霉素）中攪拌一下，37。（2搖床中搖20h. 取1.5ml的菌液于1.5ml離心管中，15000rpm離心Imin,棄上清液（盡量棄潔凈）， 留沉淀備用。(4)在沉淀中加入1003溶液I,蓋上蓋后趕忙在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min.(等待的同時(shí)，取一個(gè)塑料盒，裝上適量的冰塊備用。)加入200

7、川溶液H,蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻,插入冰中，放置5min.(6)加入150m溶液HI,蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min。15000rpm離心5min,小心吸取400川 上清液于另一個(gè)潔凈的1.5ml離心管中,(不要 將白色沉淀物帶入！)，加入800口1 95%乙醇，蓋上蓋后趕忙在渦旋混合器上混勻，室溫下 靜置5min。 15000rpm離心lOmin,小心弄掉上清液,加入500M 70%乙醇，蓋上蓋后趕忙在渦 旋混合器上混勻。15000rpm離心10 min,小心棄掠上清液，盡量倒置棄潔凈(9)再加入500入70%乙醇，蓋上蓋后趕忙在渦旋混合器上混勻。15000rpm離心lO

8、min, 小心棄掉上清液，盡量倒置棄潔凈(10)離心管倒置于37。(2培養(yǎng)箱中(或室溫)空氣干燥。(管底的沉淀質(zhì)粒DNA用肉眼幾 乎看不見(jiàn)！(11) pMD18-T-F加入30口 1無(wú)菌蒸飾水或TE緩沖液，用記號(hào)筆標(biāo)記后放入冰箱中備用。 (12)在剩余的菌液中倒入少許84消毒液，待溶液變清亮后隨廢液和剩余的冰塊一起倒入 下水池。清理桌面，清洗儀器，撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告7 .摸索(1)阻礙本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些？1 .目的學(xué)會(huì)用限制性?xún)?nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA。2 .原理H型限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部的專(zhuān)門(mén)序列并在識(shí)別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成 粘性末端或齊平末端，通過(guò)電用酶切后的DNA混合物能夠確認(rèn)和分離

9、酶切片段。3 .器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架， 水漂，恒溫水浴。4 .試劑PMD18-T-F質(zhì)粒,EcoRL BamH I,內(nèi)切酶緩沖液（10X，10F電泳加樣緩沖液5 .實(shí)驗(yàn)預(yù)備配制TAE電泳緩沖液（50x儲(chǔ)存液），1000x液化乙錠儲(chǔ)存液10x加樣緩沖 液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（火菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（火菌）6 .操作步驟（1）混合以下溶液于一個(gè)無(wú)菌的1.5ml微量離心管中：PMD18-T-FDNA (或 pUCm-T-F )6 pL10 X酶切緩沖液(用EcoRI的緩沖液)2 pLdd water30 j.iLEc

10、oRI1 pLBainHIIpL總體積40FiL（2）先預(yù)備一個(gè)冰盒并放入一定量的冰塊。從-20冰柜中取出限制性?xún)?nèi)切酶，趕忙插入冰 塊中。（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶液加溫），另一只手 持微量移液器，小心翼翼地吸取UiL限制性?xún)?nèi)切酶。（4）在酶切樣品混合液中加入限制性?xún)?nèi)切酶后（趕忙把內(nèi)切酶原液送回冰柜！"輕輕震動(dòng) 微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機(jī)中l(wèi)OOOrpm離心10杪。取出后插到水漂的孔中， 在舉薦的最適酶切溫度水浴中溫育1-3 h （一樣是37C）。（5）酶切后取少量酶切產(chǎn)物與合適的分子量的DNA （如先前的PCR產(chǎn)物）對(duì)比電泳，以 確

11、認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。（6）酶切后的質(zhì)粒能夠回收備用。(7)清理桌面垃圾，清洗實(shí)驗(yàn)儀器。撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。7 .摸索(1)酶切反應(yīng)混合物的體積是否對(duì)幅切成效有阻礙？什么緣故?(2)如何估量DNA用量和胸的用量？(3)在吸取內(nèi)切醉的時(shí)候如何操作才能別免白費(fèi)？實(shí)驗(yàn)三、質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增1 .目的學(xué)會(huì)PCR操作的差不多技術(shù)。2 .原理是將待擴(kuò)增的DNA模板加熱變性，與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡聚核甘酸引物復(fù)性，然后通過(guò)耐 熱的DNA聚合酶延伸。再進(jìn)入下一輪變性一復(fù)性一延伸的循環(huán)，n次循環(huán)后DNA可被擴(kuò) 增11+X) 11倍。其中25nt的引物退火溫度Tm=2 (A+T) +4 (G+C)。3 .器材

12、旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，0.2ml PCR微量管，雙而微量離心管架， PCR儀，臺(tái)式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，水漂，恒溫水浴。4 .試劑3U"UTaqDNA 聚合酶，PCR 緩沖液(10X, MgChfree), 25mMMgCL, dNTP,引物， 模板質(zhì)粒pMD18-T-F,無(wú)菌dd water。5 .實(shí)驗(yàn)預(yù)備dNTP混合液(每種25mM), TAE電泳緩沖液，1000x浜化乙錠儲(chǔ)存液10x加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(火菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(火菌)。合成的引物：Sense primer 5 -GGATCCGCGCAATCTGTTCCTT

13、MGGC-31Antisense primer 5,-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3,目的基因模板質(zhì)粒：差不多克隆在PMD18-T-F載體上的781bpNDV-F基因。待擴(kuò)增的F片段長(zhǎng)度：837bp«6 .操作步驟(1) 在0.2ml PCR微量離心管中配制501反應(yīng)體系。dd water10XPCR buffer (不含 MgCb)25mM MgCb2.5nmiol/L dNTPlOpmoVL Primer 1lOgmol/L primer2模板質(zhì)粒3U/j.d Taq 酶32可5h13h14»d (每種dNTP終濃度0.2mM)2pl (1

14、2.525pmoles)2|.il (12.525pmoles)Ipl (1 X lO pmoles)Igl (3u)總體積50Hl(2)依照廠商的操作手冊(cè)設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序： 94c 5min 94c Imin 60 Imin 72C lmin50s got嗨 29 times 72c lOmin(3) PCR終止后，取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。觀看股上是否有估量的要緊產(chǎn)物帶。(4)清理桌面，撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。7.摸索(1)復(fù)性溫度如何確定？(2)什么緣故要在最后延伸lOmin?(3)是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(或引物二聚體)，如何才能排除？實(shí)驗(yàn)四、DNA電泳鑒定1.目的學(xué)會(huì)常用的DNA瓊脂糖凝膠

15、電泳、。2 .原理DNA雙螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根，在電場(chǎng)中會(huì)向正極方向移動(dòng)。不同長(zhǎng) 度的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開(kāi)。3 .器材電泳儀，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊，250ml三角瓶，微波爐，臺(tái)式離心機(jī)， 旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，分光光度計(jì)，微量移液取樣器，1.5ml離心管，雙面微量離心 管架，試管架等。4 .試劑PMD18-T-F載體，TAE電泳緩沖液，lOOOx澳化乙錠儲(chǔ)存液，電泳級(jí)瓊脂糖粉，10x加樣 緩沖液（或6x加樣緩沖液）,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（ZDNAHindlll: 23130, 9420, 6560, 4360, 2320, 2

16、030, 560, 130bp）。5 .實(shí)驗(yàn)預(yù)備配制TAE電泳緩沖液（50x儲(chǔ)存液，pH約8.5： Tris堿242g, 57.1ml冰乙酸，37.2g NazEDTA.2H2O, dd water 定容至 IL）, lOOOx澳化乙錠儲(chǔ)存液50mg 濾化乙錠 溶于 100mLddwater, 4。（2避光儲(chǔ)存），10x加樣緩沖液（20%Ficoll400, O.lmol/LNa2EDTA pH8.0, 1.0% SDS, 0.25%澳酚藍(lán);6x加樣緩沖液（0.25%溪酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液）：L5ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（火菌）。6 .操作步驟（1）稱(chēng)取0

17、.5g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50MTAE電泳緩沖液（lx）,放入微波爐中燒 開(kāi)（IminJo 50ml正好倒兩塊小膠。（2）注意觀看燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微 波爐中?。?。（3）戴上線(xiàn)手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌而上冷卻致不燙手（約50-60。0。（4）把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后慢慢倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣 相平即可，不要把膠溶液溢到別處。在桌面上靜置10-20分鐘待膠完全凝固。（剩下的膠溶 液封口后留待以后再熔化使用）。（5）在水平電泳槽中加滿(mǎn)IxTAE電泳緩沖液。依照電泳槽的長(zhǎng)度把電泳儀的電壓調(diào)至 170V（10V/cm）

18、,注意正負(fù)電極的位置連接正確。（6）待放完全凝固后（15-20分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出模 具和凝膠放入電泳槽中間的平價(jià)上，凝膠要沒(méi)入電泳液中。凝膠上有樣品孔的一側(cè)要朝向電 泳槽的負(fù)極。(7)剪1片光面紙(或封口膜)，點(diǎn)6m蒸慵水、1光加樣緩沖液,再加入3H質(zhì)粒DNA 溶液制成10川DNA樣品。(8)在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用101的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔 中(假如需要時(shí)，在相鄰的加樣孔中加入1.5-3口1 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物)。加樣時(shí)持移液器的 手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住這只手的手腕，以減少移液器的抖動(dòng)?？吹剿{(lán)色的樣 品吸管尖頭伸進(jìn)加樣孔后(不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部)慢慢將藍(lán)色的樣品壓入加 樣孔中。