下呼吸道感染細菌學檢驗操作規(guī)范

1、下呼吸道感染細下呼吸道感染細菌學檢驗操作規(guī)范菌學檢驗操作規(guī)范 臨床通常將正常人喉以上部位稱之為上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而氣管以下包括氣管、支氣管和肺泡稱下呼吸道，通常無菌。下呼吸道感染包括急性氣管-支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作、支氣管擴張繼發(fā)感染及肺實質(zhì)感染（肺炎、肺膿腫）等。病原體有細菌、病毒、衣原體、支原體、真菌、立克次體和原蟲等。 社區(qū)獲得性肺炎常見的病原菌有肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、軍團菌、肺炎支原體和肺炎衣原體等。醫(yī)院獲得性肺炎常見的病原有銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和假絲酵母

2、菌等。 下呼吸道感染患者可有發(fā)熱、咳嗽和咳痰，痰呈膿性、粘稠或血性，可伴有胸痛、氣急，肺部聞及濕羅音、白細胞總數(shù)及嗜中性粒細胞比例明顯增高，X線檢查提示肺部有炎癥性浸潤或胸腔積液等體癥，嚴重時可導致感染性休克和呼吸衰竭，因此臨床診斷一般不難；細菌學檢驗能明確感染病原及藥敏結(jié)果，有助于疾病治療、流行病學調(diào)查和醫(yī)院感染的監(jiān)測。臨床呼吸道標本中常見的分離細菌見表1。表1呼吸道標本中常見分離菌 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球菌 表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、其他葡萄球菌 微球菌、消化鏈球菌、消化球菌、腸球菌 真桿菌、丙酸桿菌、乳酸桿菌 放線菌、奴卡菌、結(jié)核分枝桿菌 白喉

3、棒狀桿菌、類白喉棒狀桿菌假絲酵母菌 韋榮球菌 腦膜炎奈瑟菌、其他奈瑟菌 卡他莫拉菌 肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌 沙雷菌、變形桿菌 大腸埃希菌及其他腸桿菌科細菌 百日咳鮑特菌、不動桿菌 銅綠假單胞菌及其他假單胞菌屬細菌、嗜肺軍團菌、氣單胞菌、流感嗜血桿菌、副流桿嗜血桿菌、梭桿菌 一、送檢指征 痰液標本是臨床微生物學檢驗最常見的的標本，但不是下呼吸道感染的最佳標本。 1.咳嗽咳嗽咳痰是下呼吸道感染最常見的癥狀，咳嗽的性質(zhì)與痰的性狀如膿或鐵銹樣痰具有鑒別診斷意義。 2.咯血喉以下的呼吸道出血為咯血，包括泡沫血痰、鮮血和痰中帶血等。 一、送檢指征 3.呼吸困難呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。 4.發(fā)熱伴白

4、細胞增高尤其是中性粒細胞或CRP明顯增高。 5.胸部影像學檢查提示有感染可能。二、標本采集與驗收 對可疑烈性呼吸道傳染?。ㄈ鏢ARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者采集檢驗標本時必須注意生物安全防護。（一）標本采集方法 1.自然咳痰法以晨痰為佳，采集標本前應用清水、冷開水漱口或用牙刷清潔口腔和牙齒，有假牙者應取下假牙。盡可能在用抗菌藥物之前采集標本。用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入無菌、清潔、干燥、不滲漏、不吸水的廣口帶蓋的容器中，標本量應1ml?？忍道щy者可用霧化吸入加溫至45C的100g/L NaCl水溶液，使痰液易于排出。對難于自然咳痰患者可用無菌吸痰管抽取氣管深部分泌物。標本應盡快送檢，

5、不能及時送檢的標本，室溫保存2h。（一）標本采集方法 2.支氣管鏡采集法、防污染毛刷采集法、環(huán)甲膜穿刺經(jīng)氣管吸引法、經(jīng)胸壁針穿刺吸引法和支氣管肺泡灌洗法，均由臨床醫(yī)生按相應操作規(guī)程采集，但必須注意采集標本時盡可能避免咽喉部正常菌群的污染。（一）標本采集方法 3.小兒取痰法用彎壓舌板向后壓舌，將拭子伸入咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳痰時，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上送檢。幼兒還可用手指輕叩胸骨柄上方，以誘發(fā)咳痰。 （二）標本驗收與拒收 遇有不合格標本應及時與臨床聯(lián)系，反饋不合格標本拒收的具體理由。 下呼吸道細菌學檢驗標本驗收與拒收見下： 1.呼吸道有大量的正常菌群存在，咽拭子、咳痰、吸出的分泌物厭氧

6、菌培養(yǎng)無意義。（二）標本驗收與拒收 2.申請單填寫應完整無誤。標本標識必須唯一，并與申請單相符，未標采集時間、部位或檢驗要求等拒收。3.痰標本呈水樣或唾液樣，拒收。4.涂片白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)：白細胞10低倍鏡和鱗狀上皮細胞25低倍鏡，表示該標本已污染正常菌群，建議重送標本。（二）標本驗收與拒收 5.標本容器必需符合規(guī)定，溢漏、無蓋者拒收。6.送檢時間超過2h拒收。7.同時同部位或同一天兩份相同檢測的標本，應與申請醫(yī)生協(xié)商處理。 三、實驗室檢查（一）肉眼觀察觀察痰液的顏色、粘度、有無血絲和是否呈膿性，如見有顆粒存在，則應注意可能與放線菌屬及奴卡菌屬感染有關。（二）顯微鏡檢查下呼吸道細菌學檢

7、驗的標本均需涂片革蘭染色進行常規(guī)的白細胞和鱗狀上皮細胞顯微鏡下計數(shù)和細菌學檢查，其目的是判別送檢的標本是否合適做細菌培養(yǎng)，并初步判定有否病原菌、病原菌的數(shù)量及其類別，有助于初步報告、選擇培養(yǎng)基和對培養(yǎng)結(jié)果的綜合分析。推薦判別標本合格的標準見表2。表2 下呼吸道細菌學檢驗標本涂片顯微鏡白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)判斷標準分類 細胞數(shù)低倍鏡 結(jié)果判斷 白細胞 鱗狀上皮細胞 A25 25 1025 尚合格可用于細菌培養(yǎng) C25 不合格，重送標本 近年來推薦判別標本合格的簡單方法是痰標本涂片鏡檢10個白細胞低倍鏡，就可判斷是基本合格并可用于細菌培養(yǎng)的標本，尤其是白細胞減少的患者。油鏡下觀察細菌形態(tài)、排列和

8、染色特性，可初步推定菌屬（或種），涂片中所見細菌的量及吞噬細胞內(nèi)是否有細菌等，如發(fā)現(xiàn)酵母樣菌孢子、菌絲或放線菌、奴卡菌等，應予相應報告和繼續(xù)檢查。（三）分離培養(yǎng)痰標本培養(yǎng)前處理不含或含粘液很少的合格標本，可直接接種，遇有含大量粘液的標本，應加入等量的液化劑（如pH7.6的10g/L胰酶溶液等），放置35C待充分液化再行接種。也可加液化劑后用旋轉(zhuǎn)混勻器攪拌混勻，3000r/min離心10min，棄去上清液，取沉淀物接種。一般細菌培養(yǎng)(1)一般細菌培養(yǎng)應同時劃區(qū)接種：1)血平板適用于分離肺炎鏈球菌和其他細菌。2)加抗生素的巧克力平板適用于分離嗜血桿菌。3)麥康凱中國藍平板適用于分離革蘭陰性桿菌。

9、(2)分離培養(yǎng)血平板和巧克力平板需置5%CO2環(huán)境，麥康凱平板中國藍平板，35C需氧孵育。(3)挑取可疑菌落進行細菌鑒定和藥敏試驗，痰及下呼吸道分泌物標本易受到上呼吸道正常菌群的污染，臨床微生物實驗室通常可從送檢的呼吸道標本中分離出多種細菌，但分離的細菌是否能真正代表下呼吸道感染的病原菌，這對臨床診斷和治療感染性疾病至關重要。實驗室人員在檢驗過程中應重視判斷所分離的細菌是污染的上呼吸道正常菌群還是引起下呼吸道感染的病原菌。在實際工作中，有時也由于細菌生長速度不一，如肺炎鏈球菌可能被生長速度快的細菌（包括正常菌群）菌落掩蓋，不仔細觀察就會漏檢。當在同一培養(yǎng)基上分離出多種病原菌時，應主動與臨床醫(yī)生

10、聯(lián)系，結(jié)合患者的臨床癥狀、痰涂片染色鏡檢及近期細菌培養(yǎng)結(jié)果（如近期同一病人多次分離培養(yǎng)出同一種菌）等綜合判斷所分離的多種細菌中哪一種菌可能為優(yōu)勢病原菌。當分離的優(yōu)勢菌與涂片染色鏡檢結(jié)果相符時，優(yōu)勢菌必需進行藥敏試驗。若分離培養(yǎng)結(jié)果與涂片染色鏡檢結(jié)果不相符時，或少量生長優(yōu)勢可疑病原菌時，也需做藥敏試驗，但在報告中提示，此結(jié)果請結(jié)合臨床和涂片所見進行分析。痰及下呼吸道分泌物標本檢驗流程見下圖。痰及下呼吸道標本細菌學檢驗操作流程 痰及下呼吸道分泌物標本 肉眼觀察及涂片革蘭染色白細胞、鱗狀上皮細胞和細菌學顯微鏡檢查 合格標本 培養(yǎng)前處理 血平板 （5%CO2環(huán)境） 巧克力平板 （5%CO2環(huán)境） 麥康

11、凱平板 （需氧環(huán)境） 初步報告 不合格標本 拒收及建議重新采集合格標本 菌落觀察，涂片染色鏡檢 結(jié)合涂片白細胞、鱗狀上皮細胞計數(shù)和細菌學鏡檢結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果綜合分析菌種鑒定 藥敏試驗 結(jié)合涂片白細胞、鱗狀上皮細胞計數(shù)和細菌學鏡檢與培養(yǎng)鑒定、藥敏結(jié)果綜合分析 結(jié)果報告（最終報告） 四、結(jié)果報告由于檢驗結(jié)果報告的時效性，下呼吸道標本細菌學檢驗結(jié)果分為初步報告和最終報告。1.初步報告應包括標本涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢的描述性報告（發(fā)現(xiàn)有診斷價值時應及時向臨床口頭報告，并作相關記錄）。1)涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢的描述性報告細菌學鏡檢的描述性報告：如鏡檢見

12、到排列成葡萄狀的革蘭陽性球菌，可報告“找到革蘭陽性球菌，形似葡萄球菌”；如見到瓜子仁形成矛頭狀端相背，成雙排列，具有明顯莢膜的革蘭陽性球菌時，可報告“找到革蘭陽性球菌，形似肺炎鏈球菌”；如見到不易識別的細菌時則報告“找到革蘭性形細菌”；如發(fā)現(xiàn)其他有意義病原微生物存在時，應主動描述性報告觀察結(jié)果，并與臨床聯(lián)系和追蹤進一步檢查。2) 白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)的描述性報告：包括白細胞和鱗狀上皮細胞數(shù)低倍、細胞內(nèi)是否含有細菌和胞內(nèi)細菌染色及形態(tài)學特點。2.最終結(jié)果報告應包括送檢標本肉眼觀察的結(jié)果、涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢的描述性報告、分離致病菌的鑒定結(jié)果、藥敏試驗結(jié)果。1)痰標本涂片革蘭染色后白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)、細菌學鏡檢未發(fā)現(xiàn)有臨床診斷意義結(jié)果（可不用初步報告），細菌分離培養(yǎng)為正常菌群時，最終檢驗結(jié)果應報告“正常菌群生長”。若無菌生長應報告“經(jīng)48h培養(yǎng)無細菌生長”。有意義的培養(yǎng)基（巧克力平板、血平板），再置2天仍無可疑病原菌生長時可將其棄之；但對偶然分離的“優(yōu)勢可疑病原菌”，還需做藥敏試驗，并及時與臨床聯(lián)系，最終檢驗報告應包括標本肉眼觀察結(jié)果、涂片革蘭染色白細胞和鱗狀上皮細胞計數(shù)及細菌學鏡檢的描述性報告、細菌鑒定的規(guī)范細菌名稱和藥敏試驗結(jié)果。但應提示所報告的結(jié)果請結(jié)合臨床進