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文檔簡介
1、基因工程的下游技術(shù)基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 重組蛋白的表達(dá)重組蛋白的表達(dá)表達(dá)體系:表達(dá)體系: 表達(dá)載體表達(dá)載體 原核原核 受體細(xì)胞受體細(xì)胞 真核真核選擇表達(dá)載體常用的關(guān)鍵元件:選擇表達(dá)載體常用的關(guān)鍵元件:啟動子和調(diào)理序列表達(dá)強(qiáng)弱、細(xì)胞或啟動子和調(diào)理序列表達(dá)強(qiáng)弱、細(xì)胞或組織特異性、表達(dá)調(diào)理等,如本實驗的組織特異性、表達(dá)調(diào)理等,如本實驗的乳糖支配子。乳糖支配子。交融基因純化、標(biāo)簽,或加強(qiáng)蛋白可交融基因純化、標(biāo)簽,或加強(qiáng)蛋白可溶性等。如多聚溶性等。如多聚His標(biāo)簽標(biāo)簽6His,便于,便于鎳柱親和層析純化。鎳柱親和層析純化。GST交融蛋白用交融蛋白用GS
2、T柱親和層析柱親和層析分泌信號分泌信號挑選標(biāo)志挑選標(biāo)志其它其它6His 重組蛋白的純化重組蛋白的純化親和層析親和層析離子交換層析離子交換層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析 本單元實驗流程:本單元實驗流程:細(xì)菌細(xì)菌pEF-GFPuv 親和層析親和層析IPTG誘導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白細(xì)菌總蛋白重組蛋白交融蛋白重組蛋白交融蛋白乳糖支配子的特性乳糖支配子的特性SDS-PAGE初步分析初步分析實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膶嶒炘韺嶒炘碣Y料與試劑資料與試劑實驗儀器實驗儀器操作步驟操作步驟本卷須知本卷須知實驗安排實驗安排思索與討論思索與討論實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康牧私夂驼莆樟私夂驼莆誌PTG誘導(dǎo)表達(dá)的原理。誘導(dǎo)表達(dá)的原理。了解降解物阻遏
3、的景象及其機(jī)理。了解降解物阻遏的景象及其機(jī)理。實驗原理實驗原理支配子是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位。通常支配子是基因表達(dá)的協(xié)調(diào)單位。通常由由2個以上功能相關(guān)的構(gòu)造基因以及個以上功能相關(guān)的構(gòu)造基因以及一些調(diào)理序列如啟動子序列、支配一些調(diào)理序列如啟動子序列、支配序列等組成。序列等組成。乳糖支配子由三個構(gòu)造基因乳糖支配子由三個構(gòu)造基因Z、Y、A和支配序列、啟動子、和支配序列、啟動子、CAP結(jié)合位結(jié)合位點等調(diào)理序列組成。點等調(diào)理序列組成。 乳糖支配子的誘導(dǎo)表達(dá)乳糖支配子的誘導(dǎo)表達(dá)當(dāng)沒有乳糖存在時,調(diào)理基因當(dāng)沒有乳糖存在時,調(diào)理基因lacI表達(dá),轉(zhuǎn)錄表達(dá),轉(zhuǎn)錄的的mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與支配翻譯成阻遏蛋
4、白。阻遏蛋白與支配序列序列l(wèi)acO結(jié)合,妨礙了結(jié)合在旁邊啟動子的結(jié)合,妨礙了結(jié)合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前挪動,使構(gòu)造基因不能轉(zhuǎn)錄,聚合酶向前挪動,使構(gòu)造基因不能轉(zhuǎn)錄,也就不能翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說,當(dāng)沒有也就不能翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說,當(dāng)沒有乳糖存在時,乳糖支配子處于妨礙形狀。乳糖存在時,乳糖支配子處于妨礙形狀。 乳糖支配子的誘導(dǎo)表達(dá)續(xù)乳糖支配子的誘導(dǎo)表達(dá)續(xù)當(dāng)有乳糖存在時,乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖,異乳當(dāng)有乳糖存在時,乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖,異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改動,而不能結(jié)合到支配序列上,的構(gòu)象發(fā)生改動,而不能結(jié)合到支配序列上,R
5、NA聚合酶可以從啟動子向聚合酶可以從啟動子向3端挪動,于是,端挪動,于是,構(gòu)造基因可以轉(zhuǎn)錄出構(gòu)造基因可以轉(zhuǎn)錄出mRNA,然后翻譯出蛋,然后翻譯出蛋白質(zhì)。也就是說,當(dāng)有乳糖存在時,乳糖支白質(zhì)。也就是說,當(dāng)有乳糖存在時,乳糖支配子被誘導(dǎo)。配子被誘導(dǎo)。 乳糖支配子的誘導(dǎo)物是異乳糖。乳糖支配子的誘導(dǎo)物是異乳糖。IPTG是異是異乳糖的構(gòu)造類似物。由于乳糖的構(gòu)造類似物。由于IPTG不會被分解,不會被分解,它的誘導(dǎo)作用是耐久的。它的誘導(dǎo)作用是耐久的。 乳糖支配子的誘導(dǎo)表達(dá)續(xù)乳糖支配子的誘導(dǎo)表達(dá)續(xù)本實驗所運(yùn)用的表達(dá)載體上含有乳糖支配子本實驗所運(yùn)用的表達(dá)載體上含有乳糖支配子的調(diào)理序列,目的基由于綠色熒光蛋白基因
6、。的調(diào)理序列,目的基由于綠色熒光蛋白基因。在在IPTG的誘導(dǎo)下,目的基因表達(dá)可加強(qiáng)的誘導(dǎo)下,目的基因表達(dá)可加強(qiáng)105倍。然而,誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)常遭到溫度和誘導(dǎo)物倍。然而,誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)常遭到溫度和誘導(dǎo)物的影響。的影響。乳糖支配子的降解物阻遏乳糖支配子的降解物阻遏當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基中生長當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基中生長時,通常優(yōu)先利用葡萄糖,而不利用乳糖。時,通常優(yōu)先利用葡萄糖,而不利用乳糖。只需當(dāng)葡萄糖耗盡后,細(xì)菌才干充分利用乳只需當(dāng)葡萄糖耗盡后,細(xì)菌才干充分利用乳糖,這種景象稱葡萄糖效應(yīng),其本質(zhì)是由葡糖,這種景象稱葡萄糖效應(yīng),其本質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用,所以又稱降解萄糖降
7、解物引起的阻遏作用,所以又稱降解物阻遏物阻遏catabolic repression。乳糖支配子的降解物阻遏續(xù)乳糖支配子的降解物阻遏續(xù)降解物阻遏的機(jī)理:代謝物基因激活蛋白降解物阻遏的機(jī)理:代謝物基因激活蛋白Catabolite gene Activation Protein,CAP,又稱,又稱cAMP受體蛋白受體蛋白cAMP Receptor Protein,CRP屬屬于激活蛋白的一種,對乳糖支配子進(jìn)展正調(diào)于激活蛋白的一種,對乳糖支配子進(jìn)展正調(diào)理。理。 CAP分子內(nèi)分別有分子內(nèi)分別有DNA結(jié)合區(qū)和結(jié)合區(qū)和cAMP結(jié)合區(qū)。當(dāng)結(jié)合區(qū)。當(dāng)CAP與與cAMP結(jié)合后,就可結(jié)合結(jié)合后,就可結(jié)合到到CAP結(jié)
8、合位點上,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。結(jié)合位點上,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性,并活化磷酸二酯酶的活性,從而降低性,并活化磷酸二酯酶的活性,從而降低cAMP的濃度,抑制轉(zhuǎn)錄。的濃度,抑制轉(zhuǎn)錄。 阻遏蛋白負(fù)調(diào)理與阻遏蛋白負(fù)調(diào)理與CAP正調(diào)理的協(xié)調(diào)正調(diào)理的協(xié)調(diào) 當(dāng)阻遏蛋白封鎖轉(zhuǎn)錄時,當(dāng)阻遏蛋白封鎖轉(zhuǎn)錄時,CAP對該系統(tǒng)不能對該系統(tǒng)不能發(fā)揚(yáng)作用;而沒有發(fā)揚(yáng)作用;而沒有CAP存在時,即使沒有阻存在時,即使沒有阻遏蛋白與支配序列結(jié)合,支配子仍無轉(zhuǎn)錄活遏蛋白與支配序列結(jié)合,支配子仍無轉(zhuǎn)錄活性。只需在性。只需在CAP存在且沒有阻遏蛋白與支配存在且沒有阻遏蛋白與支配序列結(jié)合
9、時,或者說只需高乳糖低葡萄糖時,序列結(jié)合時,或者說只需高乳糖低葡萄糖時,支配子發(fā)揚(yáng)最大轉(zhuǎn)錄活性。支配子發(fā)揚(yáng)最大轉(zhuǎn)錄活性。 這種協(xié)調(diào)與細(xì)菌對碳源的優(yōu)先利用相一致。這種協(xié)調(diào)與細(xì)菌對碳源的優(yōu)先利用相一致。The structure of lac operon調(diào)理序列調(diào)理序列構(gòu)造基因構(gòu)造基因Repressor and negative regulation異乳糖異乳糖異丙基硫代半乳糖苷異丙基硫代半乳糖苷異乳糖異乳糖CAP and positive regulation 低乳糖時低乳糖時 高乳糖時高乳糖時在協(xié)調(diào)調(diào)理下,在協(xié)調(diào)調(diào)理下,lac operon的強(qiáng)誘導(dǎo)作用發(fā)生在高乳的強(qiáng)誘導(dǎo)作用發(fā)生在高乳糖、低葡
10、萄糖的形狀。糖、低葡萄糖的形狀。資料與試劑資料與試劑資料資料 含含pUC18質(zhì)粒工程菌及含質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)粒工程菌。質(zhì)粒工程菌。試劑試劑LB 液體培育基液體培育基 : 蛋白胨蛋白胨tryptone10g、酵母粉酵母粉yeast extract5g、NaCl 10g,加,加800mL雙蒸水溶解,雙蒸水溶解,用用10M NaOH調(diào)調(diào)pH至至7.2-7.5,定容至定容至1000mL。 分裝,高壓滅菌,分裝,高壓滅菌,4保管。保管。氨芐青霉素溶液:氨芐青霉素溶液: 無菌雙蒸水配成無菌雙蒸水配成100mg/mL,分裝,分裝,-20保管,運(yùn)用終濃度為保管,運(yùn)用終濃度為50g/mL或或100g/
11、mL。IPTG溶液:溶液: 將將238.3mg IPTG溶解于溶解于10mL雙蒸水,雙蒸水,0.22m細(xì)菌濾器過濾除菌,分裝,細(xì)菌濾器過濾除菌,分裝,-20保保管備用,儲存濃度為管備用,儲存濃度為100 mM。20%葡萄糖溶液:葡萄糖溶液: 20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水,定容至葡萄糖溶解于適量雙蒸水,定容至100mL,121,15min 滅菌,滅菌,4保管。保管。實驗儀器實驗儀器 超凈任務(wù)臺、超凈任務(wù)臺、 恒溫?fù)u床、離心恒溫?fù)u床、離心機(jī)等。機(jī)等。操作步驟操作步驟挑取含挑取含pUC18質(zhì)粒工程菌及含質(zhì)粒工程菌及含pGFPuv質(zhì)質(zhì)粒工程菌單菌落,分別接種于含氨芐青霉粒工程菌單菌落,分別接種于含氨芐
12、青霉終濃度為終濃度為100g/mL,以下同,以下同)的的5mL的的LB培育基中,于培育基中,于37、250rpm過夜培育過夜培育12h-14h至對數(shù)生長期。至對數(shù)生長期。取取3支已滅菌的大試管,分別參與支已滅菌的大試管,分別參與5mL含含有氨芐青霉素的有氨芐青霉素的LB培育液,編號為培育液,編號為1#,2#,3#,另取一個,另取一個250mL的滅菌三角瓶,的滅菌三角瓶,編號為編號為6#,參與,參與50mL含氨芐青霉素的含氨芐青霉素的LB培育液。培育液。 1#:接:接50L空載工程菌含空載工程菌含pUC18過夜培過夜培育物,育物,25-28培育培育10 h-12h; 2#:接:接50L重組菌含重
13、組菌含pGFPuv過夜培過夜培育物,育物,25-28培育培育10 h-12h; 3#:接:接50L重組菌含重組菌含pGFPuv 過夜培過夜培育物,育物,37培育至培育至O.D600約為約為0.5約約3h-4h),然后參與然后參與20%葡萄糖葡萄糖50L至終濃度為至終濃度為0.2%,及及100mM IPTG 5L至終濃度為至終濃度為0.1mM,25-28培育培育8h-10h或過夜;或過夜; 6#:接:接500L重組菌含重組菌含pGFPuv過夜過夜培育物,培育物,37培育至培育至O.D600約為約為0.5約約3h-4h),然后只參與,然后只參與100mM IPTG 50L至終濃至終濃度為度為0.1
14、 mM,25-28培育培育8h-10h或過夜。或過夜。4. 搜集菌體。分別將搜集菌體。分別將1#-3#全部培育物搜集到全部培育物搜集到三個三個7mL離心管中,編上相應(yīng)編號,離心棄上離心管中,編上相應(yīng)編號,離心棄上清;三角瓶培育的清;三角瓶培育的50mL菌液混勻后取菌液混勻后取5mL于于7mL離心管中編號為離心管中編號為4#,離心,上清搜集,離心,上清搜集到另一個指管,編號為到另一個指管,編號為5#,其他的培育液用,其他的培育液用 50mL離心管于離心管于5000rpm,4,離心,離心10min,棄上清,菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破棄上清,菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破碎細(xì)胞或保管于碎細(xì)胞
15、或保管于20備用見實驗十二。備用見實驗十二。 5. 于紫外燈下察看于紫外燈下察看1# -5#管搜集的菌體或上清管搜集的菌體或上清液,察看哪支管有熒光,記錄察看到的景象。液,察看哪支管有熒光,記錄察看到的景象。留意:把留意:把1#和和2#管置管置4保管。分別標(biāo)保管。分別標(biāo)Sample1和和Sample2。 1236pUC18pGFPuv挑取單菌落,接種于挑取單菌落,接種于5mLLBA培育基中。培育基中。37過夜培育。過夜培育。按按1:100接種接種對照對照IPTG+GlcIPTG12361234525 -28培育過夜培育過夜5000rpm離離心,收菌體心,收菌體取取5mL離心離心其他離心收其他離
16、心收菌體,提取菌體,提取蛋白蛋白本卷須知本卷須知本實驗的目的是比較該重組本實驗的目的是比較該重組DNA在在大腸桿菌中表達(dá)時受大腸桿菌中表達(dá)時受IPTG和葡萄和葡萄糖存在的影響。在轉(zhuǎn)管培育及收菌糖存在的影響。在轉(zhuǎn)管培育及收菌時要留意各管編號要相應(yīng)對好,不時要留意各管編號要相應(yīng)對好,不能混亂。能混亂。 1#、2#管不加管不加IPTG和葡萄和葡萄糖。糖。3#管除加管除加IPTG外還參與葡萄外還參與葡萄糖濃度要大于糖濃度要大于0.2%以上。以上。 6#瓶僅加瓶僅加IPTG 。不同的重組不同的重組DNA在不同的宿主菌中蛋白的在不同的宿主菌中蛋白的表達(dá)量往往遭到表達(dá)量往往遭到IPTG濃度和培育溫度的影濃度
17、和培育溫度的影響。在科研中普通都采用不同溫度或不同響。在科研中普通都采用不同溫度或不同濃度的濃度的IPTG來誘導(dǎo),以獲得最大的蛋白表來誘導(dǎo),以獲得最大的蛋白表達(dá)量。達(dá)量。本實驗所表達(dá)的綠色熒光蛋白基因,其產(chǎn)本實驗所表達(dá)的綠色熒光蛋白基因,其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光。離心后搜物在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光。離心后搜集的菌體在紫外線的照射下可見黃綠色熒集的菌體在紫外線的照射下可見黃綠色熒光,所以把光,所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌體放在沉淀菌體放在紫外燈下察看其能否有熒光以及熒光的強(qiáng)紫外燈下察看其能否有熒光以及熒光的強(qiáng)弱,就可判別其能否有表達(dá)及其所表達(dá)的弱,就可判別其能否有表達(dá)及其所表達(dá)的強(qiáng)度
18、。強(qiáng)度。實驗安排實驗安排 第一天:第一天: 上午配試劑,滅菌;上午配試劑,滅菌; 下午開場接種,約下午開場接種,約3 h-4h后開場誘導(dǎo)。步驟后開場誘導(dǎo)。步驟2、3 第二天:第二天: 收菌、紫外察看結(jié)果和拍照;收菌、紫外察看結(jié)果和拍照; 破碎細(xì)菌,分別上清,待過破碎細(xì)菌,分別上清,待過柱。柱。思索與討論思索與討論對紫外燈下察看到的結(jié)果作出解釋。對紫外燈下察看到的結(jié)果作出解釋。為什么誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌要在其為什么誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌要在其OD600濃度約為濃度約為0.5時參與時參與IPTG?大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)常受哪些要素大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)常受哪些要素的影響?的影響?實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膶嶒炘韺嶒炘?/p>
19、資料與試劑資料與試劑實驗儀器實驗儀器操作步驟操作步驟本卷須知本卷須知實驗安排實驗安排思索與討論思索與討論一實驗?zāi)康囊粚嶒災(zāi)康膶W(xué)習(xí)親和層析的原理。學(xué)習(xí)親和層析的原理。掌握親和層析法分別蛋白質(zhì)的技術(shù)與操掌握親和層析法分別蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作。作。實驗原理實驗原理以普通凝膠作載體,銜接上金屬離子制以普通凝膠作載體,銜接上金屬離子制成螯合吸附劑,用于分別純化蛋白質(zhì),成螯合吸附劑,用于分別純化蛋白質(zhì),這種方法稱為金屬螯合親和層析。這種方法稱為金屬螯合親和層析。蛋白質(zhì)對金屬離子具有親和力是這種方蛋白質(zhì)對金屬離子具有親和力是這種方法的實際根據(jù)。知蛋白質(zhì)中的組氨酸和法的實際根據(jù)。知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基
20、在接近中性的水溶液中能半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子構(gòu)成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物,與鎳或銅離子構(gòu)成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物,因此,銜接上鎳或銅離子的載體凝膠可因此,銜接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。過渡金屬元素鎳在較低過渡金屬元素鎳在較低pH范圍時范圍時pH 6-8,有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。在堿性和蛋白質(zhì)。在堿性pH時吸附更有效,但選時吸附更有效,但選擇性降低。擇性降低。金屬螯合親和層析在很大程度上,由被吸附的金屬螯合親和層析在很大程度上,由被吸附的肽和蛋白質(zhì)
21、分子外表咪唑基和巰基的稠密肽和蛋白質(zhì)分子外表咪唑基和巰基的稠密程度所支配,吲哚基能夠也很重要。程度所支配,吲哚基能夠也很重要。用用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標(biāo)簽,這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層標(biāo)簽,這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)展分別,且操作簡單,快速,純化析法進(jìn)展分別,且操作簡單,快速,純化效率高。效率高。資料與試劑資料與試劑資料資料 含含pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組質(zhì)粒工程菌及含重組pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解蛋白。胞裂解蛋白。試劑試劑0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液溶液
22、50mL2mol/L NaCl 溶液溶液 50mL1mol/L NaOH溶液溶液 50mL0.2mol/L NiSO4溶液溶液 30mL起始緩沖液:起始緩沖液:50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mLChelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL大腸桿菌細(xì)胞裂解蛋白樣品大腸桿菌細(xì)胞裂解蛋白樣品 10-20mL洗滌液:洗滌液:50mmol/L咪唑;咪唑;50mmol/L Tris-HCl; 0.5mol/L NaCl,pH 7.0洗脫液:洗脫液:300mmol/L咪唑;咪唑;50mmol/L Tris-HCl;0.5m
23、ol/L NaCl,pH7.0 實驗儀器實驗儀器 1.5cm X 50cm層析柱、層析柱、自動分部搜集器、紫外分光光度自動分部搜集器、紫外分光光度計、紫外檢測儀及記錄儀等。計、紫外檢測儀及記錄儀等。操作步驟操作步驟樣品的制備樣品的制備: 細(xì)胞的培育及熒光蛋白表達(dá)見細(xì)胞的培育及熒光蛋白表達(dá)見實驗十,細(xì)胞的破碎及蛋白的搜集如下:實驗十,細(xì)胞的破碎及蛋白的搜集如下: 搜集在搜集在25培育的細(xì)胞培育液,培育的細(xì)胞培育液,5000r/min,離心,離心10min,去上清液,去上清液,菌體用起始緩沖液洗滌一次,離心搜集菌菌體用起始緩沖液洗滌一次,離心搜集菌體,用三分之一細(xì)胞培育液體積體,用三分之一細(xì)胞培育
24、液體積15mL的起始緩沖液充分懸浮,冰浴的起始緩沖液充分懸浮,冰浴下進(jìn)展超聲波處置,功率為下進(jìn)展超聲波處置,功率為400W,任務(wù),任務(wù)4秒,間隙秒,間隙4 秒,為一次,秒,為一次,99次為一周期。次為一周期。共處置六周期。然后共處置六周期。然后8000r/min,離心離心30min,取上清液。放冰箱備用。,取上清液。放冰箱備用。 親和層析柱的安裝親和層析柱的安裝 把層析柱固定在鐵支架上,柱下端把層析柱固定在鐵支架上,柱下端出口封鎖。參與少量的無離子水,排去下出口封鎖。參與少量的無離子水,排去下端的空氣泡。取出端的空氣泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝乙醇浸泡的螯合凝膠膠4mL到燒杯中,參與少量的無
25、離子水制到燒杯中,參與少量的無離子水制成糊狀,沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀成糊狀,沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進(jìn)柱內(nèi),翻開下端的排水口,讓親凝膠倒進(jìn)柱內(nèi),翻開下端的排水口,讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。親和層析劑為和凝膠劑隨水流自然沉下。親和層析劑為4-5mL。親和凝膠的再生處置:親和凝膠的再生處置:用用10 倍柱體積的再生溶液倍柱體積的再生溶液0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl過柱,流速過柱,流速3mL/min。1drops/2s!用用5倍柱體積的倍柱體積的2 mol/L NaCl 溶液洗親和層析溶液洗親和層析柱除去多余的柱除去多余的EDTA。流速。流速3mL/m
26、in。用用5倍柱體積的倍柱體積的1 mol/L NaOH溶液洗滌層析溶液洗滌層析柱,流速柱,流速2mL/min。用用10倍柱體積的無離子水洗至倍柱體積的無離子水洗至pH8-9,流速,流速3mL/min。用用2倍柱體積的倍柱體積的0.2mol/L的硫酸鎳溶液過層析的硫酸鎳溶液過層析柱,使凝膠金屬鎳離子結(jié)合柱,使凝膠金屬鎳離子結(jié)合, 流速流速2mL/min。過完后放置過完后放置5 分鐘。分鐘。用用10倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多余的鎳離子。流速余的鎳離子。流速3mL/min。用用5 倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱,倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱,備用。備
27、用。 上樣:上樣: 先從先從15mL裂解上清液中取出裂解上清液中取出50L預(yù)備用于預(yù)備用于電泳,作為親和層析分別前上清液中的總蛋區(qū)電泳,作為親和層析分別前上清液中的總蛋區(qū)帶對照圖譜帶對照圖譜Sample3。然后以每分鐘。然后以每分鐘1mL的的流速上層析柱,分部搜集流出液,每管流速上層析柱,分部搜集流出液,每管3mL,測得的測得的OD280值曲線為穿流峰,取最高的一值曲線為穿流峰,取最高的一管樣品液用作電泳,標(biāo)管樣品液用作電泳,標(biāo)Sample4。再用。再用10mL起始緩沖液過層析柱,操作同前。起始緩沖液過層析柱,操作同前。 洗滌:洗滌: 用含用含50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液咪唑的洗滌緩沖液
28、25mL洗脫,洗脫,分部搜集洗脫液,每管分部搜集洗脫液,每管5mL,取中間管樣品電,取中間管樣品電泳泳Sample5 。 洗脫:洗脫: 用含用含300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液咪唑的洗脫緩沖液10mL洗脫,洗脫,用用Ep管分部搜集洗脫液。每管收管分部搜集洗脫液。每管收0.5mL。測。測得的得的OD280值曲線峰為目的蛋白峰值曲線峰為目的蛋白峰GFP,標(biāo),標(biāo)Sample6 。 12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測:聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測:進(jìn)展進(jìn)展12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和層析分別純化的結(jié)果。層析分別純化的結(jié)果。Sample1-6,外加,外加Marke
29、r見實驗十一。見實驗十一。 本卷須知本卷須知不論是裝柱還是上樣、洗脫,在整個操不論是裝柱還是上樣、洗脫,在整個操作過程中,水或溶液面都不能低于凝膠作過程中,水或溶液面都不能低于凝膠柱平面。否那么,凝膠柱會產(chǎn)生氣泡,柱平面。否那么,凝膠柱會產(chǎn)生氣泡,就會影響層析效果。就會影響層析效果。樣品上柱和洗脫過程,其流速都要慢,樣品上柱和洗脫過程,其流速都要慢,分別效果才好。分別效果才好。親和層析劑可回收,經(jīng)再生可循環(huán)運(yùn)用。親和層析劑可回收,經(jīng)再生可循環(huán)運(yùn)用。該親和層析劑用該親和層析劑用20%乙醇浸泡于冰箱保乙醇浸泡于冰箱保管。管。親和層析柱在再生處置、上樣、洗脫過親和層析柱在再生處置、上樣、洗脫過程中其
30、顏色都有明顯變化白、藍(lán)、程中其顏色都有明顯變化白、藍(lán)、綠,只需細(xì)心操作,樣品能否被吸附綠,只需細(xì)心操作,樣品能否被吸附上去或被洗脫下來?都能察看到從而作上去或被洗脫下來?都能察看到從而作出判別。出判別。實驗安排實驗安排 先用母液配制其它未配制溶先用母液配制其它未配制溶液,再生鎳柱;然后,過柱純化液,再生鎳柱;然后,過柱純化重組蛋白。重組蛋白。 思索與討論思索與討論解釋解釋IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的熒光蛋白經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的熒光蛋白經(jīng)12 SDS-PAGE電泳結(jié)果圖譜。電泳結(jié)果圖譜。鎳柱在再生處置、上樣、洗脫過程鎳柱在再生處置、上樣、洗脫過程中其顏色有何變化?為什么?中其顏色有何變化?為什么?要到達(dá)好的分別效
31、果要留意哪些問要到達(dá)好的分別效果要留意哪些問題?題?實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膶嶒炘韺嶒炘碣Y料與試劑資料與試劑實驗儀器實驗儀器操作步驟操作步驟本卷須知本卷須知實驗安排實驗安排思索與討論思索與討論一一.實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?了解了解SDS-PAGE靈敏度高,分辯率強(qiáng)的原靈敏度高,分辯率強(qiáng)的原理。理。用此法分析不同條件下培育的菌其熒光蛋用此法分析不同條件下培育的菌其熒光蛋白表達(dá)情況。白表達(dá)情況。 實驗原理實驗原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯 酰 胺 凝 膠 是 由 丙 烯 酰 胺 單 體烯 酰 胺
32、 凝 膠 是 由 丙 烯 酰 胺 單 體acrylamide,簡稱簡稱ACR和交聯(lián)劑甲和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺叉雙丙烯酰胺N,N-methylene bisacrylsmide 簡稱簡稱BIS在催化劑的作在催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀構(gòu)造的凝用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠,經(jīng)過改動單體濃度與交聯(lián)劑的比例膠,經(jīng)過改動單體濃度與交聯(lián)劑的比例可以得到不同孔徑的凝膠??梢缘玫讲煌讖降哪z。 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種:聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種:1化學(xué)聚合:催化劑采用過硫酸銨,加化學(xué)聚合:催化劑采用過硫酸銨,加速劑為速劑為N、N、N、N四甲基乙二胺簡四甲基乙二胺簡稱稱TE
33、MED。通??刂七@兩種溶液的用量。通常控制這兩種溶液的用量使聚合在使聚合在1h內(nèi)完成。內(nèi)完成。2光聚合:通常用光聚合:通常用核黃素為催化劑,經(jīng)過控制光照時間和強(qiáng)度核黃素為催化劑,經(jīng)過控制光照時間和強(qiáng)度來控制聚合時間也可加速反響。本實驗采用來控制聚合時間也可加速反響。本實驗采用化學(xué)聚合。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類:化學(xué)聚合。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類:第一類為延續(xù)的凝膠僅有分別膠電泳;第一類為延續(xù)的凝膠僅有分別膠電泳;第二類為不延續(xù)的凝膠濃縮膠和分別膠第二類為不延續(xù)的凝膠濃縮膠和分別膠電泳。電泳。通常聚丙烯酰胺凝膠不延續(xù)電泳有三種通常聚丙烯酰胺凝膠不延續(xù)電泳有三種效應(yīng):電荷效應(yīng);電泳物所帶電
34、荷的差效應(yīng):電荷效應(yīng);電泳物所帶電荷的差別性。別性。 凝膠的分子篩效應(yīng)。凝膠的網(wǎng)凝膠的分子篩效應(yīng)。凝膠的網(wǎng)狀構(gòu)造及電泳物的大小外形不同所致濃狀構(gòu)造及電泳物的大小外形不同所致濃縮效應(yīng),凝膠濃度的不延續(xù)性、緩沖液離縮效應(yīng),凝膠濃度的不延續(xù)性、緩沖液離子成分的不延續(xù)性、電位梯度的不延續(xù)性以子成分的不延續(xù)性、電位梯度的不延續(xù)性以及及pH的不延續(xù)性所致。因此,樣品分別效的不延續(xù)性所致。因此,樣品分別效果好,分辨率高。果好,分辨率高。SDS-PAGE,是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn),是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS十二烷基磺酸鈉。十二烷基磺酸鈉。SDS破壞蛋白質(zhì)的破壞蛋白質(zhì)的二級和三級構(gòu)造;強(qiáng)復(fù)原劑使半胱
35、氨酸之間二級和三級構(gòu)造;強(qiáng)復(fù)原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂,因此,蛋白質(zhì)在一定濃度的的二硫鍵斷裂,因此,蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)復(fù)原劑的含有強(qiáng)復(fù)原劑的SDS溶液中,與溶液中,與SDS分子按比分子按比例結(jié)合,構(gòu)成帶負(fù)電荷的例結(jié)合,構(gòu)成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS,降低或消除,降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差別。而了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差別。而由于由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按大小成比例的,與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按大小成比例的,在進(jìn)展電泳時,蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決在進(jìn)展電泳時,蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)
36、分子量在于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到到200KD之間之間時,蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性時,蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系,符合下式:關(guān)系,符合下式:logMW=K-bX,式中:,式中:MW為分子量,為分子量,X為遷移率,為遷移率,k、b均為常數(shù)。均為常數(shù)。試劑試劑30%的凝膠貯備液的凝膠貯備液: Acr 29g + Bis 1g溶于溶于100mL去離子去離子水中。避光儲存棕色瓶中。水中。避光儲存棕色瓶中。3M Tris-HCl (pH8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mL5Tris-甘氨酸電泳甘氨酸電泳buffer
37、pH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至至1L用時稀釋用時稀釋5倍。倍。 10%SDS:10g SDS溶解于溶解于100mL去離子水去離子水中,儲存于室溫中。中,儲存于室溫中。0.5M Tris-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mLTEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺):濃度濃度10%,20 mL (共用共用)10% AP(過硫酸銨過硫酸銨):10 mL,1g AP溶解于溶解于10mL去離子水中,新穎配制。去離子水中,新穎配制。 2x樣品緩沖液:樣品緩沖液: 10
38、0mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) 20% 甘油甘油 考馬斯亮藍(lán)染色液:考馬斯亮藍(lán)染色液:0.25g考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250溶溶于于45mL甲醇中,加甲醇中,加10mL冰醋酸冰醋酸 + H2O至至100mL。濾紙過濾除去不溶物。濾紙過濾除去不溶物 脫色液:脫色液:75mL冰乙酸冰乙酸 + 50mL甲醇甲醇 + 875mL H2O如只配如只配500mL,各物質(zhì)減半,各物質(zhì)減半實驗儀器實驗儀器 電泳儀、垂直板電泳安裝、電泳儀、垂直板電泳安裝、微量進(jìn)樣器微量進(jìn)樣器50L、染色、染色/脫色搖床等。脫色搖床等。操作
39、步驟操作步驟膠板模型的安裝:在干凈的帶隔板的玻膠板模型的安裝:在干凈的帶隔板的玻璃板的三條邊上把橡膠條壓上,然后將璃板的三條邊上把橡膠條壓上,然后將另一塊凹形玻璃板壓上,放入電泳槽中。另一塊凹形玻璃板壓上,放入電泳槽中。示范示范12%分別膠的制備每次配分別膠的制備每次配10 mL 去離子水去離子水 3.2mL 30% 凝膠液凝膠液 4.0mL 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 10% SDS 0.1mL 10% APS 0.1mL TEMED 0.005mL 用手輕搖約用手輕搖約2 2分鐘混勻分鐘混勻( (留意不要產(chǎn)生氣泡留意不要產(chǎn)生氣泡, ,小心將混合液注入預(yù)備好的玻
40、璃板間隙中,為濃縮小心將混合液注入預(yù)備好的玻璃板間隙中,為濃縮膠留足夠的空間,悄然在頂層參與幾毫升去離子水膠留足夠的空間,悄然在頂層參與幾毫升去離子水復(fù)蓋,以阻止空氣中氧對凝合的抑制造用。剛參與復(fù)蓋,以阻止空氣中氧對凝合的抑制造用。剛參與水時可看出水與膠液之間有界面,后漸漸消逝,不水時可看出水與膠液之間有界面,后漸漸消逝,不久又出現(xiàn)界面,這闡明凝膠已聚合。再靜置片刻使久又出現(xiàn)界面,這闡明凝膠已聚合。再靜置片刻使聚合完全。聚合完全。 !留意:為防止凝膠過快聚合,配膠用的無離子!留意:為防止凝膠過快聚合,配膠用的無離子水、水、30%30%的凝膠液及的凝膠液及Tris-HClTris-HCl緩沖液應(yīng)
41、事先于緩沖液應(yīng)事先于44或或冰上放置冰上放置, ,以下同。以下同。濃縮膠的制備:先吸去已聚合好的分別膠上濃縮膠的制備:先吸去已聚合好的分別膠上層的水,用水洗界面一次,再用濾紙吸干殘層的水,用水洗界面一次,再用濾紙吸干殘留的水液。按以下配方制備留的水液。按以下配方制備5毫升濃縮膠溶液。毫升濃縮膠溶液?;旌虾髮⑵渥⑷敕謩e膠上端,插入梳子應(yīng)小混合后將其注入分別膠上端,插入梳子應(yīng)小心防止氣泡。心防止氣泡。 去離子水去離子水 3.2mL 30% 凝膠液凝膠液 0.83mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75mL 10% SDS 0.050mL 10% AP 0.050mL TEMED 0
42、.005mL在濃縮膠聚合的同時,將樣品與在濃縮膠聚合的同時,將樣品與5 5樣品緩沖液樣品緩沖液16L16L 4L 4L混合,混合,100100加熱加熱3 3分鐘以變性蛋白質(zhì)。分鐘以變性蛋白質(zhì)。Sample1,2Sample1,2用用600L600L起始緩沖液懸浮,取起始緩沖液懸浮,取16L16L同上操作。同上操作。濃縮膠聚合完全后,小心地拔出梳子,用無離子水沖洗梳孔,將濃縮膠聚合完全后,小心地拔出梳子,用無離子水沖洗梳孔,將凝膠模板放入電泳槽上固定好,上下槽均參與凝膠模板放入電泳槽上固定好,上下槽均參與1X1X電泳緩沖液,電泳緩沖液,檢查有無漏液,除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡,上樣前用檢查有無漏液,除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡,上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔。上槽緩沖液沖洗梳子孔。按次序上樣:用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液,按次序上樣:用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液,20L/20L/孔,一孔加一個樣品,同時安排知分子量的規(guī)范物作對照??祝豢准右粋€樣品,同時安排知分子量的規(guī)范物作對照。電泳:開場時濃縮膠電壓為電泳:開場時濃縮膠電壓為80V,染料進(jìn)入,染料進(jìn)入分別膠后,將電壓增到分別膠后,將電壓增到120V,繼續(xù)電泳至染,繼續(xù)電泳至染料溴酚藍(lán)到分別膠底部,斷開電源。料溴酚藍(lán)到分別膠底部,斷開電源。8固定及染色:取下凝膠放入大培育皿,
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