目的基因雙酶切和電泳純化膠回收實驗報告

1、題目：目的基因雙酶切和電泳純化膠回收一實驗?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)雙酶切法獲取目的基因片段的原理和方法；2. 練習(xí) DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。3. 學(xué)習(xí)核酸瓊脂糖膠回收的原理和方法。二實驗原理1. 限制性核酸內(nèi)切酶： 生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈 DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。由于這種切割作用是在 DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶 （ 簡 稱限制酶 ） 。2. 切割序列：（1）Bam H切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端：5' ? G GATCC? 3' 5' ? G GATCC ?3'3' ? CCTAG G ? 5' 3' ?

2、 CCTAG G ?5'（2）Eco R切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端：5' ?G AATTC ?3' 5' ? G AATTC ?3'3' ?CTTAA G ?5' 3' ? CTTAA G ?5'3. 為什么要選擇表達(dá)載體質(zhì)粒 pET-28a？ pET原核表達(dá)質(zhì)粒是最有效的原核表達(dá)系統(tǒng)之一。目的基因被 克隆到 pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體 T7 強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制；表 達(dá)由宿主細(xì)胞提供的 T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。宿主菌帶有受 lacUV5 控制的 T7RNA聚合酶基因，可以通過 IPTG來啟動表達(dá)。充分誘導(dǎo)時，幾乎

3、所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá) 目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾小時，目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋 白的 50以上。4. 限制性內(nèi)切酶的選擇：選擇 BamHI 、 NotI 兩個位點 由于實驗中須將質(zhì)粒 pEGFP-N3 上所需的目的基因切下并連接到 載體質(zhì)粒 pET-28a 上，所以選擇的限制酶需滿足以下幾個要求： 一選擇兩種在質(zhì)粒 pEGFP-N3和載體質(zhì)粒 pET-28a 上都有酶切 位點的限制性酶切酶，以保證切下的目的基因和載體質(zhì)粒分別都 有兩個不同的末端，這樣可以防止：（ 1）質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化； （2）質(zhì)粒與質(zhì)粒、目的基因與目的基因相互自身連接；（3）質(zhì)粒與目的基因反向連接）二兩種限制性內(nèi)

4、切酶的酶切位點需滿足：（ 1）不破壞目的基因；（ 2）在質(zhì)粒 pEGFP-N3和載體質(zhì)粒 pET-28a 上都有且只有一 個酶切位點；（ 3）在載體質(zhì)粒上的切割位點距離盡量短些， 并且不破壞載體質(zhì)粒的啟動子等關(guān)鍵序列。載體質(zhì)粒 pET-28a 和質(zhì)粒 pEGFP-N3的酶切位點示意圖：圖一、 pET-28a 的酶切位點示意圖 圖二、質(zhì)粒 pEGFP-N3的酶切位點示意圖圖三、 pEGFP-N3 MCS多酶切位點示意圖5. 瓊脂糖凝膠回收（1）在酶切的過程中，除產(chǎn)生我們所需要的目的片段外，還會產(chǎn)生 一些小片段，這些小片段可能會與載體連接，從而產(chǎn)生干擾， 去除這 些小片段的最好方法就是進(jìn)行瓊脂糖凝

5、膠電泳 ；（ 2）不同分子量 的 DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳中 由于泳動速度 不一 樣而分離 ，通過回收可用于后續(xù)實驗；（ 3）本次實驗 使用試劑盒 進(jìn)行膠回收，按說明書進(jìn)行操作，可以用 溶劑使瓊脂糖融化，再經(jīng)過吸附管吸附目標(biāo)DNA，沖洗，溶解后得到高純度的目的基因片段。（ 4）硅膠樹脂在高鹽離子濃度下可以高效專一的吸附DNA，通過離心可將 DNA片段沉淀下來，在堿性低鹽濃度下其與DNA的結(jié)合能力會急劇降低，使用弱堿溶液如 TE（pH8.0 ）等可以從硅膠離心柱洗脫得到 純凈的 DNA片段；三 實 驗材料及設(shè)備1. 實驗材料：已經(jīng)提取好的 pEGFP-N3質(zhì)粒，1.5ml 塑料離心管若干， E

6、P管架， 微量取液器和取液器吸頭，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、試劑瓶 等），錐形瓶，一次性手套2. 實驗儀器：（ 1）恒溫?fù)u床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，10、 100、1000L 取液器各一支，移液槍頭若干，臺式高速離心機，制冰機，漩渦器；（2）電泳儀，電泳槽，樣品槽模板 （梳子），有機玻璃內(nèi)槽， 水平儀， 取液器，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)。3. 實驗試劑：（1）目的基因的雙酶切a. 核酸外切酶 : Not Bam H酶（置于冰盒中）b. 10×buffer（with BSA） ， ddH2O （2）DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測與純化a. gene Green （ DNA染料）b.1 &#

7、215; TAE緩沖液c. 上樣緩沖液（ 6Loading Buffer ） （3）膠回收目的基因片段a膠回收試劑盒一套， ddH2O四實驗方法及步驟1. 目的基因雙酶切a）分別取兩支 0.2mlEP 管做上記號：如 ； EP 管EP管10× buffer2 L /10× buffer2 L /(with BSA)3 l + 3 l ddH(2wOith BSA)3 l + 3 l ddNot1LNot1LBam H2 L / 2 LBam H2 L / 2 LpET-28a15 L / 20 LpEGFP-N315 L / 20 Lb) 兩個 EP管中分別配置下列的 20

8、 (老師提供) /30 L(自提) 體 系：(本次實驗使用 20L 體系)c) 將兩只 EP管混勻后瞬時離心，放入恒溫培養(yǎng)箱37 度酶切 1h；d) 酶切體系( 20 L+4 l Loading Buffer/ 30 L+6l LoadingBuffer )全部加入點樣孔進(jìn)行電泳 (自行配制 40ml 1%電泳凝膠 液做膠)，Marker DNA加 5l ，電泳結(jié)束后對目的基因片段進(jìn)行 膠回收。切膠前請先稱量裝膠的 1.5ml 離心管重量并做記錄，標(biāo) 記好離心管，裝膠后在進(jìn)行稱量，算出膠的重量；e) 切膠時，帶好護(hù)目鏡。 在紫外線燈照射下清晰可見目的基因片段， 亮度較高，邊際清晰，回收得到含有

9、目的基因片段的瓊脂膠，稱 重。f) 按照回收試劑盒步驟切膠回收所需目的基因片段；g) 將提取好的目的基因上交保存；2. DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測a) 瓊脂糖凝膠板的制備b）稱取 0.3g 瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入 30mL1× TAE緩沖液，微 波爐加熱直至瓊脂糖溶解 ;c）待膠液冷卻到 65 度（不燙手為宜） ，加入 1 L Gene green 混勻， 攪拌器上攪拌排除氣泡，緩慢倒入事先準(zhǔn)備的制膠有機玻璃槽 （插入樣品槽模板梳子 ）內(nèi) , 靜置 30min 左右，輕輕晃動拔出 梳子;3. 加樣酶切體系（ 20 L+4 l Loading Buffer/ 30 L+6l Load

10、ingBuffer ）全部加入點樣孔進(jìn)行電泳 （自行配制 40ml 1%電泳凝膠 液做膠），Marker DNA 加 5l4. 電泳將電泳槽與電泳儀接通，調(diào)節(jié)電壓為 100V 左右，直至緩沖液的 藍(lán)色指示劑移動到距離膠板邊沿約12cm處，停止電泳。5. 觀察和拍照將膠板小心取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)位置居中，波長為 254nm的紫外燈下，觀察凝膠中 DNA存在處顯示出熒光條帶。五實驗結(jié)果A 帶： 15000bppEGFP-N3目的基因片段B 帶 10000bpC帶 7500bpD帶 5000bpE帶 3000bpF帶 1000bpG帶 250bp圖 1雙酶切體系處理 pEGFP-N3與 p

11、ET-28a 質(zhì)粒凝膠電泳紫外熒光檢測結(jié)果說明：從左到右依次為：pET-28a 、pEGFP-N3、 DL15000Maker、pEGFP-N3、DL15000Maker由圖可知， pEGFP-N3泳道呈現(xiàn)為十分清晰的雙條帶，上部為酶切 后的 pEGFP-N3質(zhì)粒，下部為目的基因片段，無拖影，無雜帶，說明 目的基因純度較高，數(shù)量較多，前一實驗提取的質(zhì)粒純度較高。與 Marker 比照，酶切理論上會產(chǎn)生約 4000bp 和約 800bp 的條帶，預(yù)期 分子量基本符合對應(yīng)的分子量條帶，實驗結(jié)果較好。pET-28a 泳道共產(chǎn)生了四條條帶，除了最上層清晰的 5000bp 條 帶，還應(yīng)該出現(xiàn) 30bp

12、的條帶，但該條帶由于分子量太小，很有可能 已經(jīng)脫出瓊脂膠，無法在結(jié)果上顯示，所以另外的三個條帶推測為前 一次實驗提純質(zhì)粒時混入的 RNA或其他雜質(zhì)。切膠時，帶好護(hù)目鏡。在紫外線燈照射下清晰可見目的基因片 段，亮度較高，邊際清晰，回收得到含有目的基因片段的瓊脂膠，稱 重結(jié)果為約 1.1g 。膠回收完成后，得到少量溶有目的基因片段的PE 管一支。六 結(jié)果討論與結(jié)論：1. 實驗結(jié)論：根據(jù)瓊脂糖電泳紫外熒光檢測結(jié)果可見，各泳道拖影現(xiàn)象不明 顯， pEGFP-N3 泳道條帶清晰，無扭曲現(xiàn)象，無雜帶，酶切結(jié)果較 好； pET-28a 泳道由于只是切開一個缺口，理論上只應(yīng)該有一個清晰 條帶，實驗結(jié)果符合預(yù)期

13、。和 Marker 對照分子量符合理論結(jié)果，實 驗結(jié)果良好，可繼續(xù)用于下一次實驗。2. 討論一：影響酶切效率的因素有哪些？答： DNA的質(zhì)量，限制性內(nèi)切酶活性，酶的用量，酶切時間，酶切溫 度，緩沖液的條件3. 討論二：在實驗操作中，取用酶試劑時操作應(yīng)注意哪些方 面？答：（1）放在冰上使用，讓酶一直處于低溫環(huán)境，保持活性；（2）取用不同的酶時要換新槍頭，不要污染酶試劑。4. 討論三：實驗操作中，怎樣能使微量的試劑混合均勻？答：（1）加入試劑時，盡量在管底部加入；（2）可進(jìn)行瞬時離心。5. 討論四：本次實驗酶切結(jié)果較好，可能是哪些原因？答：（1）在酶切之前， 輕柔混勻酶與質(zhì)粒多次， 加快反應(yīng)， 提高效率；（2）適當(dāng)延長酶切的時間，保證反應(yīng)的完成度。（ 3）前一次提取的質(zhì)粒數(shù)量和質(zhì)量較高， 提高了本次實驗的成功率。6. 討論五：膠回收時的注意事項？（ 1） 檢測時用小梳子，減少損耗（ 2） 回收提純時用大梳子，提高效率（3） 稱取膠的重量，是為了確定 PC溶液的質(zhì)量，避免浪 費和其他不可預(yù)知的影響。（4） 用平衡液處理吸附柱， 直接影響后續(xù)的實驗結(jié)果， 因 為回收柱的鹽濃度、 酸堿度（電