qPCR操作步驟

1、錯(cuò)品用。*具體的操作步驟是，RNA提取，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10倍稀釋，real-time PCR.這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)的兩步法。一步法是把反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增聯(lián)合起來(lái)做，不推薦使用。具體的注意事項(xiàng)有1 :高質(zhì)量的RNA獲取，這里的高質(zhì)量不是強(qiáng)調(diào) RNA降解，而是強(qiáng)調(diào)RNA的純度，不能含有基因組 DNA, 以及其他雜質(zhì)污染。基因組DNA的存在會(huì)導(dǎo)致定量偏高，給你錯(cuò)誤的結(jié)果，所以一般用于定量PCR的RNA必須使用DNase處理，消除DNA污染。而RNA中的雜質(zhì)的污染會(huì)限制 real-time PCR的反應(yīng)，導(dǎo) 致擴(kuò)增失敗，給你假陰性的結(jié)果。RNA的降解不是關(guān)鍵，一個(gè)是因?yàn)槎縋CR的引物擴(kuò)增目的長(zhǎng)度本身很短

2、，150-250個(gè)bp,并不用于擴(kuò)增目標(biāo)基因的全長(zhǎng)。此外是因?yàn)榇嬖趦?nèi)參基因，所以 RNA降解會(huì)通過(guò) 內(nèi)參基因的測(cè)定來(lái)平衡。畢竟一旦發(fā)生降解，所有的 RNA以同樣的速度降解，而相對(duì)比率不會(huì)改變。2：減少加樣誤差， 在使用SYBR Green MIX 的時(shí)候，一定要先按照反應(yīng)的量（比如 8個(gè)孔）把所有的試 劑一次性配成MIX然后分裝，留出5微升的反應(yīng)體系給模板，為什么要使用5微升，是因?yàn)橹挥?微升以上，加樣槍的誤差才會(huì)比較小，如果你僅僅是吸取一微升的話，手重一點(diǎn)或者輕一點(diǎn)都會(huì)造成極大的加樣 誤差，嚴(yán)重影響你的定量精確度。3。選擇合適的內(nèi)參基因，一般用于定量PCR的內(nèi)參基因有好幾種，但卻沒(méi)有完全通用

3、的內(nèi)參基因。具體到不同來(lái)源的細(xì)胞，比如不同組織來(lái)源，或者是動(dòng)物等等，內(nèi)參基因會(huì)有差異，最好的辦法是，在你的樣 品上先測(cè)試內(nèi)參基因，找到變化最小，最穩(wěn)定的一個(gè)。4。合適的引物設(shè)計(jì)，避免出現(xiàn)引物二聚體，非特異性擴(kuò)增等等Q-PCR實(shí)驗(yàn)流程一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，每天早上到實(shí)驗(yàn)室后，先把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開(kāi)15-20分鐘。超凈臺(tái)前做實(shí)驗(yàn)，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需帶口罩。取EP管/槍頭時(shí)需用鐐子，不可以用使用過(guò)的手套直接取用。取完EP管他頭后，袋子及時(shí)封好。橡膠手套須放入超凈臺(tái)照射紫外，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不得帶出超凈臺(tái)，移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用75%乙醇清潔移液器，槍頭盒

4、及超凈臺(tái)面。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過(guò)程中或觀看實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒(méi)有帶口罩不要在超凈臺(tái)前講話。二、總RNA抽提1）細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈，加入1ml Trizol（invitrogen ）溶液，吹打混勻，并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置 5min;組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitro gen）溶液，混勻，室溫放置 5min使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱 ）2）加入200 口氯仿，劇烈振蕩混勻30s,使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置3-5min;（離心時(shí)離心管按順序排放，離心完畢，離心管的

5、順序也按順序排好，與第一步的順序一致 ）3） 4C下，14,000g離心15min ,可見(jiàn)分為三層，RNA在上層水相，移至另一個(gè)新的RNase free EP 管;（用20-200ul的槍吸取上清，吸上清時(shí)，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清， 槍頭不可碰到、吸到中間層 ）4）沉淀RNA:加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次）（不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置10min;5）4 C下，14,000g離心10min ,收集RNA沉淀（如離心后仍不見(jiàn) EP管底部有沉淀， 應(yīng)將EP管放置在-80度冰箱過(guò)夜，繼續(xù)在 4 c下，14,000g離心10min ,收集RNA沉淀）, 去上清；6）用75%乙醇洗

6、滌兩次（12,000g離心5min）（加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺(tái)風(fēng)干；沉淀不能過(guò)干或過(guò)濕，過(guò)干則不易溶解，過(guò)濕則乙醇?xì)埩簟?）視沉淀量加入適量 DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。三、去基因組使用RNase-free 的DNase ?（Promega）,按以下體系配置反應(yīng)液，37 c消化30min ,65 C 滅活 10min 。RNA30DNase ?2010 x buffer10H2O(RNase free)39.5RNasin0.5總體積100然后按以下步驟操作：1）加入等體積的苯酚/氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置5min，后14,000rpm

7、，離心15min , 取上清。2）加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻，靜置分層后14,000rpm ,離心15min ,取上清。3）加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次），-20C靜置15min;4）4 C下，14,000g離心15min ,收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）,超凈臺(tái)風(fēng)干；6）加入適量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。相品四、總RNA純度和完整性檢測(cè)1）純度檢測(cè)：取1 6 RNA樣品50倍稀釋，在核酸蛋白檢測(cè)儀上測(cè)定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8,說(shuō)明制備的 RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染。2）總RNA完整性檢測(cè)：取

8、 RNA樣品1 口 1%瓊脂糖凝膠電泳 80Vx 20min , EB染色 10min ,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總 RNA的5s rRNA , 18s rRNA和28s rRNA條帶, 三條條帶完整的話即可證明總 RNA抽提比較完整。五、逆轉(zhuǎn)錄1. mRNA :1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Total RNAH2O1.0閔 d2）將上述溶液吹打均勻，置 85 c保溫5min ,使RNA變性。隨后立即冰上致冷，以防止RNA復(fù)性；總體積123）在t% PCR管中加入卜列試劑（Promega）oligo (dT) Random primer 10mM dNTP RNase

9、inhibitor 5 x buffer M-MLV0.50.52.00.54.00.5出 出 出 出 d總體積8.04）將上述20 口反應(yīng)溶液30 c保溫10min;5）42 C保溫 50min;6） 85 C保溫 10min;7）-20 C 保存。2. microRNA :使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法，原理如下圖：1）在去RNase的PCR管中配置以下溶液total RNAX個(gè)miR逆轉(zhuǎn)錄引物H2O1.00.5*X聞隨后立即置于冰上，以防止 RNA復(fù)性再次恢復(fù)二級(jí)結(jié)構(gòu)3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:10mM dNTP (promega)2.0dRNase inhibitor (prom

10、ega)0.5dU6逆轉(zhuǎn)錄引物0.5d5x buffer4.0dM-MLV (promega)0.5d總體積7.5d4）將3）溶液加入到1）溶液中，混勻后 30 c保溫10min;5）42 C孵育 50min;6） 85 c孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。四、定量PCR檢測(cè)1 .引物測(cè)試：根據(jù)mRNA設(shè)計(jì)的引物正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行 qPCR測(cè)試其特異性和擴(kuò)增效率， 具體反應(yīng) 體系和反應(yīng)條件如正式實(shí)驗(yàn)，每對(duì)引物需做模板水對(duì)照。得到結(jié)果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性，選擇標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)畏迩曳逍纹⑺?對(duì)照無(wú)明顯引物二聚體熔解曲線峰。若設(shè)計(jì)的多對(duì)引物熔解曲線均顯示特異性良好，則應(yīng)對(duì)比各引物的擴(kuò)增曲線，優(yōu)先

11、選擇Ct值小、擴(kuò)增效率高的引物進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。2 .確定上機(jī)內(nèi)容后，首先在記錄本上編排好上機(jī)的樣品排放順序。（1） 一個(gè)樣品的加樣盡可能安排在同一行（2）如正式實(shí)驗(yàn)中三次重復(fù)不能安排在同一板上，則需把三次重復(fù)中的 實(shí)驗(yàn)分開(kāi)，但同一次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)不能分開(kāi)兩板3 .正式實(shí)驗(yàn)：體系配制：H2O 4ulSYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振蕩均勻)上游引物0.5ul (10uM)下游引物0.5ul (10uM)總體積15ul計(jì)算好實(shí)驗(yàn)中需用多少份體系，則按具體量配置。體系分裝會(huì)有損失，一般多配0.5份-1份體系?？偟捏w系配好后，在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸

12、打均勻，然后 15ul每管分裝至8連管 中。3 .CDNA用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛龋话銥?1:20稀釋，如遇到基因表達(dá)低的樣品， 則適當(dāng)降低稀釋比例至 1:10或1:5。cDNA按一定順序排好后， 即可加至剛配好的反應(yīng)體系 中。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標(biāo)記好1-12的順序（不可將標(biāo)記寫(xiě)在反應(yīng)管的蓋子上，八連管蓋避免裸手觸摸中間透明的熒光采集區(qū)域，且保證每孔均蓋緊，否則影響重復(fù)性或可能出現(xiàn)熔解曲線峰漂移。）4 .把各排八連管放在掌上離心機(jī)上離心數(shù)秒。五.上機(jī)：5.1 先開(kāi)電腦，進(jìn)入 Windows 界面。接著打開(kāi) PCR儀電源開(kāi)關(guān)。5.2 打開(kāi)7500軟件，選擇 新建”，在“Template下拉菜單中選擇 “6喊”65瞥通基因 檢測(cè)為“60； MicroRNA檢測(cè)為“65”）5.3 打開(kāi)樣品架，放入八連管，關(guān)上樣品架，并在軟件上選擇已放反應(yīng)管的孔位，剔 除無(wú)反應(yīng)管的孔位。5.4 點(diǎn)擊File菜單中Save,輸入要保存結(jié)果的文件名，命名為日期-上機(jī)時(shí)間-客戶名字簡(jiǎn)寫(xiě)，如100830-1008-WL 表示8月30日10點(diǎn)08分魏立的