核磁共振波譜學(xué)簡介

1、核磁共振波譜學(xué)簡介核磁共振波譜學(xué)簡介在在結(jié)構(gòu)生物學(xué)上的應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)上的應(yīng)用* 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)開放實(shí)驗(yàn)室中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)開放實(shí)驗(yàn)室第一部分第一部分 什么是核磁共振什么是核磁共振 核磁共振能提供什么信息核磁共振能提供什么信息 核磁共振技術(shù)的特點(diǎn)核磁共振技術(shù)的特點(diǎn)核磁共振現(xiàn)象核磁共振現(xiàn)象核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，簡寫為NMR），是指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用下，核自旋能級發(fā)生塞曼分裂（Zeeman Splitting），共振吸收某一特定頻率的射頻（radio frequency 簡寫為rf或RF）輻射的物理過

2、程。 幾種核的幾種核的性質(zhì)性質(zhì)核自旋 自然豐度 (%) 相對靈敏度 絕對靈敏度 核磁共振頻率1H 1/2 99.98 1.00 1.00 100 2D 1 0.015 9.6510-3 1.4510-6 15.351 13C 1/21.11 1.5910-2 1.7610-4 25.144 15N 1/20.37 1.0410-3 3.8510-6 10.133 19F 1/2100 8.3310-1 8.3010-1 94.077 23Na 3/2 100 9.2510-2 9.2510-2 26.451 31P 1/2 100 6.6310-2 6.6310-2 40.481 核磁矩與磁場

3、的相互作用核磁矩與磁場的相互作用1H,13C,15N等核自旋量子數(shù)I=,在外磁場中有兩種取向核磁能級間的躍遷核磁能級間的躍遷核磁信號核磁信號核磁共振信號是大量核大量核的貢獻(xiàn)的總和受激輻射和受激吸收的幾率相同，在射頻場作用下的凈躍遷由上下能級的布居數(shù)之差決定。很小的布居數(shù)差表明核磁信號很弱，因此核磁共振的靈敏度很低矢量模型矢量模型在核磁共振的經(jīng)典模型中，我們把每一個(gè)核磁矩看成是一個(gè)剛性矢量 核磁矩在外磁場中的進(jìn)動核磁矩在外磁場中的進(jìn)動核磁矩繞外磁場的進(jìn)動頻率稱為Larmor頻率: 0-H0 熱平衡時(shí)的熱平衡時(shí)的磁化矢量磁化矢量 旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系 矢量模型下的矢量模型下的核磁共振核磁共振共振時(shí)

4、，也就是當(dāng)射頻場園頻率等于在恒定磁場中核磁矩的拉摩進(jìn)動頻率，即0H0此時(shí)HeffH1i , M在旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中將繞Hb (也即x軸) 以角頻率1旋轉(zhuǎn)，1H1HeffHeffH0H0HvHvHbHb射頻脈沖射頻脈沖若將一個(gè)射頻場Hb，在共振條件下加到核系統(tǒng)上，施加時(shí)間為tp秒，則磁化強(qiáng)度矢量M將繞x 軸章動角度1tpH1 tp 脈沖功率脈沖寬度脈沖相位90度脈沖的作用脈沖后的自由進(jìn)動弛豫導(dǎo)致的相散弛豫弛豫 自旋晶格弛豫過程:核自旋系統(tǒng)與周圍晶格交換能量,使各能級上的布居數(shù)恢復(fù)到熱平衡狀態(tài) 自旋自旋弛豫過程:等同核自旋系統(tǒng)內(nèi)部各自旋之間交換能量,影響譜線線寬Bloch方程方程 單位體積內(nèi)核磁矩的矢量

5、和稱為磁化向量M 此處R稱為弛豫矩陣 T1為縱向弛豫時(shí)間 T2為橫向弛豫時(shí)間)()(0MMRBMdtMdeff122100010001TTTRS tM etyt T( )cos()/2核磁信號核磁信號 FID經(jīng)過Fourier變換得到核磁圖譜 磁化向量的水平分量在接收線圈中可以產(chǎn)生自由感應(yīng)衰減信號(FID) 密度算符密度算符波函數(shù)密度算符任意力學(xué)量F的期望值任意力學(xué)量F的期望值Schrdinger方程Liouville-Neumann方程HtiHidtd,FF)( FTrF密度算符的演化密度算符的演化 熱平衡態(tài)下的密度算符 如果H不顯含時(shí)間tHitHieet)0()()()exp(kTHTrk

6、TH化學(xué)位移化學(xué)位移 同一種核在分子中不同化學(xué)環(huán)境下共振頻率的位移稱為化學(xué)位移 正戊醇C5H11OH的13C質(zhì)子去耦譜 化學(xué)位移的起因化學(xué)位移的起因屏蔽磁場的形成1H譜化學(xué)位移的分布譜化學(xué)位移的分布自旋耦合自旋耦合 兩個(gè)鄰近的成鍵的自旋間具有自旋耦合，即J耦合，這種相互作用通過成鍵電子對傳遞 乙醇CH3CH2OH的高分辨1H譜 自旋耦合造成的能級和譜線分裂自旋耦合造成的能級和譜線分裂 無耦合 有耦合 自旋耦合作用下的演化自旋耦合作用下的演化IIJ tIIJ tIIJ tIIJ tIIIIJ tIJ tIIxJt IIxyzyJt IIyxzxzJt IIxzyyzJt IIzzzzzzz121

7、121212121121212122121211212212121212121212122222 cos()sin()cos()sin()cos()sin()221212112zIIJ tIJ tyzx cos()sin()Karplus關(guān)系式關(guān)系式 三鍵耦合常數(shù)3J的大小是二面角的函數(shù) JABCcoscos2核磁共振波譜學(xué)核磁共振波譜學(xué)脈沖傅立葉變換及多維核磁共振波譜技術(shù)的發(fā)展使得NMR可以用于蛋白質(zhì)溶液結(jié)構(gòu)解析1946年Stanford的Bloch和Harvard的Purcell各自獨(dú)立觀察到核磁共振現(xiàn)象。 1952年獲得諾貝爾物理獎(jiǎng) 化學(xué)位移和自旋偶合的相繼發(fā)現(xiàn)將NMR信號與化學(xué)結(jié)構(gòu)聯(lián)系

8、起來，NMR開始廣泛用于化學(xué) NOE NOE(Nuclear Overhauser Effect)指的是一個(gè)躍遷被擾動(飽和)時(shí)，另一個(gè)躍遷的強(qiáng)度發(fā)生改變這樣一個(gè)效應(yīng) 產(chǎn)生NOE的相互作用是兩核之間的偶極耦合 ，這種偶極相互作用的強(qiáng)度與核間距離的6次方成反比動態(tài)動態(tài)NMR 核磁共振可以檢測包括化學(xué)反應(yīng) ，構(gòu)象變化等動力學(xué)過程確定運(yùn)動相關(guān)時(shí)間c的NMR方法 1s c 初始擾動后的實(shí)時(shí)檢測 10ms c 10s 2D或3D交換譜(EXSY) 100s c 1s線型分析，交換加寬，和交換變窄 1s c 10ms 旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系里的弛豫時(shí)間T1 測量 30ps c 1s 實(shí)驗(yàn)室坐標(biāo)系里的弛豫時(shí)間T1的測量

9、 c 100ps 平均的序參數(shù) 分子內(nèi)運(yùn)動分子內(nèi)運(yùn)動 現(xiàn)有譜儀的磁場強(qiáng)度下主要是偶極弛豫起作用143612226/ ()()()CHHCCHCTrJJJ 184036622226/( )()()()()CHHCCHHCTrJJJJJ NOE()() ()()()HHCHCCHCCHC1636JJJJJ這里J稱為譜密度函數(shù)，同分子運(yùn)動方式及快慢有關(guān)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的1H譜譜 蛋白質(zhì)的第一張1H譜(核糖核酸酶, 40MHz),記于1957年 Adapted from J e r e m y N . S . E v a n s ( 1 9 9 5 ) Biomolecular NMR Spectros

10、copy. p.3, Oxford University Press Inc. 2.0 mM Rnase T1的900MHz 1H譜 二維二維NMR 比列時(shí)的Jeener于1971年提出二維NMR的思想 瑞士的Ernst對二維NMR進(jìn)行了深入研究，于1976年用量子統(tǒng)計(jì)的系綜理論對二維NMR原理進(jìn)行詳盡的理論闡述，1983年又提出乘積算符理論，大大簡化了脈沖序列的分析。由于在PFT-NMR及2DNMR二方面的貢獻(xiàn)而獲得1991年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 瑞士的Wthrich首先將2D-NMR的方法用于蛋白質(zhì)，發(fā)展了將2D-NMR和距離幾何結(jié)合得到蛋白質(zhì)在溶液中的空間結(jié)構(gòu)的方法 ，第一個(gè)用NMR方法解析出蛋

11、白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。獲得2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 二維核磁共振波譜的基本思想二維核磁共振波譜的基本思想 二維NMR實(shí)驗(yàn)在時(shí)間域上可分為四個(gè)時(shí)期2D-FID 記錄的是時(shí)間域的二維信號S(t1,t2)，經(jīng)二維Fourier 變換即得頻率域的二維核磁共振譜S(1,2) 二維核磁共振波譜的特點(diǎn)二維核磁共振波譜的特點(diǎn) 引入另一個(gè)頻率變量，使原來擁擠在一個(gè)線段上的密集譜線，可以分散在一個(gè)平面上，提高圖譜的分辨率 S(1, 2)并不是S(1)和S(2)的簡單疊加，其交叉峰包含了比一維譜豐富得多的信息 實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣 ，被稱為“自旋工程” (Spin engineering) 可以間接檢測到在普通一維NMR實(shí)驗(yàn)中

12、檢測不到的躍遷，如多量子躍遷 堆積圖方式表示的堆積圖方式表示的二維二維譜譜等高線圖方式表示的等高線圖方式表示的二維二維譜譜蛋白質(zhì)研究中常用的二維譜蛋白質(zhì)研究中常用的二維譜 同核化學(xué)位移相關(guān)譜（COSY） 雙量子濾波COSY （DQF-COSY ） 全相關(guān)譜 （TOCSY ） 核歐沃豪斯效應(yīng)增強(qiáng)譜（NOESY，ROESY ） 異核化學(xué)位移相關(guān)譜 （HMQC ，HSQC）相敏相敏COSY 相位循環(huán)：10 2 2 0 1 3 3 120 2 0 2 1 3 1 3R0 2 2 0 1 3 3 1乙醇乙醇CHCH3 3CHCH2 2OHOH的的COSY譜譜COSY譜（不考慮其精細(xì)結(jié)構(gòu)）譜（不考慮其精細(xì)

13、結(jié)構(gòu)）(a)一個(gè)三自旋體系A(chǔ)MX ; (b)兩個(gè)三自旋體系A(chǔ)MX、AMX 同核同核Relay相關(guān)譜相關(guān)譜(a)AMX體系，(b)AMX和AMX體系 相敏相敏COSY譜交叉峰的精細(xì)結(jié)構(gòu)譜交叉峰的精細(xì)結(jié)構(gòu) A、交叉截面 B、交叉峰的等高線圖 C、自旋-耦合 TOCSY 相位循環(huán)： 10 2 2 0 1 3 3 1 20 2 0 2 1 3 1 3 R0 2 2 0 1 3 3 1NOESY 相位循環(huán)： 1 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2 3 0 0 2 2 1 1 3 3 0 0 2 2 1 1 3

14、 3 R 0 2 2 0 1 3 3 1 2 0 0 2 3 1 1 32D-NMR的限制的限制 2D-NMR在確定蛋白質(zhì)溶液的結(jié)構(gòu)方面已取得了巨大的成就，可以獲得小于100個(gè)殘基的小蛋白的溶液結(jié)構(gòu)，在準(zhǔn)確度方面類似于2.0-2.5 分辨率的晶體結(jié)構(gòu) 隨著蛋白質(zhì)分子量的進(jìn)一步提高，由于化學(xué)位移的重疊或簡并，使得在2D NMR方法中所使用的自旋系統(tǒng)識別和序列識別方法不再完全有效 其次是隨著分子量增加，譜線變寬，因而使得較難利用建立在小的同核耦合(耦合常數(shù)12Hz)之上的一些位移相關(guān)實(shí)驗(yàn)小蛋白和大蛋白二維譜的比較小蛋白和大蛋白二維譜的比較BmP02(28個(gè)殘基) 部分NOESY譜 ADR6(115

15、個(gè)殘基) 部分NOESY譜 異核多維異核多維NMR 增加譜的維數(shù)，提高分辨率 將大的單鍵異核耦合用于磁化轉(zhuǎn)移 preparationevolutionmixingacquisitionpreparationevolutionmixingacquisition2D2Dcombinepreparationevolutionmixingacquisitionevolutionmixing3Dt1t2多維多維NMR分辨率的提高分辨率的提高F1F2F1F2F32D3DF1F2F3F41H-15N異核相關(guān)譜異核相關(guān)譜15N編輯三維編輯三維NOESY譜譜核磁共振在生物科學(xué)核磁共振在生物科學(xué)中的主要應(yīng)用中的主要應(yīng)用測定生物大分子空間結(jié)構(gòu)測定生物大分子空間結(jié)構(gòu)研究生物大分子與配基的相互作用研究生物大分子與配基的相互作用測定生物大分子的動力學(xué)性質(zhì)測定生物大分子的動力學(xué)性質(zhì)跟蹤蛋白質(zhì)的折疊過程跟蹤蛋白質(zhì)的折疊過程,捕獲折疊過程中瞬態(tài)中捕獲折疊過程中瞬態(tài)中間物間物測定可滴定基團(tuán)的解離常數(shù)測定可滴定基團(tuán)的解離常數(shù)測量溶液中分子的擴(kuò)散系數(shù)測量溶液中分子的擴(kuò)散系數(shù)研究酶反應(yīng)機(jī)理研究酶反應(yīng)機(jī)理跟蹤活細(xì)胞的代謝過程跟蹤活細(xì)胞的代謝過程用于醫(yī)學(xué)成像以及神經(jīng)科學(xué)中的腦功能成像用于醫(yī)學(xué)成像以及神經(jīng)科學(xué)中的腦功能成像核磁共振技術(shù)的特點(diǎn)核磁共振技術(shù)的特點(diǎn) 天然狀態(tài)下對樣品進(jìn)行探測 提供原子分辨率上的結(jié)構(gòu)及動力學(xué)信