實驗五ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg(1)

1、編輯ppt實驗五：實驗五：ELISAELISA法檢測乙肝表面法檢測乙肝表面抗原（抗原（HBsAgHBsAg）2014年年11月月編輯ppt免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)定義： 將抗原-抗體反應(yīng)與標記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標記的已知抗體或抗原，通過檢測標記物，間接測定未知的抗原或抗體。分類： 放射免疫測定法：131I，32P 免疫熒光技術(shù)：FITC，PE 免疫酶測定法：HRP，AP編輯ppt編輯ppt免疫酶測定法免疫酶測定法編輯ppt酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,簡稱ELISA，它是實驗室最常用

2、的檢測方法，用酶標記抗原或抗體檢測液體（血液、細胞液）中未知抗體或抗原。 ELISA具有準確性高、檢測時間短、價格低廉、判斷結(jié)果有客觀標準、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點，適合于大批標本的檢測，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、醫(yī)療檢測以及免疫實驗分析等領(lǐng)域。編輯ppt(1).抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性。例如：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與聚苯乙烯表面的疏水基團能產(chǎn)生互作用而吸附。(2).抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；(3).酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的

3、深淺是與標本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，由此進行定性或定量分析。2、ELISA基本原理編輯ppt3、ELISA基本的實驗過程 包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化； 抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定； 酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色。編輯ppt ELISA的試劑ELISA中有中有3 3個是必要的試劑：免疫吸附劑、標記物和顯色劑。個是必要的試劑：免疫吸附劑、標記物和顯色劑。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （聚苯乙烯板：具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗

4、原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性）（2）酶標記的抗原或抗體（標記物）；（3）酶作用的底物（顯色劑）；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5）樣品及標準本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液編輯ppt ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法，主要類型有 雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等。4、ELISA類別編輯ppt雙抗體夾心法編輯ppt間接法編輯ppt以雙抗體夾心法ELISA為例）：）：用抗體包被固相載體加入抗原Sample(二價以上)，溫育加入酶標抗體，溫育加入底物，顯色清洗清洗清洗終止反應(yīng)

5、，底物顯色深淺與待檢抗原量成正比。利用已知濃度的抗原制成標準品，稀釋為梯度濃度，對其最終OD值與濃度作標準曲線，那么樣品的濃度可以根據(jù)最終的OD值在標準曲線上查出。編輯ppt實驗內(nèi)容：實驗內(nèi)容： 雙抗體夾心法測定乙肝表面抗原雙抗體夾心法測定乙肝表面抗原（HBsAg）定性定量檢測定性定量檢測編輯ppt 1、掌握ELISA（雙抗體夾心法）的原理 2、熟悉ELISA實驗操作方法，并了解其應(yīng)用實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康木庉媝pt實驗材料實驗材料HBsAgHBsAg酶聯(lián)免疫分析試劑盒酶聯(lián)免疫分析試劑盒HBsAgHBsAg陽性品，陰性對照品陽性品，陰性對照品移液槍，槍頭移液槍，槍頭濕盒濕盒酶標板，酶標儀酶標板，酶標

6、儀一次性手套一次性手套記號筆記號筆計時器計時器編輯ppt實驗步驟實驗步驟編輯ppt結(jié)果判定結(jié)果判定定性測定定性測定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應(yīng)性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。待測孔（P）與對照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽性，N為陰性對照孔。定量測定：酶標儀測定450nm波長下的OD值，根據(jù)標準曲線計算樣品抗原的濃度。編輯ppt 陽性：顯色為黃色 陰性：無色1 2 3 4陰性陰性陰性陰性 陽性陽性陽性陽性編輯pptELISAELISA注意事項注意事項 加樣應(yīng)加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，避免產(chǎn)生氣泡并迅速完成；一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。 洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽性； 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 ELISA板放在濕盒內(nèi)，可在盒底墊濕的紗