1.2DNA重組技術的基本操作程序

1、1. 2基因工程的基本操作程序【學習目標】1 .簡述基因工程原理及基本操作程序。2 .嘗試設計某一轉基因生物的研制過程。【教學重點】基因工程基本操作程序的四個步驟?！窘虒W難點】1 .從基因文庫中獲取目的基因。2 .利用PCR技術擴增目的基因?！绢A習導學】一、目的基因的獲取：1 .目的基因：符合人們需要的，編碼蛋白質的 。2 .獲取目的基因的方法(1)從基因文庫中獲取目的基因基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多 ,導人受體菌的群體中 ,各 個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蚪M文庫：含有一種生物的 基因種類I cDNA文庫：含有一種生物的 基因目的基因的獲取根據(jù)基因的有關信息

2、：基因的 序列、基因在 上的位置、基因 的 產物mRNA、基因的 產物蛋白質等特性獲取目的基因。3 2)PCR技術擴增目的基因PCR:是一項在生物體外 特定DNA片段的核酸合成技術。條件：已知目的基因的 序列。過程：目的基因 DNA受熱形成,與 結合，然后在 的作用下進行延伸形成 DNA。方式：指數(shù)擴增=2n(n為擴增循環(huán)的次數(shù))(3)人工合成法：基因較小，核甘酸序列已知，可以人工合成?！纠}鞏固】()例1 .下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術擴增目的基因反轉錄法 通退火第一輪循環(huán)毫伸過DNA合成儀利用化學方法人工合成A.B. C. D.()例2. (

3、2011年江蘇卷)請回答基因工程方面的有關問題：(1)利用PCR術擴增目的基因，其原理與細胞內 DNAM 制類似(如下圖所示)。 圖中引物為單鏈 DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。從理論上推測，第四輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為 。在第 輪循環(huán)產物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核甘酸鏈等長的DNA片段。（2）設計引物是PCRa術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物（只標注了部分堿基序列）都不合理（如下圖），請分別說明理由。第1組：;第2組：。4 3） PCR反應體系中含有熱穩(wěn)定 DN咪合 酶，下面的表達式不能正確反映 DN咪合 酶的功能，這是因為（4）用限制酶EcoRV Mbol單獨或聯(lián)合

4、切割同一種質粒，得到的 DNA段長度如下圖（1 kb 即1000個堿基對），請在答題卡的指定位.3 f用物'1一I_III-I第粗引物CAGGCT引物 II1 I 1 I I I I A G C C 1 G3 皿 r 14引物" I _1 T 1I -I _I ""I r第2組引物AACTG c A G T T引物 II1 1 CGA C T Q ATTA置畫出質粒上 EcoRV Mbol的切割位點。二、基因表達載體的構建1 .表達載體的組成：目的基因 +標記基因等。2 .啟動子：位于基因的 ,它是 和結合的部位,驅動基因轉錄產生 mRNA 。3 .終止子

5、：位于基因的 ,終止。4 .標記基因： 受體細胞是否含有目的基因。5 .表達載體的功能：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且 給下一代； 同時使目的基因 和發(fā)揮作用。6 .不同的受體細胞及目的基因導入受體細胞的方法不同，基因表達載體的構建上也 會有所差別。（）例3.科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽抱桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子（抗蟲基因首端），導人棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子（抗蟲基因末端）

6、，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。由以上過程推知，作為目的基因的運載體應具備的結構是A.目的基因、啟動子B.目的基因、終止子C.目的基因、啟動子、終止子D.目的基因、啟動子、終止子、標記基因三、將目的基因導入受體細胞（一）轉化：目的基因進人受體細胞內，并在受體細胞內維持穩(wěn)定和 （二）方法的過程。7 .將目的基因導入植物細胞(1)農桿菌轉化法農桿菌特點：易感染 植物和裸子I1物，對 植物沒有 感染力；Ti質粒的 可轉移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體上。轉化：目的基因插人 -農桿菌一導入植物細胞一目的基因整合到植物細胞染色體上一目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達。(2)基因槍

7、法基因槍法：是單子葉植物中常用的一種基因轉化方法，但是成本較高。(3)花粉管通道法花粉管通道法：這是我國科學家獨創(chuàng)的一種方法，是一種十分簡便經(jīng)濟的方法。(我的的轉基因抗蟲棉就是用此種方法獲得的)8 .將目的基因導入動物細胞(1)方法： 注射技術。(2)操作程序：目的基因表達載體 一取卵(受精卵)一顯微注射一注射了 目的基因的受精卵移植到 性動物的 內發(fā)育一新性狀動物。9 .將目的基因導人微生物細胞(1)原核生物特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等。(2)大腸桿菌最常用的轉化方法是： 處理細胞一 細胞一表達載 體與感受態(tài)細胞混合一 細胞吸收DNA分子。()例4.采用基因工程的方法培育抗蟲

8、棉，下列導入目的基因的做法正確的是將毒素蛋白注射到棉受精卵中將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中將編碼毒素蛋白的 DNA序列，與質粒重組，導人細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再 進行組織培養(yǎng)將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵A、B、C、D、四、目的基因的檢測與鑒定1 .檢測(1)方法：DNA分子雜交技術、抗原抗體分子雜交方法。(2)內容檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入。檢測目的基因是否轉錄 。檢測目的基因是否翻譯成 。2 .鑒定：鑒定、抗病鑒定等。鞏固練習:、選擇題:1.下列屬于獲取目的基因的方法的是PCR技術利用mRNA反轉錄形成從基因組文庫中提

9、取從受體細胞中提取利用利用DNA轉錄人工合成A.B.C. D.2 .不屬于目的基因與運載體結合過程的是 A.用一定的限制酶切割質粒，露出黏性末端 C.將切下的目的基因插入到質粒的切口處3 .有關基因工程的敘述正確的是A.限制酶只在獲得目的基因時才用C.質粒都可作為運載體4 .哪項不是基因表達載體的組成部分B.用同種限制酶切割目的基因，露出黏性末端D,將重組DNA引入到受體細胞中進行擴增B.重組質粒的形成在細胞內完成D.蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料A.啟動子 B.終止密碼C.標記基因 D.目的基因5 .在胰島素的基因與質粒形成重組DNA分子的過程中，下列哪組是所需要的同一種限制酶切割兩者

10、；不需同一種限制酶切割兩者；加入適量的DNA連接酶;不需加DNA連接酶A. B.C. D.6 .下列說法中正確的是A.基因表達載體的構建方法是一致的B.標記基因也叫做抗生素基因C.顯微注射技術是最為有效的一種將目的基因導入植物細胞的方法D.大腸桿菌是常用的微生物受體7 .基因工程中科學家常采用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞。下列不屬于這樣做的 原因的是A.結構簡單，多為單細胞 B.繁殖速度快C.遺傳物質含量少 D.性狀穩(wěn)定，變異少8 .要檢測目的基因是否成功的插入了受體DNA中，需要用基因探針，基因探針是指A.用于檢測疾病的醫(yī)療器械B.用放射性同位素或熒光分子等標記的DNA分子C.合成P一球

11、蛋白的DNA D.合成苯丙羥化酶的 DNA片段9 .基因工程的正確操作步驟是構建基因表達載體將目的基因導入受體細胞檢測目的基因的表達是否符合特定性狀要求獲取目的基因A.B.C.D.10 .下列有關基因工程技術的敘述，正確的是A.重組DNA技術所用的工具酶是限制酶、DNA連接酶和基因進入受體細胞的載體B .所有的限制酶都只能識別同一種特定的核甘酸序列C.選用細菌作為重組質粒的受體細胞主要是因為細菌繁殖快、遺傳物質少D.只要目的基因進入受體細胞就能成功實現(xiàn)表達11 .基因工程中不會出現(xiàn)A. DNA連接酶將黏性末端的堿基連接起來B.限制性內切酶可用于目的基因的獲取C.目的基因必須有載體導入受體細胞D

12、.人工合成目的基因不用限制性核酸內切酶（11年四川卷）12.北極比目魚中有抗凍基因，其編碼的抗凍蛋白具有 11個氨基酸的重復序列，該序列重復次數(shù)越多，抗凍能力越強，下圖是獲取轉基因抗凍番茄植株的過程示意 圖，有關敘述正確的是比日皇jjm住NA fDHAi，的富囿、,、一窕閩fj樂詢、_& Br>T鶴雋蛆我f一糠番茄植株1I番砌點1A.過程獲取的目的基因，可用于基因工程和比目魚基因組測序B.多個抗凍基因編碼區(qū)依次相連成能表達的新基因，不能得到抗凍性增強的抗凍蛋白，C.過程構成的重組質粒缺乏標記基因，需要轉入農桿菌才能進行篩選D.應用DN琳針技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因

13、的存在及其完全表達多選13.下列有關基因工程的說法中正確的有A. 一種限制性內切酶只能識別一種特定的核甘酸序列B. DNA聚合酶可以用來“縫合”目的基因與運載體之間的缺口C. “不同的DNA分子具有相同的雙螺旋結構”是基因工程成功實施的基礎D.黏性末端堿基對之間的連接需要DNA!接酶的催化多選14.下列有關DN麋合酶鏈式反應(PCR)的說法正確的是A.需要引物B.始終在高于70c的條件下進行C.需要加DNA1接酶D.不需要加限制性內切酶二.填空題：15 .根據(jù)下列所給材料回答問題：材料一 把人的胰島素基因拼接到大腸桿菌的質粒上，然后導入大腸桿菌內，產生出人的胰島素。材料二 把螢火蟲的熒光基因轉

14、入煙草體內，培育熒光的煙草。材料三 有人把蜘蛛產生絲腺蛋白的基因轉入羊的細胞中，在羊分泌的乳汁中加入某種物質后，可抽出細絲，這種細絲可望用作手術的縫合線。(1)上述生物新品種的產生運用了 技術。(2)一種生物的基因在另一種生物體內能夠表達，而不影響其他基因的表達，這說明基因是有 效應的 片段，具有一定的 性；同時可以說明各種生物共用一套 (3)上述技術所用的工具酶有 。(4)可遺傳的變異分為三種： 、,而基因工程改 變一個物種的基因屬于 ?？拱避狼嘈枨蠡驒z測'暗選|四環(huán)素杭性站因也烏a點為目的基因與 質物A的結合點(5)從上述所給的材料，不能得出哪一結論A.動植物之間可以相互轉基因B

15、.真核生物與原核生物之間可以相互轉基因C.基因工程可以定向地改變生物的基因D.轉基因生物的出現(xiàn)對生物的進化是有利的16 .右圖是將人的生長激素基因導人細菌B細胞內制造“工程菌”的示意圖，所用載體 為質粒Ao已知細菌B細胞內不含質粒 A, 也不含質粒 A上的基因，質粒A導人細菌B后，其上的基因能得到表達。請回答下列問題:(1)目前把重組質粒導入細菌細胞時，效率還不高，導入完成后得到的細菌，實際上有的根本沒有導入質粒，有的導入的是普通質粒A,只有少數(shù)導入的是重組質粒。以下步驟可鑒別得到的細菌是否導人了質粒A或重組質粒：將得到的細菌涂布在一個含有氨茉青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長的就導人了質粒 A或重組

16、質粒，反之則沒有。使用這種方法鑒別的原 因。(2)若把通過鑒定證明導人了普通質粒A或重組質粒的細菌放在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，會發(fā)生的現(xiàn)象是 。原因是：。(3)導人細菌B細胞中的目的基因成功表達的標志是什么？(09年江蘇高考)17.蘇云金桿菌(Bt)能產生具有殺蟲能力的毒素蛋白。下圖是轉Bt毒素蛋白基因植物的培育過程示意圖(ampr為抗氨茉青霉素基因)，據(jù)圖回答下列問題。3種限制性鐵酸內切卿眼別用步寸,他切位點JJind m: 上GUltBarnH I: dtrATCCBsr I:ATCCTTCGAACCTAGGCCTA0GBarntl I目的拈閃-后的網(wǎng)因 T-DNA入畸和網(wǎng)得布通捋平板h

17、將圖中的DN刖 Hindlll 、BamH I完全酶切后，反應管中有 種DNM段。(2)圖中表示Hindlll與BamI酶切、DNA連接酶連接的過程，此過程可獲得 種重 組質粒；如果換用 Bst l與BamHl酶切，目的基因與質粒連接后可獲得 種重組質粒。(3)目的基因插人質粒后，不能影響質粒的 。(4)圖中的Ti質粒調控合成的vir蛋白，可以協(xié)助帶有目的基因的T- DNA導人植物細胞，并防止植物細胞中 對TDNA的降解。(5)已知轉基因植物中毒素蛋白只結合某些昆蟲腸上皮細胞表面的特異受體，使細胞膜 穿孔，腸細胞裂解，昆蟲死亡。而該毒素蛋白對人類的風險相對較小，原因是人類腸上皮 細胞 。(6)生產上常將上述轉基因作物與非轉基因作物混合播種，其目的是降低害蟲種群中的 基因頻率的增長速率。引33. （8 分）（1） 15/16 三（2）引物I和引物n局部發(fā)生堿基互補配對而失效物I '自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效（3） DNA聚合酶只能將單個脫氧核甘酸連續(xù)結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上（4）見右圖D D