測定細菌生長曲線

1、實驗七測定細菌生長曲線實驗目的1. 了解細菌生長曲線特征，測定細菌繁殖的代時；2. 學習液體培養(yǎng)基的配制以及接種方法；3. 反復練習無菌操作技術；4. 了解不同細菌，不同接種方法在同一培養(yǎng)基上生長速度的不同；5. 掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法實驗原理將一定量的細菌接種在液體培養(yǎng)基內(nèi)，在一定條件下培養(yǎng)，可觀察到細菌的生長繁殖有一定的規(guī)律性， 如以細菌的活菌數(shù)的對數(shù)作縱坐標，以培養(yǎng)時間作橫坐標， 可繪成、n對數(shù)期（生長旺盛不同的微生物有不同的生一條曲線，成為生長曲線（如圖一）。期）、川平衡期（穩(wěn)定期）、"死亡期（衰亡期）。生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的全過程的動態(tài)。

2、長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不一樣。因此， 測定微生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數(shù)板法、平板菌落計數(shù)法、稱重法和比濁法等。本實驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用 分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值（OD600）與其對應的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意，由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)， 包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。 從生長曲線我們可以算出細胞每分裂一次所需要的時間，即代時，以G表示。其計算公式為

3、：t2(lgW2 -IgW)/ 式中t1和t2為所取對數(shù)期兩點的時間；W1和W2分別為相應時間測得的細胞含量（ g/L）或OD。 實驗儀器、材料和用具1. 實驗材料：大腸桿菌，枯草桿菌菌液及平板；2. 培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基3. 實驗儀器：取液器（5000ul, 1000ul各一支）;培養(yǎng)箱，搖床，722s分光光度計；4. 實驗用具：無菌1000ul吸頭80個;無菌5000ul吸頭2個此色皿9個+ 共用參比杯一個 四、 實驗步驟1.準備菌種：將細菌接種到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培養(yǎng)基中,37 C振蕩培養(yǎng)18h，另外準備單菌洛平板各1塊2.分為三個小組：第（1）小組取1.0ml大腸桿菌

4、菌液接種到100ml 培養(yǎng)基,37C200rpm取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml 培養(yǎng)基，37C200rpm取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml 培養(yǎng)基，37C200rpm第（2）小組取一個大腸桿菌菌落接種到100ml 培養(yǎng)基，37 C200rpm取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml 培養(yǎng)基，37C110rpm30 C 200rpm37 C 200rpm30 C 200rpm37 C 110rpm取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培 ，養(yǎng)基， 第（3）小組取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培 ，養(yǎng)基， 取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培 ，養(yǎng)基，取1.0ml枯草桿菌接種

5、到100ml培每培養(yǎng)一小時取樣一次（2.5h,3.5h加測1次）.對照組測量起始pH,所有瓶子測量發(fā)酵9h結束測pH.3. 測量：選用600nm波長，以蒸餾水作為參比，開始培養(yǎng)前測定每組培養(yǎng)液的0D值作為起始點。開始培養(yǎng)后，每小時吸取測定一次OD值。五、實驗結果及分析1.實驗數(shù)據(jù)：表一三個小組時間-OD數(shù)據(jù)開始取樣時間10:5512:0112:3913:1713:53結束取樣時間P 9:5511:0112:0912:4713:2313:59發(fā)酵時間1 0122.51 33.5ODt大腸 桿菌單菌落0.0040.0240.0270.0270.0250.03637 C 110rpm-0.0100.

6、0490.1640.2550.3120.32730 C 200rpm-0.0100.0430.0880.1580.2420.3611.0mL0.0100.0700.1580.2660.3720.4363.0mL0.0390.0960.2570.3730.4200.4515.0mL0.0670.1340.3020.3610.3340.456枯早 桿菌37 C 200rpm0.0080.0230.0760.1320.1840.25430 C 200rpm0.0130.0320.0520.0880.0910.12537 C 110rpm0.0070.0170.0980.1300.2300.253OD

7、=ODt-OD(大腸'桿菌單菌落0.0040.0200.0230.0230.0210.03237 C 110rpm-0.0100.0590.1740.2650.3220.33730 C 200rpm-0.0100.0530.0980.1680.2520.3711.0mL0.0100.0600.1480.2560.3620.4263.0mL0.0390.0570.2180.3340.3810.4125.0mL0.0670.0670.2350.2940.2670.389枯草37 C 200rpm0.0080.0150.0680.1240.1760.24611-1桿菌-30 C 200rpm

8、0.0130.0190.0390.0750.0780.1121 137 C 110rpm0.0070.0100.0910.1230.2230.246開始取樣時間14:2915:3516:4317:5018:5719:0720:12結束取樣時間P 14:3515:4316:5017:5719:09P 20:0721:12：發(fā)酵時間45678910ODt大腸 桿菌單菌落0.0650.2670.3950.4540.45737 C 110rpm0.3330.3400.3420.3600.36230C 200rpm0.4390.5660.5700.5880.5861.0mL0.4640.4460.446

9、0.4580.4403.0mL0.4870.4700.4570.4830.4585.0mL0.4690.4570.4640.4820.478枯早 桿菌37C 200rpm0.3370.4280.5170.5900.6860.7110.71130C 200rpm0.1710.2610.3700.5400.6280.6060.65237 C 110rpm0.2950.3020.3050.3050.3520.3520.378OD=ODt-OD0大腸 桿菌單菌落0.0610.2630.3910.4500.453r 37 C 110rpm0.3430.3500.3520.3700.37230C 200r

10、pm0.4490.5760.5800.5980.5961.0mL0.4540.4360.4360.4480.4303.0mL0.4480.4310.4180.4440.4195.0mL0.4020.3900.3970.4150.411枯早 桿菌37C 200rpm0.3290.4200.5090.5820.6780.7030.70330C 200rpm0.1580.2480.3570.5270.6150.5930.63937 C 110rpm0.2880.2950.2980.2980.3450.3450.3712.作圖、簡要分析及代時計算：1）取一個大腸桿菌菌落接種到100ml培養(yǎng)基， 37

11、C 200rpm圖一單菌落大腸桿菌生長曲線這條曲線屬于比較標準的“ S”形曲線，很容易看出調(diào)整期和對數(shù)期，由于單菌落菌較少，而且從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基環(huán)境變化較大，所以出現(xiàn)了長達4小時的調(diào)整期,但可以看出，調(diào)整期之后這瓶菌都生長良好。計算代時：取培養(yǎng) 4小時到5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式,t2 ti=1h Wi=0.061W2=0.263上2 7(lgW2 -lgWi)/lg2(lg 0.263-lg 0.061)/lg 2 一。"仆2）取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 C 110rpm圖二 大腸桿菌菌生長曲線（取1.0ml大腸桿

12、菌接種到100ml培養(yǎng)基，37 C110rpm）接種后幾乎沒有調(diào)整期出現(xiàn)，大腸桿菌很快適應了新的環(huán)境并開始呈指數(shù)增長，估 計是新的培養(yǎng)環(huán)境和原有環(huán)境較一致，而且在培養(yǎng)最初的時候溶氧和酸堿度都較為 適宜，但是這瓶菌是穩(wěn)定期 OD最小的，估計是培養(yǎng)基最初分裝不均產(chǎn)生的。計算代時：取培養(yǎng) 2小時到2.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 t1=0.5h W1=0.174W2=0.265代時 G也 W0.824h（lgW2 -lg W1）/lg2（lg 0.265 lg 0.174）/lg 23）取1.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養(yǎng)基，30 C 200rpmEdo=

13、 POFfetKQo圖三 大腸桿菌生長曲線 （取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，30 C 200rpm） 可以看出溫度對大腸桿菌適應環(huán)境產(chǎn)生了一定的影響，使它在調(diào)整期滯留了較長的 時間，且在對數(shù)期增長較慢，應該是酶活性對細胞復制的影響所致。計算代時：取培養(yǎng) 2.5小時到3.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。代時G二上2 - 1(lgW2 -lgWJ/lg2由代時計算公式，t2 t1=1h W1=0.168W2=0.3710.875h(lg 0.371 -lg 0.168)/lg 24）取1.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養(yǎng)基,37 C 200rpm圖四 大腸桿菌生長曲

14、線（取1.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37 C 200rpm） 這是大腸桿菌培養(yǎng)的最適調(diào)節(jié)，可以看出其生長良好，調(diào)整期較短，對數(shù)期較長。計算代時：取培養(yǎng) 2小時到3小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，to ti=lh Wi=0.148W2=0.362代時G =(lgW2 -lgW1)/lg20.775h(lg 0.362 -lg 0.148)/lg25）取3.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養(yǎng)基，37 C 200rpm圖五 大腸桿菌生長曲線 （取3.0ml大腸桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37 C 200rpm） 接種量的增加沒有產(chǎn)生太大的影響，生長曲線沒有太

15、大變化。計算代時：取培養(yǎng) 2小時到2.5小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 t!=0.5h Wi=0.218W2=0.334代時G =t2 7(lgW2 -lgWi)/lg20.5h(lg 0.334 -lg 0.218)/lg2=0.812h6）取5.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養(yǎng)基，37 C 200rpm圖六 大腸桿菌生長曲線（取 5.0ml大腸桿菌菌液接種到 100ml培養(yǎng)基，37 C200rpm）3小時出現(xiàn)了一次明顯的波動，應該是測量過程中沒有搖勻的結果，忽略它之后，這條生長曲線屬于正常形態(tài)，比較前兩天生長曲線，發(fā)現(xiàn)5mL得到的最大OD反而減小了，說

16、明在一定量的培養(yǎng)基下，初始接種量對最后結果影響不大。最大OD應該是受到了最初添加培養(yǎng)基的影響。計算代時：取培養(yǎng)由代時計算公式,1小時到2小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。t2 t1=1h W1=0.067W2=0.235代時G =上2 7(lgW2 -lgWJ/lg21h(lg 0.235-lg 0.067)/lg 2=0.552h37 C 200rpmEdoorip常®lt冊把Qo代時G二上2 (lgW2 -lgWi)/lg21h(lg 0.246 -lg 0.176)/lg 2= 1.108h8）取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基,30 C 200rpm7）取1.0

17、ml枯早桿菌接種到 100ml培養(yǎng)基，圖七 枯草桿菌生長曲線 （取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37 C 200rpm） 枯草桿菌的生長曲線包含了調(diào)整期、對數(shù)期和很小一部分穩(wěn)定期，雖然穩(wěn)定期很短，但是已經(jīng)可以看出停止生長的趨勢，說明枯草桿菌的代時較長。計算代時：取培養(yǎng) 3小時到4小時之間的數(shù)據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 ti=lh Wi=0.176W2=0.246圖八 枯草桿菌生長曲線 （取1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，30 C 200rpm） 溫度降低后，生長變得緩慢了，最后達到的最大OD也更小了，代時加長。計算代時：取培養(yǎng) 4小時到5小時之間的數(shù)

18、據(jù)（對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 ti=1h Wi=0.158W2=0.248代時G二t2 7(lgW2 -lgWi)/lg21h(lg 0.248 -lg 0.158)/lg2=1.537h9）取1.0ml枯草桿菌接種到 100ml培養(yǎng)基，37 C 110rpm圖九 枯草桿菌生長曲線（取 1.0ml枯草桿菌接種到100ml培養(yǎng)基，37 C 110rpm）OD值明顯偏小，所7、8小時左右細4小時時，似乎由對數(shù)期進入了穩(wěn)定期，但是對比前兩組數(shù)據(jù)，此時的以分析，可能此時突然有外因影響，使細胞進入了調(diào)整期，可以看到后來 菌又有增長趨勢。計算代時：取培養(yǎng) 2.5小時到3小時之間的數(shù)據(jù)（

19、對數(shù)生長期）來計算代時。由代時計算公式，t2 t1=1h W1=0.123W2=0.223代時G =七2(lgW2 -lgWi)/lg20.5h(lg 0.223-lg 0.123)/lg2=0.582h3. 發(fā)酵結束pH對照組pH=7.5實驗結束后所有瓶 pH均小于6.4pH全部降低，說明大腸桿菌和枯草桿菌發(fā)酵均產(chǎn)生了酸。4. 分析表二不同環(huán)境和菌種生長比較培養(yǎng)菌接種量培養(yǎng)溫度/ c搖床 轉(zhuǎn)速/rpm生長曲線狀態(tài)代時/min調(diào)整期/h對數(shù)期/h穩(wěn)定期OD取8小時OD大腸桿 菌單菌落37200430.45328.51.0mL37110 :130.37249.41.0mL30200230.596

20、52.51.0mL37200130.43046.53.0mL37200 1120.41948.75.0mL37200120.41133.1枯草桿 菌1.0mL37200260.67866.530200 :350.61592.237110130.34534.91）接種量對微生物的影響：預期：接種量大，調(diào)整期縮短，對數(shù)期增長，穩(wěn)定期OD增大，代時縮短。原因：接種量大的細胞基數(shù)大，因而更快適應環(huán)境。實際：調(diào)整期影響不大，對數(shù)期稍有縮短，穩(wěn)定期OD減小，代時規(guī)律不明顯。分析：生長曲線受各種因素調(diào)節(jié)，這里實驗結果不同于預期應該是受到培養(yǎng)基的限 制，接種量大對氧氣和原料需求更多，而且產(chǎn)生酸的速度也快，也許

21、對后來的細胞 生長造成了一定的影響。2）培養(yǎng)溫度對微生物的影響預期：最適溫度下細胞生長應該最快，調(diào)整期最短，穩(wěn)定期OD最大，代時最短原因：溫度影響細菌內(nèi)酶活力和細胞膜的通透性，進而影響新陳代謝，從而影響細 菌的生長繁殖。最適溫度下，細菌酶活性最強，因而能最快適應環(huán)境，并取得生長 增殖的最高效率。實際：大腸桿菌37C穩(wěn)定期OD最大，調(diào)整期更短，但代時更長?？莶輻U菌37C調(diào)整期更短，對數(shù)期更長，穩(wěn)定期 OD更大，代時更短。分析：大腸桿菌代時的問題應該來自實驗誤差，如取樣未搖勻、計算時取點不夠準 確，或?qū)嶒炦^程中某些操作導致生長和理論不一致。3）搖床轉(zhuǎn)速對微生物的影響預期：轉(zhuǎn)速高，調(diào)整期短，對數(shù)期長

22、，穩(wěn)定期 OD大，代時短 原因：轉(zhuǎn)速影響溶氧，溶氧高，生長情況應該越好 實際：大腸桿菌與預期符合；枯草桿菌轉(zhuǎn)速快的調(diào)整期長，代時長。分析：原因可能有兩點，一是枯草桿菌在溶氧高的環(huán)境下生長沒有那么好，說明它 是微好氧生物，但這與實際不符；二是其他條件限制，雖然說兩個培養(yǎng)瓶進行對照 要求其他條件一致，但是由于培養(yǎng)基分配及其其他各種原因，其他條件可能并不一致而且還產(chǎn)生了比對照條件還要大的影響。4）生長曲線分析兩個菌的生長曲線都包括了調(diào)整期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，實驗沒有進行到衰亡期因為 而沒有觀察到后來的 0D值下降。5）大腸桿菌和枯草桿菌比較大腸桿菌：代時要短一些，溫度對代時的影響比溶氧對代時的影響要大

23、，估計是因為溶液中細胞不多，所以溶氧的限制作用沒有溫度明顯?？莶輻U菌：代時較長，溶氧比溫度對代時的影響要大，但這也可能是實驗操作中其 他因素影響而得出的表觀結果。六、實驗小結這是一個大組合作、小組分工的實驗，每一組的結果都影響了整個大組隊結果的分析，這就要求我們的合作。 和暑期實驗不同，這次實驗在時間上縮短了，但是在內(nèi)容上卻增多了，由于有很多組的平行比較，所以得到的信息量也相應加大，這些信息中又包含了這種各樣的誤差，所以要求我們自己在處理別人的實驗結果中也加入自己的分析?？偟膩碚f，這是個很有意思也很有意義的實驗。七、思考1. 計算出大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基中對數(shù)生長期中的代時（min）（繁殖一代的時間），為什么比理論時間長好多？代時見表二。經(jīng)查資料得：大腸桿菌理論代時為37度時18分鐘，而枯草桿菌一般是給 30度下的理論代時為31分鐘，實驗測得代時長于理論值的原因：理論代時是在理想的培養(yǎng)條件下測得，糖分、氧氣等營養(yǎng)物質(zhì)供應充足，細菌生長狀況良好，之前的分裂次數(shù)較少。實際實驗條件與理論值條件存在差距。如培養(yǎng)過程中 不補料，營養(yǎng)物質(zhì)有限。單純的振蕩不能保證體系中有足夠的溶氧。對培養(yǎng)液的pH值,氧化還原電勢也未加控制，測量過程中溫度不能保持穩(wěn)定等等。2. 為什么可用比濁法來表示細菌的相對生長狀況？培養(yǎng)液的渾濁度與細菌的濃度與成正比，可