第六章 RECOMBINATION

1、第六章遺傳重組概述第一節(jié) 同源重組第二節(jié) 位點(diǎn)專一性重組第三節(jié) 轉(zhuǎn)座重組第四節(jié) 真核生物中的轉(zhuǎn)座成分第五節(jié) 異常重組概述： 只要有DNA，就會(huì)發(fā)生重組減數(shù)分裂高等Euk.體細(xì)胞核基因、葉綠體和線粒體溫和噬菌體轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 生存變異突變，重組損傷修復(fù)、適應(yīng)環(huán)境、加速進(jìn)化 廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過程 重組可分為四類（DNA序列、蛋白質(zhì)因子） 狹義遺傳重組：涉及到DNA分子內(nèi)斷裂-復(fù)合的基因交流 遺傳重組與重組DNA技術(shù)異常 DNA重組引起進(jìn)化 DNA重組引起DNA序列上的一些改變，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)。 DNA重組可修復(fù)DNA損傷或復(fù)制障礙。 進(jìn)行基因標(biāo)記，檢測(cè)突變基因位置和分離突變基

2、因。 掌握DNA重組機(jī)制為基因工程操作提供理論依據(jù)；同時(shí)，重組技術(shù)為研究基因重組開辟了新途徑。DNA重組意義第一節(jié) 同源重組真核生物姊妹染色單體的交換；細(xì)菌及某些低等真核生物的轉(zhuǎn)化；細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合。廣泛存在于生物界.1、 同源重組（homologous recombination）:發(fā)生在同源DNA序列之間一、特征2、 特征： 涉及同源序列間的聯(lián)會(huì)配對(duì)，且交換的片段較大 涉及DNA分子在特定的交換位點(diǎn)發(fā)生斷裂和錯(cuò)接的生化過程異源雙鏈區(qū)的生成 存在重組熱點(diǎn) 需要重組酶 單鏈DNA分子或單鏈DNA末端是交換發(fā)生的重要信號(hào) 維持生物種群的多樣性 染色體瞬間的物理連接，對(duì)染色體正確分離到子代細(xì)胞中至

3、關(guān)重要 用于損傷修復(fù)3、 同源重組的功能:1946年，Joshua Lederberg 和 Edward Tatum發(fā)現(xiàn)遺傳信息可以在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移a physical exchange of chromosome parts actually occursduring recombination在1961年，Matthew Meselson 和 J. J. Weigle 用實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩種不同遺傳類型的噬菌體共感染E. coli，發(fā)現(xiàn)子代噬菌體中發(fā)生了交換。真核生物的同源重組發(fā)生在減數(shù)分裂時(shí)，姐妹染色單體間遺傳物質(zhì)間的交換；聯(lián)會(huì)復(fù)合體將染色體排列在一起細(xì)菌的同源重組發(fā)生在接合過程中，交配的染色體在

4、兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞中轉(zhuǎn)移。單細(xì)胞內(nèi)在復(fù)制中和復(fù)制后的兩條同源染色體也可發(fā)生交換。重組修復(fù)中也發(fā)生同源重組。斷裂-復(fù)合中的概念 異源雙鏈（heteroduplex）：在重組部位，每個(gè)雙鏈中均有一段DNA鏈來(lái)自另一個(gè)雙鏈中的單鏈。這個(gè)部分稱為異源雙鏈（雜種DNA） 分支遷移：異源雙鏈交叉連接中，交叉點(diǎn)沿著兩條雙鏈移動(dòng)，稱為分支遷移（branch migration）。 Holliday結(jié)構(gòu)：兩個(gè)DNA分子交叉重組時(shí)，在連接處則形成一個(gè)“四螺旋”作為中間物。這種結(jié)構(gòu)稱為Holliday結(jié)構(gòu)（交叉結(jié)構(gòu)）。雙鏈侵入、單鏈侵入和雙鏈斷裂修復(fù)等均可形成Holliday結(jié)構(gòu)二、同源重組的機(jī)制1、斷裂復(fù)合（br

5、eakage and reunion）及Holliday中間體的形成同源重組中連接兩個(gè)DNA雙鏈的交換中間物含有4股DNA鏈，在連接處為了轉(zhuǎn)換配對(duì)所形成交叉鏈的連接點(diǎn)為 Holliday結(jié)構(gòu)形成的分子機(jī)制（斷裂復(fù)合起始機(jī)制）有雙鏈侵入模型、單鏈侵入模型、雙鏈斷裂修復(fù)模型等多種 同源重組都涉及到DNA分子內(nèi)的斷裂復(fù)合 Holliday結(jié)構(gòu) （Robin Holliday，1964 ）（1）55其中所有模型和假說(shuō)都包括切斷、鏈置換、連接等過程雙鏈侵入模型（2）3553Meselson-Radding模型單鏈入侵模型（鏈轉(zhuǎn)移模型）置換侵入Loop切除同化 異構(gòu)化 分支遷移5切割雙鏈斷裂（Double

6、 stranded breaks（DBS）修復(fù)模型2、分枝遷移和Holliday結(jié)構(gòu)的拆分 分枝遷移（branch migaration）雙螺旋形成的交叉連接以拉鏈?zhǔn)叫?yīng)擴(kuò)散Holliday的異構(gòu)化產(chǎn)生重組體的拆分Holliday結(jié)構(gòu)一經(jīng)生成即可不斷地處于異構(gòu)化異源雙鏈heteroduplex DNA重組結(jié)果取決于拆分時(shí)配對(duì)鏈上的切口位置（1）（2） Holliday結(jié)構(gòu)的拆分（1）產(chǎn)生含異源雙鏈的親本DNA分子（2）產(chǎn)生重組體“親本鏈”“重組體”The Holliday model for homologuous recomibination1、Holliday結(jié)構(gòu)可發(fā)生立體或空間重排，使得

7、作為“橋”的鏈（即連接兩條螺旋的交叉部分）轉(zhuǎn)變?yōu)椤巴獠俊辨?，而原?lái)的外部鏈則轉(zhuǎn)變?yōu)椤皹颉辨湣?、最后由核酸酶將交叉處切斷（解離resolution）而完成重組作用。這種異構(gòu)轉(zhuǎn)變可導(dǎo)致兩條子鏈發(fā)生雙重交換，或所有四條鏈發(fā)生單交換。三、原核同源重組（E.coli） 發(fā)生在雙方(DNA分子)DNA的同源區(qū)域部分復(fù)制的染色體DNA之間或染色體DNA與外源DNA之間細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)1、RecBCD（外切核酸酶）和 Chi 位點(diǎn) 具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性 單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈RecA的作用位點(diǎn) RecBC

8、D有固定切割位點(diǎn)RecBCD酶的傾向性位點(diǎn)為chi。在E. coli中每隔510kb有一個(gè)拷貝。chi由8個(gè)堿基組成的非對(duì)稱序列：5GCTGGTGG33CGACCACC53 RecBCD的識(shí)別和切割位點(diǎn)a、RecBCD結(jié)合在雙鏈DNA的平頭末端b、外切、解鏈、移動(dòng)（ATP）c、兔耳狀 loop 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生（解旋速度大于釋放ssDNA的速度二形成“Rabbit ears” ）d、RecBCD 在 loop 單鏈區(qū)的chi 位點(diǎn)3方46NT處切斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶） chi位點(diǎn)：GCTGGTGG目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點(diǎn)e、RecBCD 切割產(chǎn)生3單鏈末端當(dāng)RecBCD結(jié)合在DNAChi位點(diǎn)的3側(cè)時(shí)，它沿著D

9、NA向5移動(dòng)使DNA解旋，并降解帶有3端的單鏈。2、RecA 蛋白（1） 活性a、 RecA（MW38kD ）有單、雙鏈 DNA 結(jié)合活性b、 RecA有 NTPase 活性（底物差異活性）與單鏈 DNA 結(jié)合時(shí)活性最大-依賴于 DNAc、 RecA有啟動(dòng)一個(gè)分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子的能力，即聯(lián)會(huì)同源 DNA（但其靶 DNA 必須有缺口結(jié)合DNA）兩雙鏈中必須有一個(gè)DNA分子具單鏈區(qū)。其中一個(gè)DNA分子必須要有一個(gè)游離的3末端，同時(shí)單鏈區(qū)和具3端的DNA必須有互補(bǔ)區(qū)。在體外RecA引發(fā)的反應(yīng)可產(chǎn)生Holliday結(jié)構(gòu)RecA入侵單鏈被置換鏈RecA引發(fā)鏈侵入模型RecA啟動(dòng)的單鏈入侵（2

10、）RecA蛋白催化雙鏈和單鏈 DNA 的反應(yīng)階段a、 聯(lián)會(huì)前階段（緩慢）RecA與單鏈結(jié)合b、 單鏈與雙螺旋的互補(bǔ)鏈迅速配對(duì)，形成雙鏈連接分子Holliday（5侵入）c、 從雙螺旋結(jié)構(gòu)中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長(zhǎng)的異源雙鏈 DNA反應(yīng)結(jié)束時(shí)，RecA結(jié)合到雙鏈上 其中單鏈同化有固定的方向入侵單鏈為53雙鏈 DNA 的互補(bǔ)鏈?zhǔn)?53、原核同源重組的其它蛋白需要 E.coli 中三個(gè)基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的產(chǎn)物a、 RuvA識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)b、 RuvB 為分枝遷移提供動(dòng)力（ATPase 1020bp/s）c、 RuvC 核酸內(nèi)切酶-專一性識(shí)別 Hollida

11、y 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)體外切段連接點(diǎn)以拆分重組體4、-酵母MAT序列的轉(zhuǎn)換(mating)依賴同源重組的位點(diǎn)特異性的序列代換1）、 酵母結(jié)合型的轉(zhuǎn)變-DNA序列的代換，而不是互換-依賴于序列的同源性（被代換的序列命運(yùn)是被降解調(diào)-突變?cè)囼?yàn)）2）、同源序列W723723723匣子HMLMATMATaHMRaX704704704704Y747747642642Z1239239239239Z288888888total25012501236915853）、 轉(zhuǎn)換過程 內(nèi)切酶(HO)識(shí)別、切割-Y/Z1交界處-起始MAT序列的轉(zhuǎn)換(雙鏈斷裂)HM匣子受Sir阻遏蛋白的保護(hù) Y區(qū)域被降解，直到Y(jié) 和Ya相同的部

12、分或一直到X區(qū)域 四個(gè)斷頭侵入供體匣子的同源部分并與其中互補(bǔ)鏈配對(duì) 以供體DNA為模板復(fù)制Y區(qū)域，holliday結(jié)構(gòu)形成 Holliday結(jié)構(gòu)的拆分，產(chǎn)生新的MAT匣子和這次轉(zhuǎn)換中的供體匣子4）、 特征-同源重組和位點(diǎn)特異性重組特征都具有 需要大范圍的同源序列 需要重組酶系（rad52基因產(chǎn)物、位點(diǎn)特異性的HO內(nèi)切酶）第二節(jié) 位點(diǎn)專一性重組(site-specific recombination)一、位點(diǎn)專一性重組（ site-specific recombination）1、概念：發(fā)生在專一序列而順序極少相同的DNA分子間的重組噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體基因組2、特征： 在特定的結(jié)合序列

13、部位（DNA序列，通常1450bp，序列有的相同，有的不同） ，有專一的酶催化斷裂重接 -產(chǎn)生精確的DNA重排 都具有整合作用的兩個(gè)基本特征a、 典型的保守性重組-交換是相互的和保存原先的DNAb、發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌DNA短同源序列的專一性核苷酸上Euk. 中專一性抗體基因的重排 位點(diǎn)專一性重組是在細(xì)胞中特定的條件下發(fā)生的，它可參與某些蛋白質(zhì)的表達(dá)（如抗體基因），這種專一性的酶是被細(xì)胞中的調(diào)節(jié)因素引發(fā)的二、 phage的整合與切除1、實(shí)現(xiàn)機(jī)制：均是通過-細(xì)菌DNA和 DNA上特定位點(diǎn)之間的重組2、特定位點(diǎn)-附著位點(diǎn)（attachment siteatt）E.coliattB 含BOB三序列 2

14、3bp phage attP 含 POP三序列240bp核心序列 “O”完全一致（同源部分）-位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方B,B,P,P-臂3、整合過程 整合后的附著位點(diǎn)為attL（BOP）attR（POB） 整合位點(diǎn)-attB、attP切除位點(diǎn)-attL、attR 整合過程需要 整合酶（integrase Int）（ 編碼）和寄主的整合宿主因子IHF（integration host factor）共同作用溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌體的整合作用有兩個(gè)特點(diǎn)：這種交換是可逆的，原先存在的DNA順序全部被保存下來(lái)，并無(wú)丟失；噬菌體和細(xì)菌的DNA之間有一段很短的同源序列，重

15、組交換必須通過其中的一個(gè)特定的核苷酸。4、整合分子機(jī)制 核心序列O全長(zhǎng)15bp，富含A-T 發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點(diǎn)相距7bp attP位點(diǎn)的負(fù)超螺旋為重組所必須-加強(qiáng)了Int和IHF的親和力-高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的結(jié)構(gòu) 整合酶的結(jié)合位點(diǎn)：attP 240bp、attB 23bp(兩者的作用不同) Int結(jié)合(-DNA編碼的整合酶 integrase, int )-核心序列的反向位點(diǎn)（切割位置）-結(jié)合在att臂上（臂與核心區(qū)靠近）在噬菌體感染早期-DNA編碼的整合酶大量表達(dá)，因此，整合作用幾乎發(fā)生在每個(gè)被侵染的細(xì)胞中。整合過程需要整合酶和整合作用宿主因子（IHF，integratio

16、n host factor）:IHF是E.coli染色體DNA上himA和himD編碼的，由兩個(gè)亞基組成，MW：20KD。him突變阻止位點(diǎn)專一性重組的發(fā)生。intIHFXis 整合體及其作用整合體（intasome）-Int和IHF結(jié)合到attP時(shí)的復(fù)合物 整合體捕獲attB說(shuō)明-a、attB和attP的最初識(shí)別靠Int識(shí)別兩序列的能力b、兩序列的同源性在鏈交換時(shí)為重要因素 Int蛋白能切斷DNA，并使它重新連接，近而使holliday結(jié)構(gòu)拆分 重組時(shí)attP和attB部位交叉斷裂，互補(bǔ)單鏈末端進(jìn)行交叉雜交重組酶的4個(gè)亞基分別切開2條雙鏈DNA分子的每條單鏈完成重組。過程類似于拓?fù)洚悩?gòu)酶的作

17、用。酶的2個(gè)亞基的Tyr殘基分別進(jìn)攻DNA，形成DNA的3端以磷酸二酯鍵與Tyr相連，釋放出5-OH端。然后，每個(gè)位點(diǎn)的游離5-OH端進(jìn)攻另一位點(diǎn)的3-P-Tyr，產(chǎn)生Holliday連接。酶的另2個(gè)亞基重復(fù)此過程使Holliday結(jié)構(gòu)解離。位點(diǎn)特異性重組并非重疊單鏈末端的退火過程。實(shí)際上，每一個(gè)雙鏈上相對(duì)應(yīng)的鏈在同一個(gè)位置上被切開，雙鏈間交換游離的3末端。分支沿著同源區(qū)移動(dòng)7bp長(zhǎng)的距離，然后，互補(bǔ)的單鏈末端交互雜合，連接并完成整合過程。噬菌體DNA是環(huán)狀的，重組時(shí)被整合入細(xì)菌染色體中，成為線性序列。前噬菌體DNA的兩側(cè)成為兩個(gè)新的雜交att位點(diǎn)，左側(cè)稱為attL，由BOP組成；而右側(cè)為at

18、tR，由POB組成。5、整合與切除的控制（1） 整合 C-促使阻遏蛋白C的產(chǎn)生-與int gene 的PI結(jié)合，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Int蛋白-且PI位于xis基因內(nèi)，C與PI結(jié)合導(dǎo)致xis gene失活（2） 切除 寄主SOS反應(yīng)時(shí)-RecA大量產(chǎn)生，促使阻遏蛋白C的水解-把OL和OR從阻遏狀態(tài)釋放出來(lái)-從PL轉(zhuǎn)錄使int和xis表達(dá)第三節(jié) 轉(zhuǎn)座重組(transposon)一、轉(zhuǎn)座成分概述1、轉(zhuǎn)座子(元)或轉(zhuǎn)座元件(transposon or transposable element):基因組上不必借助于同源序列就可以移動(dòng)的DNA片段，它們可以直接從基因組的一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)（供體和受體）轉(zhuǎn)座（tr

19、ansposition）：轉(zhuǎn)座元的轉(zhuǎn)移過程（不十分確切）2、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes玉米果皮、糊粉層花斑突變玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理跳躍基因（jumping gene） 1951 冷泉港實(shí)驗(yàn)室（美） Barbara McClintock1980年獲諾貝爾獎(jiǎng)基因轉(zhuǎn)座現(xiàn)象的再次發(fā)現(xiàn)與證實(shí)直到1967年Shapiro才在E. coli中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座因子插入型極性突變的發(fā)現(xiàn)與機(jī)理Operon & Polarity Mutation極性突變的基本概念在一個(gè)操縱子中， 與操縱基因毗連的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生終止突變后，它除了影響該基因

20、本身產(chǎn)物的翻譯外，還影響其后結(jié)構(gòu)基因多肽的翻譯，并且具有極性梯度的特征。Shapiro在gal操縱子中發(fā)現(xiàn)一種極性突變。gal操縱子的galK、T、E基因分別編碼gal激酶（galactokinase, K）、gal轉(zhuǎn)移酶（galactose transferase, T）和gal表異構(gòu)酶（glactose epimerase, E）。Z 基因終止突變位點(diǎn)離O基因的距離IPOZYAA酶活性O(shè) genegalm有可能具有小片斷DNA的插入。就是插入序列1（insertionsequence1，IS1）。gal+/galm雜合雙鏈DNA的電鏡照片，出現(xiàn)了棒糖狀結(jié)構(gòu)分子雜交實(shí)驗(yàn)：將galm和密度梯度

21、離心實(shí)驗(yàn)：Jordon、Starlinger和 gal+進(jìn)行分子雜交，若有g(shù)almShapiro等分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，他們將含有g(shù)al+ 有額外片段則在電鏡下可觀察和galm(極性突變，即gal)噬菌體分別分離到它們的存在和所處的位置。出，同時(shí)加入到離心管中進(jìn)行密度梯度離心，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在雜交鏈上出現(xiàn)了一結(jié)果出現(xiàn)了兩條帶，galm的密度gal+,表明 個(gè)額外的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)800nt的a) 不依賴供體序列與靶位點(diǎn)間序列的同源性b) 轉(zhuǎn)座不是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制Hotspots (熱點(diǎn))Regional preference ( 在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入)d) 某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對(duì)同類轉(zhuǎn)座因子

22、的插入具有排他性（免疫性）e) 靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù)f) 轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組的特點(diǎn)c) 轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)（插入專一型）二、轉(zhuǎn)座子種類和結(jié)構(gòu)特征 兩種類型： 簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子（simple transposon）（插入序列 insertion sequence IS ）復(fù)合轉(zhuǎn)座子（composite transposon , Tn ） 共同特征：a）兩端有2040bp的IR(反向重復(fù)序列 inverted repetitive sequence, IR 或正向重復(fù)序列direct repeats, DR )b）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transpo

23、sase）的基因1、插入序列 最簡(jiǎn)單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分 命名： IS編號(hào)（鑒定類型）長(zhǎng)度 7002000bp 特點(diǎn)： a）兩端IR為轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)（突變）b）插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)的正向重復(fù)（39bp） IS 可以正反方向插入到DNA（宿主、質(zhì)?；蚰承┦删w），常對(duì)插入位點(diǎn)后面的基因表達(dá)功能產(chǎn)生極性效應(yīng)a) Tn / TnA familyl 具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、 調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因lTn1Tn3Tn5Tn7(AmpR)(AmpR)(KanR)(StrR TmpR)Tn2Tn4Tn6Tn9(AmpR)(AmpR StrR)(kanR)(CamR)Tn1

24、0 (TetR)2.5 kb20 kbTn3IRTnpA ResTnpRAmpRIR38bp38bp轉(zhuǎn)座酶regulator - 內(nèi)酰胺酶2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子 兩種類型b）兩端重復(fù)序列為IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子e.g. IS插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子ISISIS LISIS R臂中心區(qū)臂transposition 當(dāng)兩個(gè)IS組件相同時(shí)，其中任一個(gè)都可行使轉(zhuǎn)座功能 不同時(shí)，主要依靠一個(gè) 兩側(cè)的IS既可以是IR，又可以是DR狀態(tài)（IR多）U, S毒性蛋白attL, attR 與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需Gin G區(qū)倒位酶ABSUatt R150bp1.5kbG 倒位區(qū) 38kbC repress

25、or for A, BB 33 kd 與轉(zhuǎn)座有關(guān)A 70 kd 轉(zhuǎn)座酶P att L Cgin3 轉(zhuǎn)座噬菌體 Mu phage （巨型轉(zhuǎn)座子 ） 以E.coli為寄主的溫和型噬菌體（溶源、裂解） Mu的插入途徑a） 侵入的Mu在溶源化過程中任意插入寄主DNA（兩側(cè)各5bp的靶位點(diǎn)序列重復(fù)）b） 進(jìn)入裂解生長(zhǎng)后，復(fù)制產(chǎn)生后代Mu DNA幾乎全部插入寄主DNA中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座（形成寄主DNA和Mu的共合體），噬菌體成熟時(shí)，切段共合體包裝三、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)作機(jī)制及模式 三種類型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座（replicative transposition）模式 實(shí)質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件被復(fù)制并被移

26、動(dòng)到受體位點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)座過程擴(kuò)增了轉(zhuǎn)座子的拷貝（供、受點(diǎn)） 需兩種酶：轉(zhuǎn)作酶（作用于原拷貝兩末端）解離酶（作用于復(fù)制后的拷貝） 模式： 兩大步a) 共合體形成切口連接復(fù)制b) 拆分靶位點(diǎn)的DR形成2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式 供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂 供體位點(diǎn)如不能被修復(fù)則有致死效應(yīng)3、保守型轉(zhuǎn)座模式 另一種非復(fù)制型 與 整合機(jī)制相似其轉(zhuǎn)座酶與 整合酶家族有關(guān)4、TnA轉(zhuǎn)座模式 復(fù)制型轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座酶(tnpA)、解離酶(tnpR) 解離酶需要特異的內(nèi)部位點(diǎn)雙重功能：解離功能tnpA及自身的阻遏物 拆分位點(diǎn) res共合體拆分位點(diǎn) 轉(zhuǎn)座結(jié)果產(chǎn)生5bp的正向重復(fù)序列四、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座頻率的調(diào)控 每個(gè)轉(zhuǎn)座子控制自身轉(zhuǎn)座的

27、核心-控制轉(zhuǎn)座酶的水平不到一個(gè)轉(zhuǎn)座酶分子世代細(xì)胞1、Tn10轉(zhuǎn)座機(jī)制 Tn10為復(fù)合型轉(zhuǎn)座子 自發(fā)轉(zhuǎn)座頻率-107 IS10R元件提供轉(zhuǎn)座酶活性-合成轉(zhuǎn)座酶的序列 Tn10轉(zhuǎn)座酶水平是控制轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵 有兩種控制轉(zhuǎn)座的方式a） 通過反義RNA的翻譯水平控制 IS10R外側(cè)邊緣兩個(gè)啟動(dòng)子 PIN控制IS10R的轉(zhuǎn)錄弱啟動(dòng)子 POUT強(qiáng)啟動(dòng)子右向轉(zhuǎn)錄宿主DNA INRNA和OUTRNA有36bp的重疊穩(wěn)定性：OUTRNAINRNA 大量OUTRNA作為INRNA的反義RNAb） 甲基化作用控制轉(zhuǎn)座酶合成及其與DNA的結(jié)合 Tn10轉(zhuǎn)座酶啟動(dòng)子含有GATC序列（其它轉(zhuǎn)座子） E.coli中Dam甲基化

28、酶作用使啟動(dòng)子相對(duì)鈍化只能利用剛剛復(fù)制完成時(shí)出現(xiàn)少數(shù)轉(zhuǎn)座酶 此外，IS10R的末端IR也含有GATC，甲基化的GATC不能結(jié)合轉(zhuǎn)座酶 Tn10在DNA剛剛復(fù)制后發(fā)生轉(zhuǎn)座五、轉(zhuǎn)座子的某些遺傳學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)座引起插入突變?cè)斐刹迦胛稽c(diǎn)靶DNA的少量堿基對(duì)重復(fù)轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變切除效應(yīng)六、轉(zhuǎn)座子效應(yīng)的意義可使原來(lái)距離較遠(yuǎn)的基因組合在一起形成一個(gè)操縱子。將原來(lái)兩段分離的DNA序列連接在一起組成一個(gè)新蛋白的基因。啟動(dòng)子部位的插入，使基因打開或關(guān)閉。細(xì)胞中存在平衡轉(zhuǎn)座過程的途徑，避免轉(zhuǎn)座頻率過高對(duì)細(xì)胞的影響。轉(zhuǎn)座基因插入時(shí)，大多數(shù)受體基因被鈍化；但也有被活化的基因；轉(zhuǎn)座子有自己的啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)

29、座酶時(shí)，其它相鄰基因可被轉(zhuǎn)錄。第四節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)座成分玉米中的控制因子果蠅的P元件反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子酵母的Ty(transponson yeast )元件真核生物的轉(zhuǎn)座成分根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制目前分為兩類：a) 轉(zhuǎn)座機(jī)制與細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子類似遺傳信息： DNADNA 玉米的Ac-Ds元件、果蠅的P元件和FB元件等b) 轉(zhuǎn)作機(jī)制類似逆轉(zhuǎn)錄病毒遺傳信息： RNADNARNA 如：逆轉(zhuǎn)錄病毒、果蠅的copia元件、酵母的Ty元件在Ds-Ac系統(tǒng)中，大部分自主元件Ac的長(zhǎng)度有2.5kb，由含5個(gè)外顯子的單個(gè)基因組成，其產(chǎn)物是轉(zhuǎn)座酶，其末端有11bp的IR，在其靶DNA位點(diǎn)復(fù)制形成8bp的DR。各種Ds元件的長(zhǎng)度和序列

30、都不相同，末端同Ac一樣都有11bp的IR。Ds是Ac轉(zhuǎn)座子的缺失突變體，缺失的長(zhǎng)度不同。Ds9僅缺失194bp，Ds6缺失2.5kb，長(zhǎng)僅有2Kb，相當(dāng)于Ac兩端各1kb。自主性元件（autonomous elements）有切離和轉(zhuǎn)座的能力。由于自主元件的持續(xù)活性，它們可以插入到任何位點(diǎn)，產(chǎn)生一個(gè)不穩(wěn)定的或“可突變”（mutable）等位基因。自主元件本身的丟失就使可變的等位基因變成穩(wěn)定的等位基因。McClintock還發(fā)現(xiàn)了其他系統(tǒng)，這些元件的成員、類型和位置在各玉米品系中都是特異的。每個(gè)家族的成員可分為兩類：非自主性元件（nonautonomouselements）是穩(wěn)定的，自己不能轉(zhuǎn)

31、座。當(dāng)同一家族中的自主性元件存在于基因組中時(shí)，不論這自主元件位于何處都能使非自主元件具備轉(zhuǎn)座功能。同一家族的自主性元件能為非自主性元件的轉(zhuǎn)座提供反式作用因子（轉(zhuǎn)座酶），而不同家族間無(wú)此反應(yīng)。果蠅的P元件P轉(zhuǎn)座子引起雜交不育在不同組織中P元件可產(chǎn)生兩種蛋白：在體細(xì)胞中，僅前2個(gè)內(nèi)含子被剪接，產(chǎn)生了外顯子0、1和2編碼區(qū)，翻譯成66KD的蛋白，它是轉(zhuǎn)座激活的阻遏物。在生殖系統(tǒng)中，4個(gè)外顯子全部拼接在一起形成mRNA，它翻譯產(chǎn)生一個(gè)87KD的轉(zhuǎn)座酶。P轉(zhuǎn)座子的基因表達(dá)：P元件初始轉(zhuǎn)錄物有2.5kb或3.0kb兩種不同的長(zhǎng)度細(xì)胞質(zhì)因子對(duì)轉(zhuǎn)座的影響細(xì)胞質(zhì)因子的作用被稱為細(xì)胞型（cytotype）在含有P

32、元件的品系中有P細(xì)胞型，而缺少P元件品系具有M細(xì)胞型。細(xì)胞型的作用取決于66KD蛋白抑制轉(zhuǎn)座的能力。這個(gè)蛋白質(zhì)是卵中母系因子。在P品系中必須要有足夠的蛋白來(lái)抑制轉(zhuǎn)座的發(fā)生。含有P元件的雌果蠅與無(wú)論是否帶有P元件的雄果蠅雜交，由于P細(xì)胞型的存在抑制了轉(zhuǎn)座酶的合成或激活。但當(dāng)雌果蠅為M型時(shí)，在卵中無(wú)阻遏物，這樣導(dǎo)致了來(lái)自雄果蠅中的P元件使生殖細(xì)胞中轉(zhuǎn)座酶活化。P細(xì)胞型能對(duì)多代后代發(fā)揮作用，表明卵中必須要有足夠的阻遏蛋白，而且也要相當(dāng)穩(wěn)定，通過成體傳遞到下一代的卵中。反轉(zhuǎn)錄子（retroposons）/反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposons）gag編碼核心蛋白pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶env

33、編碼外殼蛋白病毒的RNA在末端有同向重復(fù)序列(Direct repeat)，緊挨5端的是80100nt的U5區(qū)。在3端前是1701350nt的U3區(qū)。DR片段在將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA時(shí)被用來(lái)產(chǎn)生大量的同向重復(fù)序列，這些重復(fù)序列能在線形DNA找到，在整合的形式DNA中兩端各缺少2bp，是由整合的機(jī)制造成的。DNA兩端序列 “U3-R-U5”，稱為L(zhǎng)TR（longterminal repeat，長(zhǎng)的末端重復(fù)序列）。U5的3端和U3的5端由一個(gè)短的IR(反向重復(fù)序列)組成, 。原病毒末端有短反向重復(fù)序列，其兩端有靶DNA的正向重復(fù)序列。病毒DNA的末端很重要，末端突變能阻止其整合。緊靠反向重復(fù)處存在二核苷酸CA(保守)。整合酶把線形DNA末端與一個(gè)核糖核蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合，并切除保守CA以后的堿基，把平末端轉(zhuǎn)變成凹末端。靶位點(diǎn)是隨機(jī)的，整合酶在靶位點(diǎn)上交錯(cuò)切口，靶DNA被切除的5端和病毒DNA的3凹陷末端共價(jià)連接。病毒DNA一條鏈的兩個(gè)末端先被連到靶DNA上，隨后單鏈區(qū)被宿主的酶所修復(fù)。酵母的Ty(transponson yeast )元件分散的DNA重復(fù)序列家族組成，在不同品系的酵母中它們所處的位點(diǎn)不同。轉(zhuǎn)座后在插入的Ty兩端靶基因產(chǎn)生5bp正向重復(fù)。Ty的轉(zhuǎn)座效率為10-710-8，低于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子。在不同Ty元件之間有很大的不同。大部分元件屬于兩個(gè)大家族。被稱為