gfp的簡介和應(yīng)用

1、GFP的簡介和應(yīng)用【摘要】源于多管水母屬等海洋無脊椎動物的綠色熒光蛋白( GFP),是一種極具應(yīng)用潛 力的標記物,有著極其廣泛的應(yīng)用前景.本文就GFP的理化性質(zhì)、熒光特性、改良以及它在科學研究中發(fā)揮的作用進行了綜述.【關(guān)鍵詞】綠色熒光蛋白( GFP)、標記物、熒光特性、進展、改良、應(yīng)用、干細胞移植 【正文】一、GFP的簡介1. GFP的理化性質(zhì),熒光特性及其改良1.1 GFP的理化性質(zhì)從水母體內(nèi)別離到的 GFP基因,長達,由3個外顯子組成,分別編碼 69、98和71個氨基酸. GFP本身是一種酸性,球狀,可溶性天然熒光蛋白.Aequoria GFP分子量約27X103, 一級結(jié)構(gòu)為一個由238

2、個氨基酸殘基組成的單鏈多肽；而Renilla GFP是分子量為54kD的同型二聚體.兩種GFP有不同的激發(fā)光譜,Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰, 肩峰為473 nm； Renilla GFP在498 nm具有強烈的光吸收,肩峰為 470 nm .兩種GFP含有相同的生色 團,發(fā)射光譜根本相同(Amax= 508 509 nm ).GFP性質(zhì)極其穩(wěn)定,易耐受高溫處理,甲醛固定和石蠟包埋不影響其熒光性質(zhì).其變性需在90 c或或pH>12.0的條件下用6mol/L鹽酸月瓜處理,一旦恢復中性環(huán)境,或去除變性劑, 雖然變性的蛋白質(zhì)并不能完全復性,但是復性蛋白質(zhì)同天然蛋白質(zhì)對

3、溫度、pH變化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的水平是相同的.更重要的是,它們在很大的pH范圍內(nèi)的吸收、發(fā)射光譜也是相同的.Renilla GFP的穩(wěn)定性就更為顯著.它在上述一系列的變性條件下都很穩(wěn)定,不易變性.根據(jù)Sheen等的研究,GFP在受體內(nèi)表達時,其穩(wěn)定性并不亞于CAT蛋白, 因而可以得到持續(xù)時間較長的熒光.1.2 GFP的熒光原理GFP的性質(zhì)和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性是同其生色團結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密不可分的.GFP表達后折疊,在氧存在的條件下, 使66位氨基酸殘基的“、3鍵間脫氫.由65 67位的氨基酸殘基(Ser- Tyr - Gly)環(huán)化為穩(wěn)定的對羥基苯咪口坐咻酮(4-p-hydroxybene-

4、5- imidazolinone ),形成生色團(基于組成生色團的元件不同,可將的GFP及其變種分為7種,每一種都有一組不同的熒光激發(fā)和發(fā)射波長 ).GFP無需再加任何底物和輔助因子,在紫外或藍光激發(fā)下就 能發(fā)熒光,在450 490nm藍光激發(fā)下,GFP熒光至少能保持10min以上,不像其他熒光素, 熒光容易淬滅.其中,GFP的一個引人注目的特點,其生色團的形成沒有物種的特異性.可以在譯后2 4h通過自動催化作用來合成. Cubitt等認為生色團自身環(huán)化的驅(qū)動力來自 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的形成,由此 Kolb等提出一個假說, 即環(huán)化在新合成的多肽的折疊過程中 進行.1.3 GFP的熒光性質(zhì)及應(yīng)用優(yōu)點

5、GFP的熒光性質(zhì)比較特殊,具有諸多優(yōu)點而備受關(guān)注.(1)易于檢測,靈敏度高.GFP熒光反響不需要外加底物和輔助因子,只需紫外光或藍光激發(fā),即可發(fā)出綠色熒光,用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到.其次,即便是未經(jīng)純化的 GFP發(fā)射的綠光也是相當強的,在正常室內(nèi)光線下仍清楚可辨.對于單細胞水平的表達也可識別.(2)熒光性質(zhì)穩(wěn)定.GFP對光漂白(一種熒光衰減現(xiàn)象)有較強的耐受性,能耐受長時間的光照,從而延長了 可探測時間； GFP在pH7 12范圍內(nèi)也能正常發(fā)光, 對高溫(70 C)、堿性、除垢劑、鹽、 有機溶劑和大多數(shù)普通酶都有較強抗性.(3)對細胞無毒害.從目前的研究結(jié)果來看,GFP對生活的細胞根本

6、無毒害,與目的基因融合后,對目的基因的結(jié)構(gòu)功能沒有影響,轉(zhuǎn)化后細胞仍可連續(xù)傳代.(4)構(gòu)建載體方便.由于編碼GFP的基因序列很短,所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒,而不至于使 質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率.(5)可直接用于活細胞測定.GFP是能在異源細胞內(nèi)表達后,能自發(fā)產(chǎn)生熒光的蛋白,并且GFP的分子量較小,N-端和C-端都能忍受蛋白的融合,是理想的標記物,可進行活細胞實時定位觀察,更能接近自然 真實的狀態(tài).如在活細胞中直接觀察蛋白向細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運動的狀態(tài),還可實時觀察到 外界信號刺激下,目的蛋白的變化過程,借助熒光顯微鏡觀察,使研究更為方便.使用激光共聚焦顯微鏡,其圖像效果更佳,結(jié)合現(xiàn)代的計

7、算機軟件,可進行三維顯示.(6)不受假陽性干擾.由于其他生物本身不含有 GFP,因此不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,GFP作為分子探針可以代替熒光染料,防止由于染料擴散造成的定位不準,使結(jié)果真實可靠.(7)廣譜性.表現(xiàn)在GFP的表達幾乎不受種屬范圍的限制,在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達,其次是GFP沒有細胞種類和位置上的限制,在各個部位都可以表達發(fā)出熒光.(8)易于得到突變體.如GFP中氨基酸的替換可產(chǎn)生不同光譜特性的突變體,且增強了熒光強度,適合在不同物種中專性表達.1.4 GFP的改良盡管GFP作為報告基因或分子探針有許多無可比較的優(yōu)點,但是野生型GFP (wtGFP)具有一定的缺點：如 G

8、FP有兩個激發(fā)峰影響了其特異性,并且長波激發(fā)峰強度較小,不易觀察；GFP合成及折疊產(chǎn)生熒光的過程慢,蛋白質(zhì)折疊受溫度影響大,表達量較低；而且在某些植物細胞中并不表達.這些都限制了進一步的應(yīng)用,所以,一些研究人員運用定點突變、DNA- shuffling 等技術(shù)對GFP進行了改良,獲得了熒光光譜、量子產(chǎn)率、溶解性、密碼子嗜性、溫度敏感性等改變的多種突變體,擴大了GFP的應(yīng)用范圍.2. GFP的應(yīng)用GFP的應(yīng)用主要集中在利用其熒光性質(zhì)的根底上作為一種標記物.2.1 GFP在分子生物學上的應(yīng)用2.1.1 GFP作為報告基因報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的DNA ,如傳統(tǒng)的熒光素酶(LUX)基

9、因和3 -葡萄糖昔酶(GUS)基因.GFP作為基因報告可用來檢測轉(zhuǎn)基因效率,把GFP基因連接到目的基因的啟動子之后,通過測定GFP的熒光強度就可以對該基因的表達水平進行檢測.目前,此方法無論在農(nóng)桿菌介導或基因槍介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化中還是在活細胞、轉(zhuǎn)基因胚胎和動物中都已得到非常廣泛的應(yīng)用,特別是在活細胞基因表達的時空成像方面.2.1.2 GFP作為融合標簽GFP最成功的一類應(yīng)用就是把 GFP作為標簽融合到主體蛋白中來檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用,或者靶向標記某些細胞器.在多數(shù)情況下,GFP基因在N-或C-末端與異源基因用常規(guī)的分子生物學手段就可以接合構(gòu)成編碼融合蛋白的嵌

10、合基因,其表達產(chǎn)物既保持了外源蛋白的生物活性,又表現(xiàn)出與天然GFP相似的熒光特性.GFP的這種特性為蛋白質(zhì)提供了一種熒光標記,不僅可以檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移,還可以研究蛋白質(zhì)分子的相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化,并依靠熒光共振能量轉(zhuǎn)移即FRET來進行檢測.2.2 作為生物傳感器2.2.1 檢測 pH野生型GFP和其許多突變體都具有依賴于 pH的熒光變化,因而可以被用來檢測活細胞內(nèi)的 pH.人們通常稱它們?yōu)?Phluprin .分為兩類：比率 Phluorin和盈缺Phluorin .當pH降低時, 比率Phluorin的最大激發(fā)波長從395 nm至i475 nm遷移,利用兩個最大波長處的熒光強

11、度的 比率可以測量pH;當pH值小于6時,盈缺Phluorin在475nm處沒有熒光.當pH回復到中性 時,兩類Phluorin都會在20 ms內(nèi)復原.Hanson等在2002年就設(shè)計了一系列 GFP突變體 deGFP ,作為雙波長比率測量的 pH探針,用于細胞內(nèi)檢測.2.2.2 檢測鹵素離子YFP (H148Q)變體不但對pH敏感而且對不同離子也同樣敏感,故可以用來檢測亞細胞結(jié) 構(gòu)中鹵素離子的濃度和傳遞.2.2.3 其他檢測應(yīng)用另外,GFP可以應(yīng)用于檢測電位、氧化復原水平以及在信號轉(zhuǎn)導中作為Ca2+指示劑.2.3 GFP在細胞生物學上的應(yīng)用GFP具有同宿主蛋白構(gòu)成融合子的性質(zhì),利用這一性質(zhì),

12、可以將GFP定位到特定的細胞器和膜系統(tǒng)中,進行細胞生理過程、細胞動力學等的實時觀測,或直接應(yīng)用于定量分析.目前,GFP已經(jīng)被成功地用于靶向標記包括細胞核、線粒體、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等在內(nèi)的細胞器.用 GFP進行亞細胞定位,防止了提純蛋白、標記異硫氟酸熒光素等熒光染料、經(jīng)顯微注射或 其他方式導入細胞的復雜方法,從而使研究蛋白在活細胞的準確定位變得簡單易行.2.4 GFP在篩選方面的應(yīng)用2.4.1 GFP用于細胞的篩選基于GFP的熒光特性,并且熒光穩(wěn)定以及檢測方法快速、方便,GFP在細胞篩選上得到應(yīng)用廣泛.Yuk等使用GFP作為標記能快速篩選出在生長抑制環(huán)境下,仍能保持重組蛋白大量表達的CHO細胞.2.

13、4.2 GFP用于藥物的篩選利用GFP對目的物進行標記,追蹤 GFP,分析目的物在細胞中的變化情況,如酶分子分布 狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化,從而篩選出與體內(nèi)信號分子功能相似的化合物.二、GFP的應(yīng)用綠色熒光蛋白標記在干細胞移植中的應(yīng)用綠色熒光蛋白標記具有很多優(yōu)點,因而被廣泛應(yīng)用于干細胞移植的研究領(lǐng)域.目前,常用的綠色熒光蛋白標記干細胞的方式有3種：質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染、病毒載體轉(zhuǎn)染和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物.綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有操作簡便、對干細胞的免疫源性和毒性小等優(yōu)點,但不十分穩(wěn)定,容易喪失；病毒載體的優(yōu)勢是表達高效穩(wěn)定,但存在免疫反響和致癌性等平安隱患；從綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物別離得

14、到的干細胞標記穩(wěn)定,無上述缺點,是最為理想的選擇.目前,綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因在小動物中較為成熟,如綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠,而在大鼠等稍大動物中不十分成熟.綠色熒光蛋白標記的干細胞移植后在體內(nèi)的分布情況可在熒光顯微鏡下直接觀察到,結(jié)合使用定量聚合酶鏈反響、激光共聚焦和熒光激活細胞分類計數(shù)等技術(shù)方法,還可監(jiān)測移植干細胞在體內(nèi)的分化增生情況以及其在各組織的含量等.分別簡述如下： 1.1監(jiān)測移植干細胞在體內(nèi)的分布情況關(guān)云謙等用質(zhì)粒pEGFP-NI轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細胞后,移植入活體大鼠紋狀體內(nèi).直至移植后 21 d,大鼠腦內(nèi)可見大量綠色熒光蛋白陽性的移植細胞,說明綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化胚胎干細胞是移植示蹤的較

15、好方法；而 Zhou等將pEGFP-N1質(zhì)粒標記神經(jīng)干細胞后移植到 PD大鼠 的紋狀體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的神經(jīng)干細胞可存活,并向致傷的腦組織定向遷移和集聚.Asano等人用免疫缺陷病毒載體將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染到凍猴胚胎干細胞,然后將干細胞移植到發(fā)育中的凍猴胚胎中.移植后1個月和3個月,采用針對綠色熒光蛋白的定量聚合酶鏈反響和原位聚合酶鏈反響, 發(fā)現(xiàn)移植的胚胎細胞廣泛地分布在凍猴胚胎各組織內(nèi).Yagi等從綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠別離培養(yǎng)了造血干細胞,然后將其移植到Twither小鼠一種腦部脫髓鞘損傷動物模型腦部.移植后一定時間,熒光顯微鏡下可有效地監(jiān)測移植細胞的分布情況, 他們發(fā)現(xiàn)移植的細胞遍布整個

16、腦部,但在脫髓鞘區(qū)較多. 類似的,Hill等將從綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠別離的骨髓移植到大腦中動脈閉塞的小鼠腦內(nèi)后,可發(fā)現(xiàn)在缺血的腦組織區(qū)域有大量的綠色熒光蛋白陽性細胞集聚.1.2 定量移植干細胞在體內(nèi)各組織的含量Devine等將綠色熒光蛋白反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)靜脈移植到亞致死劑 量射線照射的狒狒和正常狒狒體內(nèi),聯(lián)合使用熒光激活細胞分類計數(shù)法、針對綠色熒光蛋白序列的定量聚合酶鏈反響等方法,他們發(fā)現(xiàn)移植的骨髓間充質(zhì)干細胞可廣泛地分布到各組織；但和正常狒狒相比,移植到放射損傷狒狒體內(nèi)的細胞可相對較多地分布到骨髓和胃腸道等放 射敏感器官.基質(zhì)細胞源性細胞因子-1與其受體CXCR4之間

17、的相互關(guān)系在造血干細胞歸巢和發(fā)動入血中發(fā)揮重要作用,Kahn等構(gòu)建了人CXCR4-綠色熒光蛋白的融合蛋白慢病毒表達載體,然后采用針對綠色熒光進行熒光激活細胞分類計數(shù)定量分析轉(zhuǎn)染此載體的造血干細 胞移植后在骨髓和脾臟中的含量.結(jié)果說明,轉(zhuǎn)染此載體的造血干細胞在骨髓和脾臟中的含 量明顯高于沒有轉(zhuǎn)染的造血干細胞.1.3 檢測移植干細胞在體內(nèi)的分化情況通常是通過熒光組織化學輔以激光共聚焦顯微鏡觀察,或結(jié)合使用非熒光免疫組織化學和熒光顯微鏡觀察實現(xiàn).采用這種方法,人們發(fā)現(xiàn),移植的骨髓細胞或骨髓間充質(zhì)干細胞可分化 為肝細胞、肺臟上皮細胞、纖維成肌細胞和腎小管上皮細胞、腎小球細胞和腎小球系膜細胞, 參與損傷組織的修復；而移植的神經(jīng)干細胞可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,從而促進損傷的神經(jīng)功能恢復.1.4 分析干細胞移植后的基因和蛋白表達變化激光捕獲顯微切割技術(shù)是 1996年由美國國立衛(wèi)生研究院提出的在顯微鏡下從組織切片中分 離、純化單一類型細胞群或單個細胞的技術(shù),其工作的根本原理和過程是： 在高倍顯微鏡下,觀察520 dm厚的組織切片,并依據(jù)細胞或組織形態(tài)學特征、免疫組化表型,來選擇感興 趣的細胞,然后按壓與顯微鏡相連的激光器按紐,激光源發(fā)出一束激光被激光對應(yīng)局部的透明乙烯乙酸乙烯酯膜吸收,溫度迅速升至90 C左右并融化,并在激光脈沖結(jié)束 200ms內(nèi)瞬間冷卻,與靶細胞結(jié)合,