發(fā)酵工藝控制——氧對發(fā)酵的影響及控制

1、發(fā)酵工藝控制氧對發(fā)酵的影響及控制錄入時間:2010-8-13 9:26:18 來源：青島海博微生物工程    在好氧深層培養(yǎng)中，氧氣的供應往往是發(fā)酵能否成功的重要限制因素之一。通氣效率的改進可減少空氣的使用量，從而減少泡沫的形成和雜菌污染的機會。 一、溶解氧對發(fā)酵的影響    溶氧是需氧發(fā)酵控制最重要的參數(shù)之一。由于氧在水中的溶解度很小，在發(fā)酵液中的溶解度亦如此，因此，需要不斷通風和攪拌，才能滿足不同發(fā)酵過程對氧的需求。溶氧的大小對菌體生長和產(chǎn)物的形成及產(chǎn)量都會產(chǎn)生不同的影響。如谷氨酸發(fā)酵，供氧不足時，谷氨酸積累就會明顯降低

2、，產(chǎn)生大量乳酸和琥珀酸。        需氧發(fā)酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧高雖然有利于菌體生長和產(chǎn)物合成，但溶氧太大有時反而抑制產(chǎn)物的形成。因為，為避免發(fā)酵處于限氧條件下，需要考查每一種發(fā)酵產(chǎn)物的臨界氧濃度和最適氧濃度，并使發(fā)酵過程保持在最適濃度。最適溶氧濃度的大小與菌體和產(chǎn)物合成代謝的特性有關(guān)，這是由實驗來確定的。根據(jù)發(fā)酵需氧要求不同可分為三類：第一類有谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸，它們在菌體呼吸充足的條件下，產(chǎn)量才最大，如果供氧不足，氨基酸合成就會受到強烈的抑制，大量積累乳酸和琥珀酸；第二類，包括異亮氨

3、酸、賴氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸，即天冬氨酸系氨基酸，供氧充足可得最高產(chǎn)量，但供氧受限，產(chǎn)量受影響并不明顯；第三類，有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，僅在供氧受限、細胞呼吸受抑制時，才能獲得最大量的氨基酸，如果供氧充足，產(chǎn)物形成反而受到抑制。     氨基酸合成的需氧程度產(chǎn)生上述差別的原因，是由它們的生物合成途徑不同所引起的，不同的代謝途徑產(chǎn)生不同數(shù)量的NAD(P)H，當然再氧化所需要的溶氧量也不同。第一類氨基酸是經(jīng)過乙醛酸循環(huán)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系統(tǒng)兩個途徑形成的，產(chǎn)生的NADH量最多。因此NADH氧化再生的需氧量為最多，供氧愈多，合成氨基酸當然亦愈順利。第二

4、類的合成途徑是產(chǎn)生NADH的乙醛酸循環(huán)或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系統(tǒng)，產(chǎn)生的NADH量不多，因而與供氧量關(guān)系不明顯。第三類，如苯丙氨酸的合成，并不經(jīng)TCA循環(huán)，NADH產(chǎn)量很少，過量供氧，反而起到抑制作用。肌苷發(fā)酵也有類似的結(jié)果。由此可知，供氧大小是與產(chǎn)物的生物合成途徑有關(guān)。    在抗生素發(fā)酵過程中，菌體的生長階段和產(chǎn)物合成階段都有一個臨界氧濃度，分別為C臨和C臨。兩者的關(guān)系有：大致相同；C臨C臨C臨C臨。 二、微生物對氧的需求    好氧微生物生長和代謝均需要氧氣，因此供氧必須滿足微生物在不同階段的需要，在不同

5、的環(huán)境條件下，各種不同的微生物的吸氧量或呼吸強度是不同的。微生物的吸氧量常用呼吸強度和攝氧率兩種方法來表示，呼吸強度是指單位質(zhì)量的干菌體在單位時間內(nèi)所吸取的氧量，以QO2，表示，單位為mmolO2(g干菌體h)。當氧成為限制性條件時，比耗氧速率為：QO2=(QO2)mCL/（K0+CL）(QO2)m -最大比耗氧速度,mol /(kg.s) K0 -氧的米氏常數(shù),mol /m3CL- 溶解氧的濃度， mol /m3 攝氧率是指單位體積培養(yǎng)液在單位時間內(nèi)的耗氧量，以r表示，單位為mmolO2(Lh)。呼吸強度可以表示微生物的相對吸氧量，但是，當培養(yǎng)液中有固體成分存在時，對測定有困難，這

6、時可用攝氧率來表示。微生物在發(fā)酵過程中的攝氧率取決于微生物的呼吸強度和單位體積菌體濃度。 微生物的比耗氧速率的大小受多種因素影響，當培養(yǎng)基中不存在其他限制性基質(zhì)時，比耗氧速率隨溶氧濃度增加而增加，直至某一點，比耗氧速率不再隨溶氧濃度的增加而增加，此時的溶氧濃度稱為呼吸臨界氧濃度(criticaloxygenconcentrationOf respiration)，以Ccr表示。呼吸臨界溶氧濃度一般指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度，如對產(chǎn)物形成而言便稱為產(chǎn)物合成的呼吸臨界氧濃度。     當不存在其他限制性基質(zhì)時，溶解氧濃度高于臨界值，細胞的比

7、耗氧速率保持恒定；在臨界氧濃度以下，微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降，細胞處于半?yún)挌鉅顟B(tài)，代謝活動受到阻礙。培養(yǎng)液中維持微生物呼吸和代謝所需的氧保持供氧與耗氧的平衡，才能滿足微生物對氧的利用。由此可知，只有使溶氧濃度大于其臨界氧濃度時，才能維持菌體的最大的比耗氧速率，以使菌體得到最大的合成量。但由于發(fā)酵的目的是為了得到發(fā)酵的產(chǎn)物，因此，由氧饑餓而引起的細胞代謝干擾，可能對形成某些產(chǎn)物是有利的。所以，需氧發(fā)酵并不是溶氧愈大愈好。即使是一些專性好氧菌，過高的溶氧對生長可能不利。氧的有害作用是通過形成新生O，超氧化物基O2-和過氧化物基O22-或羥基自由基OH-，破壞許多細胞組分體現(xiàn)的。有

8、些帶巰基的酶對高濃度的氧敏感，好氣微生物曾發(fā)展一些機制，如形成觸酶，過氧化物酶和超氧化物歧化酶，使其免遭氧的摧毀。溶氧高雖然有利于菌體生長和產(chǎn)物合成，溶氧太大有時反而抑制產(chǎn)物的形成。為避免發(fā)酵處于限氧條件下，需要考查每一種發(fā)酵產(chǎn)物的臨界氧濃度和最適氧濃度，并使發(fā)酵過程保持在最適濃度。最適濃度的大小與菌體和產(chǎn)物合成代謝的特性有關(guān)，這是由實驗來確定的。發(fā)酵生產(chǎn)中，供氧的多少應根據(jù)不同的菌種、發(fā)酵條件和發(fā)酵階段等具體情況決定。     例如谷氨酸發(fā)酵在菌體生長期，希望糖的消耗最大限度地用于合成菌體，而在谷氨酸生成期，則希望糖的消耗最大限度地用于合成谷氨酸。因此

9、，在菌體生長期，供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量，即r=Qo2c(X)，若菌體的需氧量得不到滿足，則菌體呼吸受到抑制，而抑制生長，引起乳酸等副產(chǎn)物的積累，菌體收率降低。但是供氧并非越大越好，當供氧滿足菌體需要，菌體的生長速率達最大值，如果再提高供氧，不但不能促進生長，造成浪費，而且由于高氧水平抑制生長。同時高氧水平下生長的菌體不能有效地產(chǎn)生谷氨酸。 三、影響微生物需氧量的因素       在需氧微生物發(fā)酵過程中影響微生物需氧量的因素很多，除了和菌體本身的遺轉(zhuǎn)特性有關(guān)外，還和下列一些因素有關(guān)： 1培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分和濃度對產(chǎn)生菌的

10、需氧量的影響是顯著的。培養(yǎng)基中碳源的種類和濃度對微生物的需氧量的影響尤其顯著。一般來說，碳源在一定范圍內(nèi)，需氧量隨碳源濃度的增加而增加。在補料分批發(fā)酵過程中，菌種的需氧量隨補入的碳源濃度而變化，一般補料后，攝氧率均呈現(xiàn)不同程度的增大。 2、菌齡及細胞濃度    不同的生產(chǎn)菌種，其需氧量各異。同一菌種的不同生長階段，其需氧量也不同。般說，菌體處于對數(shù)生長階段的呼吸強度較高，生長階段的攝氧率大于產(chǎn)物合成期的攝氧率。在分批發(fā)酵過程中，攝氧率在對數(shù)期后期達到最大值。因此認為培養(yǎng)液的攝氧率達最高時，表明培養(yǎng)液中菌體濃度達到了最大值。 3、培養(yǎng)液中溶解氧濃

11、度的影響在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)液中的溶解氧濃度(CL)高于菌體生長的臨界氧濃度(C長臨)時，菌體的呼吸就不受影響，菌體的各種代謝活動不受干擾；如果培養(yǎng)液中的CL低于C長臨時，菌體的多種生化代謝就要受到影響，嚴重時會產(chǎn)生不可逆的抑制菌體生長和產(chǎn)物合成的現(xiàn)象。 4、培養(yǎng)條件  若干實驗表明，微生物呼吸強度的臨界值除受到培養(yǎng)基組成的影響外，還與培養(yǎng)液的pH、溫度等培養(yǎng)條件相關(guān)。一般說，溫度愈高，營養(yǎng)成分愈豐富，其呼吸強度的臨界值也相應增高。 5、有毒產(chǎn)物的形成及積累    在發(fā)酵過程中，有時會產(chǎn)生一些對菌體生長有毒性的如CO2等代謝產(chǎn)物，如不能

12、及時從培養(yǎng)液中排除，勢必影響菌體的呼吸，進而影響菌體的代謝活動。 6、揮發(fā)性中間產(chǎn)物的損失在糖代謝過程中，有時會產(chǎn)生一些揮發(fā)性的有機酸，它們隨著大量通氣而損失，從而影響菌體的呼吸代謝。 四、氧在發(fā)酵液中的傳遞1、氧的傳遞阻力在需氧發(fā)酵過程中，氣態(tài)氧必須先溶解于培養(yǎng)基中，然后才可能傳遞至細胞表面，再經(jīng)過簡單的擴散作用進入細胞內(nèi)的呼吸酶的位置上而被利用，參與菌體內(nèi)的氧化等生物化學反應。氧的這一系列傳遞過程需要克服供氧方面和需氧方面的各種阻力才能完成。 2、氧的傳遞方程式（1）雙膜理論微生物發(fā)酵中，通入發(fā)酵罐內(nèi)的空氣中含有的氧不斷溶解于培養(yǎng)液中，以供菌體細胞代謝之需。氧

13、從氣相傳遞到液相，是氣一液相間氧的傳遞過程，在這一傳遞過程中，氣液界面的阻力1/KI可以忽略，液體主流中的傳遞阻力1/KLB很小也可忽略，此時主要的傳遞阻力存在于氣膜和液膜中。對于這種傳遞過程的描述，應用最廣的是雙膜理論。這個理論假定在氣泡和包圍著氣泡的液體之間存在著界面，在界面的氣泡一側(cè)存在著一層氣膜，在界面液體一側(cè)存在著一層液膜，氣膜內(nèi)的氣體分子與液膜中的液體分子都處于層流狀態(tài)，分子之間無對流運動，因此氧分子只能以擴散方式，即借助于濃度差而透過雙膜，另外，氣泡內(nèi)除氣膜以外的氣體分子處于對流狀態(tài)，稱為氣流主體，在空氣主流空間的任一點氧分子的濃度相同，液流主體亦如此。（一）影響氧傳質(zhì)推動力的因

14、素要想增加氧傳遞的推動力(C*一CL)，就必須設(shè)法提高C*或降低CL。1、提高飽和溶氧濃度C*的方法A、溫度：降低溫度B、溶液的性質(zhì)：一般來說，發(fā)酵液中溶質(zhì)含量越高，氧的溶解度越小。C、氧分壓：在系統(tǒng)總壓力小于0.5MPa時，氧在溶液中的溶解度只與氧的分壓成直線關(guān)系。氣相中氧濃度增加，溶液中氧濃度也增加。想提高C*就得降低培養(yǎng)溫度或降低培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的含量，或提高發(fā)酵罐內(nèi)的氧分壓(即提高罐壓)。這幾種方法的實施均有較大的局限性。已知發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)濃度是依據(jù)生產(chǎn)菌種的生理特性和生物合成代謝產(chǎn)物的需要而確定的，不可任意改動。但有時分批發(fā)酵的中后期，由于發(fā)酵液粘度太大，補入部分滅菌水來降低

15、發(fā)酵液的表觀粘度，改善通氣效果。采用提高氧分壓的方法，一是提高發(fā)酵罐壓力，二是向發(fā)酵液通入純氧氣。提高罐壓會減小氣泡體積，減少了氣液接觸面積，影響氧的傳遞速率，降低氧的溶解度。影響菌體的呼吸強度，同時增加設(shè)備負擔。通人純氧能顯著提高CL，但此利方法既不經(jīng)濟又不安全，同時易出現(xiàn)微生物的氧中毒現(xiàn)象。 （2）、降低發(fā)酵液中的CL降低發(fā)酵液中的CL，可采取減少通氣量或降低攪拌轉(zhuǎn)速等方式來降低KLa，使發(fā)酵液中的CL降低。但是，發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的CL不能低于C臨界，否則就會影響微生物的呼吸。目前發(fā)酵所采用的設(shè)備，其供氧能力已成為限制許多產(chǎn)物合成的主要因素之一，故此種方法亦不理想。 

16、（二）、影響液相體積氧傳遞系數(shù)KLa的因素經(jīng)過長時間的研究和生產(chǎn)實踐證實，影響發(fā)酵設(shè)備的KLa的主要因素有攪拌效率、空氣流速、發(fā)酵液的物理化學性質(zhì)、泡沫狀態(tài)、空氣分布器形狀和發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)等。實驗測出的KLa與攪拌效率、通氣速度、發(fā)酵液理化性質(zhì)等的關(guān)系可用下述的經(jīng)驗式表示：    KLa=K (PV) (VS)(app)-)   式中  PV單位體積發(fā)酵液實際消耗的功率(指通氣情況下，kWm3)；  VS空氣直線速度，mh；app發(fā)酵液表觀粘度，(kg·s)m；、指數(shù)，與攪拌器和空氣分布器的形式等有關(guān)。 

17、K經(jīng)驗常數(shù)。 1、攪拌效率對KLa的影響發(fā)酵罐內(nèi)裝配攪拌器的作用有：使發(fā)酵罐內(nèi)的溫度和營養(yǎng)物質(zhì)濃度均一，使組成發(fā)酵液的三相系統(tǒng)充分混合；把引入發(fā)酵液中的空氣分散成小氣泡，增加了氣液接觸面積，提高KLa值；強化發(fā)酵液的湍流程度，降低氣泡周圍的液膜厚度和湍流中的流體的阻力，從而提高氧的轉(zhuǎn)移速率；減少菌絲結(jié)團，降低細胞壁周圍的液膜阻力，有利于菌體對氧的吸收，同時可盡快排除細胞代謝產(chǎn)生的“廢氣”和“廢物”，有利于細胞的代謝活動。應提出的是如果攪拌速度快，由于剪切速度增大，茵絲體會受到損傷，影響菌絲體的正常代謝，同時浪費能源。  2、空氣流速KLa隨空氣流速的增加而增加，指數(shù)約為0.

18、40.72，隨攪拌器形式而異。但當空氣流速過大時，攪拌器就出現(xiàn)“氣泛”現(xiàn)象，KLa不再增加?！皻夥骸爆F(xiàn)象指的是在特定條件下，通人發(fā)酵罐內(nèi)的空氣流速達某一值時，使攪拌功率下降，當空氣流速再增加時，攪拌功率不再下降，此時的空氣流速稱為“氣泛點”(Floodingpoint)。帶攪拌器的發(fā)酵罐的氣泛點，主要與攪拌葉的形式、攪拌器的直徑和轉(zhuǎn)速、空氣線速度等相關(guān)。對一定設(shè)備而言，空氣流速與空氣流量之間呈正相關(guān)性?？諝饬髁康母淖儽厝灰鹂諝饬魉俚淖兓?。已知空氣流速的變化會引起體積氧傳遞系數(shù)KLa的改變，當空氣流速達氣泛點時，KLa不再增加。這樣，空氣流量的變化也會改變KLa，當空氣流量達某一值時，KLa也

19、不再增加，如圖7-5所示。所以，在發(fā)酵過程中應控制空氣流速(或流量)，使攪拌軸附近的液面處沒有大氣泡逸出。 攪拌功率和空氣流速對KLa的影響，實驗測出攪拌功率對抗生素產(chǎn)率的影響遠大于空氣流速。高攪拌轉(zhuǎn)速，不僅使通人罐內(nèi)的空氣得以充分的分散，增加氣液接觸面積，而且還可以延長空氣在罐內(nèi)的停留時間?？樟魉龠^大，不利于空氣在罐內(nèi)的分散與停留，同時導致發(fā)酵液濃縮，影響氧的傳遞。但空氣流速過低，因代謝產(chǎn)生的廢氣不能及時排除等原因，也會影響氧的傳遞。因此，要提高發(fā)酵罐的供氧能力，采用提高攪拌功率，適當降低空氣流速，是一種有效的方法。 3、發(fā)酵液理化性質(zhì)的影響KLa與發(fā)酵液的表觀粘度app

20、呈反比。說明發(fā)酵液的流變學性質(zhì)是影響KLa的主要因素之一。發(fā)酵液是由營養(yǎng)物質(zhì)、生長的菌體細胞和代謝產(chǎn)物組成的。由于微生物的生長和多種代謝作用使發(fā)酵液的組成不斷地發(fā)生變化，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、菌體濃度、菌絲形態(tài)和某些代謝產(chǎn)物的合成都能引起發(fā)酵液粘度的變化，致使發(fā)酵過程中的發(fā)酵液呈現(xiàn)多種流變學性質(zhì)。 以淀粉作碳源的培養(yǎng)基屬于非牛頓型流體，在發(fā)酵過程中，隨著微生物的生長和代謝作用，其流變學性質(zhì)不斷變化。如生產(chǎn)金霉素時，以淀粉作碳源，接種時，培養(yǎng)基呈平漢塑性流體性質(zhì)，發(fā)酵至22小時，由于微生物的代謝作用，發(fā)酵液粘度降至很低(低于18Pa·s)，呈現(xiàn)牛頓型流體性質(zhì)。22小時起由于菌絲體濃

21、度不斷增加，則發(fā)酵液粘度逐漸增大，直至粘度達90Pa·s、表現(xiàn)為漲塑性流體的性質(zhì)。  發(fā)酵過程中菌體濃度和形態(tài)在氧的傳遞速率方面顯示一定影響。許多細菌和酵母菌發(fā)酵時，發(fā)酵液粘度低，呈現(xiàn)牛頓型流體性質(zhì)，對氧的轉(zhuǎn)移沒有什么影響。霉菌和放線菌發(fā)酵液多數(shù)時間屬于非牛頓型流體，粘度較大，對氧的轉(zhuǎn)移有較大影響。在單細胞和絲狀菌發(fā)酵中，對數(shù)生長期兩者的氧吸收速率是相同的，但在溶解氧濃度受到限制的條件下，達到平衡期，單細胞發(fā)酵液的氧吸收速率無變化，而絲狀菌發(fā)酵液的氧吸收速率卻顯著下降，其原因是絲狀菌發(fā)酵液的菌體濃度增加，使發(fā)酵液粘度不斷增大，致使KLa值降低，進而導致菌體的氧吸收速率下降。在青霉素發(fā)酵中，由于菌絲體濃度的不斷增加，使發(fā)酵液粘度不斷增大，KLa卻隨之下降。 在沉沒培養(yǎng)過程中，由于攪拌的作用，有的菌體(尤其是霉菌)形成不連續(xù)的球狀體，有的形成交替的絲狀體。一般說，球狀體發(fā)酵液粘度低，呈現(xiàn)牛頓