APPPS1阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠白質(zhì)異常特點(diǎn)及其與腦內(nèi)淀粉要點(diǎn)

1、APP/PS1阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠白質(zhì)異常特點(diǎn)及其 與腦內(nèi)淀粉樣病變之間關(guān)系的研究研究背景與目的阿爾茨海默?。ˋD）是一種高發(fā)病率的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾 病，臨床上以逐漸進(jìn)展且不可逆轉(zhuǎn)的行為和認(rèn)知障礙為特點(diǎn)。在AD進(jìn)展過程中腦內(nèi)病理學(xué)改變主要涉及2個(gè)方面：細(xì)胞外淀粉樣蛋白B （A B ）沉積形成的老 年斑和細(xì)胞內(nèi) tau 蛋白積聚形成的神經(jīng)纖維纏繞并最終促進(jìn)細(xì)胞骨架的破壞、分解。目前AD的研究大部分是以一個(gè)重要的生理病理學(xué)假設(shè)所引導(dǎo)的，即所謂 的“淀粉樣蛋白瀑布學(xué)說”，該假說認(rèn)為 AB在腦內(nèi)的沉積在AD疾病發(fā)生發(fā)展 過程中扮演了一個(gè)最主要的角色，AB的沉積決定了腦內(nèi)其他病理學(xué)改變的發(fā) 生（如：突觸

2、和神經(jīng)元的死亡） ，并且最終導(dǎo)致了癡呆的臨床階段。其中最支持淀粉樣蛋白瀑布學(xué)說的依據(jù)來源于對(duì)早發(fā)性家族性AD疾病的研究，早發(fā)性家族性AD與不同的基因突變有關(guān)：淀粉樣蛋白前體蛋白基因（APP）和早老素1&2基因（PS1和PS2）,他們均與AB的生物合成有關(guān)。這些基因的機(jī)能障礙被認(rèn)為導(dǎo) 致APP代謝的異常從而最終導(dǎo)致 AB過多產(chǎn)生。在表達(dá)突變的一個(gè)或幾個(gè)上述 基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中，我們觀察到 AB產(chǎn)生的增加和腦實(shí)質(zhì)中淀粉樣斑塊的沉 積，這些小鼠隨后還出現(xiàn)了神經(jīng)病理學(xué)的改變以及模擬AD表型的行為學(xué)的異常改變。到目前為止，無論是在 AD病人還是AD疾病動(dòng)物模型中，腦內(nèi)AB的沉 積對(duì)臨床癡呆癥狀的

3、確切影響還沒有找到直接的證據(jù)。臨床病理學(xué)相關(guān)分析已經(jīng)得到了 一些有希望的結(jié)論：形成斑塊之前的可溶性 A B集合現(xiàn)在被認(rèn)為是最 具有毒性的，相反，積聚的不溶性 AB集合致病性較弱。除此之外，AB的沉 積和腦功能障礙的關(guān)系可能是間接的，他們被中間的神經(jīng)病理學(xué)改變所調(diào)控。例如，AD病人腦內(nèi)存在白質(zhì)的異常，推測與腦-血管的異常相關(guān)，在模擬腦內(nèi) 淀粉樣改變的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，我們不僅能通過傳統(tǒng)的神經(jīng)病理學(xué)檢測，而且能在體通過高新技術(shù)，如擴(kuò)散增強(qiáng)成像技術(shù)，觀察到該轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)也存在白質(zhì)的損害。最近有學(xué)者提出：白質(zhì)缺陷可能是AD很重要的診斷性生物標(biāo)記物。白質(zhì)改變所帶來的后果是顯而易見的：神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的斷開，隨之

4、而來纖維的丟失，最終導(dǎo)致皮層機(jī)能的紊亂；中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的崩解通過改變動(dòng)作電位傳播以及增加腦能量的輸出，對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)有致命的影響。白質(zhì)異?？赡芊从沉溯S突的丟失，也可能是脫髓鞘，并且確切地區(qū)分這兩種過程十分困難。已有報(bào)道表明，AD病人不僅有軸突密度的下降，同時(shí)也存在髓鞘的崩解。從 A3 物模型的實(shí)驗(yàn)研究，可以明確地推出腦內(nèi)AB的沉積可導(dǎo)致軸突的病理改變，這一點(diǎn)為聯(lián)系腦內(nèi)術(shù)期淀粉樣改變和行為認(rèn)知障礙之間架起了一座橋梁。在本研究中，我們利用APFYPS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步評(píng)價(jià)了 AD轉(zhuǎn)基因小鼠白質(zhì) 的完整性。月并脹體和前聯(lián)合在 AD病人中有很大的改變，因此我們選擇這兩個(gè)區(qū) 域作為白質(zhì)的代表區(qū)域，通過

5、神經(jīng)纖維絲免疫組織化學(xué)染色分析了該區(qū)的軸突密度，通過氯化金染色評(píng)價(jià)了髓鞘的完整性；并且我們觀察了APP PS1 小鼠白質(zhì)的年齡相關(guān)的異常改變特點(diǎn)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了這些異常改變和腦內(nèi)淀粉樣改變之間的關(guān)系。方法1對(duì)Schmuedg化金髓鞘染色進(jìn)行了一些改動(dòng)，并且采用該 方法對(duì)不同年齡組大鼠的髓鞘染色進(jìn)行定量分析，以及通過對(duì)不同表型小鼠的髓鞘染色進(jìn)行定性分析。 2 相鄰的APP PS1 小鼠腦組織片分別采用氯化金髓鞘染色和抗神經(jīng)微絲軸突染色，取胼胝體和前聯(lián)合作為白質(zhì)染色的代表區(qū)域，分別測量了代表區(qū)域平均吸光度值 ROD定量分析比較了該區(qū)域不同表型以及不同年齡小鼠之間髓鞘密度和軸突密度改變情況。 3 細(xì)胞

6、外淀粉樣蛋白沉積采用標(biāo)準(zhǔn)的剛果紅染色觀察。采用基于計(jì)算機(jī)閾值方法，利用軟件自動(dòng)挑選有斑塊的地方，根據(jù)Delesse 原則計(jì)算剛果紅染色區(qū)域占腦組織總面積的百分比，從而計(jì)算出淀粉樣蛋白的含量。全腦、皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)以及兩個(gè)白質(zhì)代表區(qū)域的淀 粉樣蛋白含量分別通過上述方法計(jì)算得出；然后分別對(duì)全腦和兩個(gè)白質(zhì)代表區(qū) 域的淀粉樣蛋白含量與該區(qū)域髓鞘密度、軸突密度以及代表區(qū)域面積大小進(jìn)行 了相關(guān)性分析。4細(xì)胞內(nèi)淀粉樣蛋白通過4G8抗體進(jìn)行染色，對(duì)陽性染色進(jìn)行 了半定量分析，其結(jié)果與前腦胼胝體面積大小進(jìn)行相關(guān)性分析。 5 神經(jīng)元退行 性變的評(píng)價(jià)采用Fluoro-Jade B 染料染色方法，其結(jié)果與髓鞘以及軸突密度改

7、變進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果1 新生 7d 大鼠髓鞘化染色陰性，21d 大鼠的髓鞘化程度比14d大鼠的髓鞘化程度明顯增高。APFYPS1組小鼠可觀察到病理性髓鞘 染色，定量分析顯示其目標(biāo)區(qū)域相對(duì)光密度值 (RODX氐于PS1組，APFYPS1組 存在明顯的脫髓鞘改變。 2 在腦組織冠狀位切片上，氯化金髓鞘染色可以比較 精確地確定胼胝體的輪廓，特別是將胼胝體與其周圍相鄰的白質(zhì)纖維分開( 例如：扣帶回、背側(cè)穹窿、背側(cè)海馬聯(lián)合纖維) 變得十分便捷；同時(shí)，胼胝體側(cè)邊的邊緣和外囊的界限通過纖維不同方向走形達(dá)到區(qū)別。前聯(lián)合在腦組織冠狀位切片上很容易識(shí)別。3APP/PS1小鼠纖維束體積的異常改變在2月齡小鼠 組，

8、APP/PS1小鼠的前聯(lián)合大小和PS1組小鼠的前聯(lián)合大小是相當(dāng)?shù)?t(13)=- 0.58, p>0.05);相反，APP/PS1組小鼠月并月氐體大小比PS1組顯著地減少了 (t(13)=3.501 , p<0.005)。月荊！體不同亞區(qū)分析顯示，州氐體的減小主要集中 在嘴部(t(13)=3.743 , p< 0.005) 0隨著年齡的增長，PS1對(duì)照組白質(zhì)體積有顯 著地增加(月荊！體：t(12)=3.858 , p< 0.005;前聯(lián)合：t(12)=4.275 , p< 0.005)。然而，在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠這種現(xiàn)象并不存在。月并月氐體大小在2月齡和24

9、月齡之間是相當(dāng)?shù)?t(12)=1.850 , p>0.05),并且前聯(lián)合的表面積隨著 年齡的增長不斷地萎縮(t(12)=2.284 , p< 0.05)。老年組APP/ PS1小鼠前聯(lián)合 (t(11)=6.388 , p<0.0001)和月并月氐體(月并月氐體總：t(11)=4.653 , p<0.001 ;月并 月氐體嘴部：t(11)=5.404 , p< 0.0005)比老年組PS1組小鼠前聯(lián)合和月并月氐體有顯 著地縮小。但是，在老年組月并月氐體后部，PS1組和APP/PS1組之間沒有區(qū)別(t(11)=1.492 , p>0.05)。4老年組APP/PS

10、1小鼠軸突丟失突出：在 2月齡 小鼠，2組小鼠的軸突密度都是相當(dāng)?shù)?p >0.35)。隨著年齡的增長，無論是在 APFY PS1組還是PS1組，神經(jīng)微絲染色都有嚴(yán)重的下降(p< 0.0001),從月荊！ 體和前聯(lián)合的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)可以確定。然而，年齡相關(guān)的神經(jīng)纖維染色的下降在老年組APP/PS1比老年組PS1組更加突出(p <0.0001)。5老年組APP/ PS1 小鼠異常的髓鞘染色定量分析：在 2月齡組小鼠，氯化金染色的 RO8析顯示 PS1組和APP/PS1組的髓鞘密度是相當(dāng)?shù)?月荊！體：t(13)=0.318 , p>0.05; 前聯(lián)合：t(13)=1.277 ,

11、p>0.05)。前聯(lián)合的髓鞘化程度并沒有隨著年齡的影響 而有所下降(PS1： t(12)=1.292 , p>0.05; APPxPS1 t(12)=0.556 , p> 0.05),因此在24月齡PS1組和APP/PS1組的前聯(lián)合處髓鞘化密度是相當(dāng)?shù)?(t(11)=0.679 , p>0.05)。然而，24月齡PS1小鼠月并月氐體的髓鞘化程度比2月 齡PS1有增高(t(12)=2.823 , p<0.05),并且值得注意的是，隨著年齡的增 長，髓鞘化的程度主要發(fā)生在月并脹體的嘴部(t(12)=4.171 , p<0.005),而在月并 月氐體后部并不存在這

12、種情況(t(12)=0.461 , p>0.05)。和PS1小鼠相反，年齡 相關(guān)的月荊！體不斷髓鞘化過程并不存在于APP/PS1小鼠組(t(12)=0.7 , p>0.05),因此24月齡APP/PS1小鼠的髓鞘化染色比24月齡PS1小鼠有明顯的下降（總月并月氐體：t（11）=3.332 , p<0.01）;并且這種髓鞘染色的下降主要位于 朋®體的嘴部（t（11）=3.512 , p< 0.005） 0在朋®體后部PS1組和APP/PS1組 之間沒有區(qū)別（t（11）=1.9 , p>0.05）。6光學(xué)顯微鏡下，老年組 APPYPS1小 鼠異常的

13、髓鞘染色定性分析：髓鞘染色的定性分析檢測，在老年組APP/PS1小鼠，在大的髓鞘化纖維束，沒有明顯的髓鞘崩解；但是和PS1對(duì)照組小鼠比較,APP/PS1小鼠的新皮層和海馬區(qū)可以看到斷裂的髓鞘碎片，髓鞘物質(zhì)以小 的扭曲的片段存在，并且?guī)в小办o脈曲張樣改變”。這些形態(tài)學(xué)的異常（在年輕組APP/PS1小鼠組看不到）不僅出現(xiàn)在A0聚集的邊緣，在遠(yuǎn)離A0斑塊的腦 組織實(shí)質(zhì)中也可以看到。7全腦及皮層興趣區(qū)AB的含量和纖維束異常之間的 關(guān)聯(lián)分析在老年組APP/PS1組小鼠，定量測量了剛果紅陽性的集聚物（前聯(lián) 合：AB平均含量=2.8%,最小值=1.6%,最大值=6%;臍月氐體：AB平均含量 =2.2%,最小

14、值=1.6%,最大值=2.7%）。相關(guān)性分析表明，纖維束局部淀粉樣 蛋白含量和白質(zhì)異常（包括軸突密度的下降和脫髓鞘）并不存在關(guān)聯(lián)（所有的p> 0.111） 0而且，全腦或皮層的淀粉樣蛋白含量與月并月氐體和前聯(lián)合的大小之間也 都沒有關(guān)聯(lián)（所有的p>0.196）8腦內(nèi)皮質(zhì)V層細(xì)月fi內(nèi)AB的含量的半定量測 定和纖維束異常之間的關(guān)聯(lián)分析在年輕組 APP/PS1小鼠的前皮層，細(xì)胞內(nèi)AB 被半定量分析。和以往的觀察一致，通過 4G8抗體可以觀察到陽性的染色。細(xì) 胞內(nèi)AB主要存在于皮層V。盡管細(xì)胞內(nèi)AB水平在每個(gè)小鼠中半定量變化很 大（平均值=7.8;最小值=4.5;最大值11.5）,但是相關(guān)

15、性分析仍表明細(xì)胞內(nèi) AB含量與軸突和髓鞘密度改變之間沒有關(guān)聯(lián)（所有p>0.1119）。9APP/PS1 小鼠皮層變性神經(jīng)元采用Fluoro-Jade B染料觀察APFP/PS1小鼠神經(jīng)元退行性 變化。我們在研究動(dòng)物中并未發(fā)現(xiàn)陽性的神經(jīng)元染色。即使是在含有大量細(xì)胞 內(nèi)AB陽性皮層神經(jīng)元中，我們也未發(fā)現(xiàn)退行性變化的神經(jīng)元。僅僅在老年組 APP/PS1小鼠，我們看能觀察到淀粉樣沉積的核心以及圍繞在其周圍退行性變 化的神經(jīng)突和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)論：1改良的氯化金髓鞘染色快速、簡 單、敏感、穩(wěn)定，可進(jìn)行髓鞘化定性、定量分析。2利用氯化金髓鞘染色，可以較精確地勾畫月并月氐體的輪廓并且測量其大小。為月并月氐體大小的定量研究提供 了一個(gè)簡單而巧妙的方法。3老年組APPxPS1t腦纖維束存在著嚴(yán)重萎縮，其 發(fā)生不僅和軸突丟失有關(guān)，也和脫髓鞘有關(guān)。但APFYPS1小鼠嚴(yán)重的軸突丟失更加能解釋纖維束的萎縮。4無論是整個(gè)腦內(nèi)還是局部腦細(xì)胞外淀粉樣蛋白A0的含量