提RNA+逆轉(zhuǎn)錄+qRT-PCR步驟

1、【一、提RNA一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1、試劑：75%乙醇、Trizol、 進(jìn)口 EP管、氯仿、異丙醇、進(jìn)口槍頭（RNA專用）、2、配75%乙醇（DEPC水+無(wú)水乙醇）,放-20C冰箱預(yù)冷；3、預(yù)冷離心機(jī) EP管用的）；4、清潔桌面，酒精噴過(guò)之后擦干，新手套、兩層口罩；二、操作步驟：01、棄上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔PBS洗兩遍（不回收，直接倒去，隨后用 200 dL槍吸盡PBS）;03、每孔加500 dL Trizol,輕晃，隨后室溫放置2min左右；04、槍頭吹打，吸出放入進(jìn)口 EP管；05、加入100dL氯仿（即1/5體積的trizol）;06、4c離心機(jī)，12000g, 15mi

2、n；07、吸200 dL（可減少）上清放入新的 進(jìn)口 EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等體積異丙醇，充分混勻，常溫放置10-30min（15min）;09、4 c 離心機(jī)，12000g, 10min；10、倒掉液體，加入 1mL預(yù)冷的75%乙醇劇烈混勻；11、4 c 離心機(jī)，7500g, 5min；12、倒掉上清，加入 1mL預(yù)冷的75%乙醇，混勻；13、4 c 離心機(jī)，7500g, 5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾紙上，5-10min,用針頭或者200微升槍頭去掉管壁上的水珠；15、每管中加入 40科L（40 -60科L）的DEPC水，吹打溶解；16、測(cè)濃度（先知樓 21樓測(cè)R

3、NA濃度，帶DEPC水、滅菌的dd水、10微升槍和槍頭）；三、注意事項(xiàng)01、如果當(dāng)時(shí)不測(cè) RNA濃度，可暫時(shí)把 RNA放在-20 C冰箱。但長(zhǎng)時(shí)間（24h）保存，需要放02、異丙醇作用是沉淀 RNA,作用比乙醇好;03、04、05、06、07、08、09、【二、測(cè)RNA濃度】一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：01、先知樓21樓-2109教室，一個(gè)冰盒+DEPC7R+10微升槍、滅菌 dd H2O、10 dL槍頭（RNA專用卜本子+筆；二、操作步驟：01、登記；02、打開電腦=打開"N"軟件=點(diǎn)擊"Nucleic acid"=選擇"OK"=選擇"

4、RNA;03、滅菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPCK校零：即力口 DEPC水一滴，點(diǎn)擊“ Blank”，擦干；05、測(cè)RNA：加樣品一滴，點(diǎn)擊“measure”,擦干，隨后加下一個(gè)樣品；06、記錄數(shù)據(jù)，包括 RNA濃度（1000ng/科L）、260/280;07、滅菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；三、注意事項(xiàng)230nm代表有機(jī)物水平（碳水化合物），260nm代表RNA水平，280nm代表蛋白水平，260/230 表示有機(jī)物量，260/280代表RNA提取量；是核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，最佳測(cè)量值的范圍為。如果不在此范圍，稀釋或濃縮樣品，使 之在此范圍內(nèi)；如果吸光度小于，檢查是否

5、存在操作因素（如移液不準(zhǔn)確，樣品內(nèi)有懸浮物等） 影響。DNA樣品的A260吸光度值是否 。（請(qǐng)注意，這個(gè)值跟儀器無(wú)關(guān)，核酸的吸光度必需大 于，其值才有效和可靠，因?yàn)闃悠分械碾s質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會(huì)對(duì)光有一定吸收， 其值）；、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA的A260/A280比值為，純RNA為。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=相當(dāng)于50 %蛋白質(zhì)/DNA溶液.酚的最大吸收峰在 270nm。3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA和RNA的A260/A230

6、比值為。若比值小于 標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化本¥品。A230產(chǎn)生負(fù)值主要是由于在很低DNA濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導(dǎo)致的。在下一個(gè)測(cè)定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負(fù)值會(huì)被校正。4. A320nm或A340nm為檢測(cè)溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應(yīng)該接近。如果不是，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的A320 一般是0。5. A260/A280和A260/A230 是核酸純度的指示值。純度好的DNA或RNA,在 下A260 / A280的比值應(yīng)該在 或。純凈的樣品比值大于（ DNA）或者（RNA）。如果比值低于 或者，表示存

7、在蛋 白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（服鹽）等，較純凈的核酸 A260/A230的比值大于。當(dāng) BSA蛋白質(zhì)污染時(shí)， 蛋白污染會(huì)導(dǎo)致 260和280的數(shù) 值都下降，其凈結(jié)果是 260/280比值下降，但 260/280的比值變化并不顯著，正如分子克隆 3所說(shuō)。但蛋白殘留會(huì)導(dǎo)致230的數(shù)值顯著上升，顯著影響 260/230的比值。也就是說(shuō)，如果 RNA樣品的260/280=, 260 /230 =,那么就應(yīng)該考慮污染原因不是服鹽殘留，而是蛋白殘留 用分光 光度計(jì)測(cè)量 RNA時(shí)，用水而不是用 TE緩沖液稀釋 RNA樣品會(huì)造成 A260/A280比值下降。

8、原因 是低離子強(qiáng)度和低 pH溶液會(huì)增加280 nm處的光吸收值。加氯仿離心后取上清的時(shí)候千萬(wàn)不要貪多，那樣就很容易被蛋白污染，所以現(xiàn)在一般取400ul左右6. 當(dāng)260/2301時(shí)，只有兩種情況。一是月瓜鹽污染，二是蛋白污染?！救?、逆轉(zhuǎn)錄】一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：01、進(jìn)口 10 dL槍頭（qRT-PCR用）、冰盒一個(gè)、200 dL進(jìn)口 EP管；02、冰上融化1、2、4、2號(hào)試劑（提前半小時(shí)）；03、二、操作步驟：試劑盒：1.2dL2. L（最后加入）3. l L4. 科LRNA 1000ngDEPC 水10科l體系01、200 dL進(jìn)口管子：EP管加相應(yīng) DEPCK =力口 1號(hào)試齊1J （ 2L）=

9、力口 3號(hào)試齊WL）=力口 4號(hào)試齊IL）=加2號(hào)試齊IL）=動(dòng)口 RNA=漓心=上機(jī)；02、上機(jī)：OPEN=*擊"User"菜單下的"clx",點(diǎn)擊"Accept"=選擇"run"下面的到 “exp001 rt"=修改體系“10（1 L”（默認(rèn)為25微升）= 點(diǎn)擊"Start”,進(jìn)入界面；03、C 15min= C 5s= C 60min;04、4c冰箱保存；三、注意事項(xiàng)01、加液盡量無(wú)氣泡，槍不要打到底； 02、嚴(yán)格冰上操作，防止 RNA降解;【qRT-PCR一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：01、試齊【J:

10、Roche 的 SyBr Green(rox)02、 EP管、EP管、96 孔板/八連冠；10L、20L、100 dL、200 科 L、科L、1000 dL 槍;03、冰盒一個(gè)、 Rox化凍(避光)、引物化凍(GAPDH)、cDNA、DEPC水；二、操作步驟：01、Rox10 ；+ dd H2O6 科 L;+P1(F)1+P2(R)1+ cDNA 220科L體系02、計(jì)算：每個(gè)樣，X個(gè)抗體(至少包括GAPDH的參，還有目的)，三個(gè)副孔。即如果六個(gè)樣，2 個(gè)抗體(GAPDH,PLK1)三個(gè)副孔。6*1*3=18 =20(PLK1), 6*1*3=18= 20(GAPDH);12345678910

11、11126/6/5/5/56665554/4/4/3W32/2/2/1/1/1/444333222111PLK1Rox： 10*20=200 科 LDEPCtR : 6*20=120 科 LF: 1*20=20 科 LR: 1*20=20 科 LGAPDHRox： 10*20=200 科 LDEPCtR : 6*20=120 科 LF: 1*20=20 科 LR: 1*20=20 科 L03、稀釋 cDNA 10 倍(18L DEPC水 +2 W L)=酒已置 Mix(Rox+ DEPC水+F+R)=力咻¥ (一橫排先力口 18 dL mix(GAPDH),隨后加入 18 dL mi

12、x(PLK1隨后六個(gè)孔加同一個(gè)cDNA;06、去除氣泡：加好樣后，觀察有無(wú)氣泡。如果有氣泡，彈開，隨后 2000rpm離心，時(shí)間 不定(5s即可);07、上機(jī)+ 設(shè)置程序：A、雙擊打開程序 "StepOne Software "=點(diǎn)擊"OK "=點(diǎn)擊"Ignore & Continue Startup "=點(diǎn)擊"Advanced Setup "=進(jìn)入"Experment Properties 界面”;B、Experment Properties 界面：將 Expriment Name 從 Unti

13、tled 修改為“日期，如 2015-12-17”,將 User Name(Optional) 修改為“ CZL'；Which instrument are you using to run the experiment 中選擇 "96 wells ”, 一般無(wú)需 修改；What type of experiment do you want to setup 中選擇"Quantitation-Comparative(C)” ；Which reagents do you want to use to detect the target sequence 中選擇 &qu

14、ot;SYBR Green Reagents"Which ramp speed do you want to use in the instrument run 中選擇“Fast( 40 minutes to complete a run)”;C Plate Setup 界面-Define Targets and Samples 界面：Define Targets 欄中：如果有 GAPDH PLK1、Akt、PI3K三個(gè)引物，則點(diǎn)擊 “ Add NewTarget ”三下，出現(xiàn)"Target1 Target2、Target3、Target4"三個(gè)=將其重命名；De

15、fine Samples 欄中:如果有 6 個(gè)樣品(N;3;6;9;12),則點(diǎn)擊 “Add New Sample ”，出現(xiàn)"Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6"六個(gè)=將其重命名;Plate Setup 界面-Assign Targets and Samples 界面：GAPf1GAT1GAP/1GAT2GAF72GAF72GAF/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAF74Plk1/1Plk1/1Plk1/1Plk1/2Plk1/2Plk1/2Plk1/3Plk1/3Plk1/3Plk1/4Plk1/4Plk1/4Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt/3Akt/3Akt/4Akt/4Akt/4PI3K71PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K3PI3K/4PI3K/4PI3K4GAP5GAP5GAP/5GA*GAP6GAP6Plk1/5Plk1/5Plk1/5Plk1/6Plk1/6Plk1/6Akt/5Akt/5Akt/5Akt/6Akt/6Akt/6PI3K/5PI3K/5PI3K/5PI3K/6PI3K/6PI3K/6D、R