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文檔簡介

1、微生物快速檢測方法簡介微生物快速檢測方法簡介常見微生物檢測項目常見微生物檢測項目n常規(guī)微生物項目常規(guī)微生物項目 細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、霉菌及酵母菌n致病微生物項目致病微生物項目 沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等n傳統(tǒng)計數(shù)改良法傳統(tǒng)計數(shù)改良法1、培養(yǎng)膜法2、螺旋平板計數(shù)法:螺旋接種儀菌落計數(shù)3、濾膜法:常用于一些可過濾樣品的檢測n快速檢測的新方法快速檢測的新方法1、ATP生物熒光法2、電阻抗法3、顏色變化4、流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它:熱量法,放射測量法常規(guī)微生物檢測方法常規(guī)微生物檢測方法培養(yǎng)膜法培養(yǎng)

2、膜法_快速檢測紙片技術(shù)n原理 二片塑料膜構(gòu)成,上薄為蓋,下厚為培養(yǎng)基。采用的檢測原理:顯色培養(yǎng)基n操作方法:檢樣稀釋取1ml滴于下膜正中央蓋上膜擴(kuò)展器壓成20cm2圓圈 37培養(yǎng)24h 計數(shù)(顯色的斑點(diǎn))n顯色培養(yǎng)基(Chromogenic/Fluorogenic Culture Media)是一類利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色的原理來檢測微生物的新型培養(yǎng)基。n這些相應(yīng)的顯色底物是由產(chǎn)色基因和微生物部分可代謝物質(zhì)組成,在特異性酶作用下,游離出產(chǎn)色基因顯示一定顏色,直接觀察菌落顏色即可對菌種作出鑒定。它是一種新型分離培養(yǎng)基,利用顯色培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的篩選分離,其反應(yīng)的靈敏度和特

3、異性大大優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基。顯色培養(yǎng)基:a-清酒假絲酵母菌,b/e-光滑假絲酵母菌,c-白色假絲酵母菌d-熱帶假絲酵母菌f-克柔假絲酵母菌G-光滑假絲酵母菌培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)n優(yōu)點(diǎn):可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基??晒?jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時間、人力和費(fèi)用。因?yàn)橛酗@色劑和小方格,計數(shù)方便。節(jié)約稀釋的繁瑣動作??煽焖贉y試致病菌,節(jié)省大量的實(shí)驗(yàn)步驟。n缺點(diǎn)成本比傳統(tǒng)方法要稍高些。測試細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌時不能節(jié)約培養(yǎng)時間。培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)n應(yīng)用細(xì)菌總數(shù)測試片中含有一種紅色指示染劑,使所有菌落易認(rèn)別計數(shù)。大腸菌群 測試片中含有指示劑,使菌落為

4、紅色,且有氣泡產(chǎn)生。大腸桿菌指示劑可使所有菌落為紅色,并可留住大腸桿菌產(chǎn)生的氣泡。24小時可確定大腸桿菌數(shù)。霉菌和酵母菌計數(shù)測試片中加入的抗生素,可以抑制細(xì)菌生長;指示劑使酵母菌易認(rèn)別計數(shù);霉菌可產(chǎn)生特有的色澤。金黃色葡萄球菌使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應(yīng)片,核酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌,26小時可確認(rèn)結(jié)果。培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)螺旋平板法螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀自動菌落計數(shù)儀n原理原理 樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。 當(dāng)用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時,菌液體積減 少,注入的體積和瓊脂半徑間存在指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時菌

5、落 沿注液線生長。用一計數(shù)的方格來校準(zhǔn)與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量,計數(shù)每個區(qū)域的已知菌落數(shù),在計算細(xì)菌濃度。 螺旋平板法螺旋平板法平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍阿基米德螺旋型軌跡 螺旋平板法螺旋平板法螺旋接種法n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)與傳統(tǒng)方法相比,無需稀釋梯度,節(jié)省了大量人力物力。n缺點(diǎn)缺點(diǎn)培養(yǎng)時間并沒有縮短,菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時。需要配合自動菌落計數(shù)儀,否則人工計數(shù)更麻煩。螺旋平板法螺旋平板法濾膜法濾膜法n濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)靈敏度增大,菌落無擴(kuò)散情況,便于計數(shù)。n缺點(diǎn)缺點(diǎn) 需要額外的支出購買真空泵,多聯(lián)支架及一次性濾膜;如果抽濾過程空氣潔凈度不夠

6、,有可能造成二次污染,尤其是對菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品,如啤酒,澄清果汁,桶裝飲用水等。ATPATP生物熒光法生物熒光法n原理原理 ATP螢光素+螢光素酶+O2AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光n應(yīng)用應(yīng)用用于食品生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測。用于水質(zhì)檢測。改良后用于食品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗(yàn)。1010秒獲得結(jié)果秒獲得結(jié)果涂抹采樣涂抹采樣混合混合: :震蕩震蕩5s5s檢測檢測表面清潔度表面清潔度/水質(zhì)檢測水質(zhì)檢測ATPATP生物熒光法生物熒光法nATPATP法檢測成品的優(yōu)缺點(diǎn)法檢測成品的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):大大縮短庫存時間,減少物流壓力和成本。缺點(diǎn):ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑,對儀器

7、的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外,有存在假陰性的可能。ATPATP生物熒光法生物熒光法電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)n原理原理供細(xì)菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體,在特制的測量管底部裝入電極插頭,即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進(jìn)行檢測。 阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長過程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂類、蛋白質(zhì)等)被分解成小分子代謝物,即較小的帶電離子(乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等)這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集,增強(qiáng)了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能,從而降低了其阻抗值。M=(RM=(R0 0-R-RT T)/R)/R0 0100%100% 其中R0表示開始時培養(yǎng)基的阻抗值RT表示任意時刻培養(yǎng)

8、基的阻抗值M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分?jǐn)?shù)。電阻越小細(xì)菌活動越多,在一定范圍內(nèi),菌落形成單位的對數(shù)Log(CFU)與IDT(阻抗檢測時間)呈直線關(guān)系。電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)n優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn):電阻抗法較省力,樣品細(xì)菌數(shù)在418小時內(nèi)出結(jié)果。但對于菌數(shù)太低的不好,樣品中還不能用防腐劑,否則結(jié)果是亂七八糟的。電阻抗法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中工作量較大,但以后的檢測簡便的多,不需要一系列稀釋,只需樣品1ml,培養(yǎng)基9ml,測量管一只。電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)通過顏色變化檢測n微生物生長導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化,由光學(xué)檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化,記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時間。n與阻抗法

9、類似,可以實(shí)現(xiàn)快速檢測。n缺點(diǎn):需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基,應(yīng)用范圍受限制,成本高昂。梅里埃的梅里埃的BacT/AlertBacT/Alert微生物檢測儀微生物檢測儀基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多,底部的CO2傳感器變黃,由LED發(fā)射一束光至底部,探頭檢測反射光的強(qiáng)度。光強(qiáng)度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。流式細(xì)胞技術(shù) n原理原理液體樣品流過儀器中的激光照射的流動池,當(dāng)微生物流過顯微鏡聚焦的流動池時就能被自動地檢測到。n特點(diǎn)特點(diǎn)檢測方法與使用的儀器有高度的特異性,所以應(yīng)遵循生產(chǎn)廠商提供的方法。nFOSSFOSS公司公司BactoScan FCBactoScan FC牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀

10、牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀采用流式細(xì)胞原理。對微生物進(jìn)行核酸染色,用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行計數(shù)。優(yōu)點(diǎn):速度快(50-150樣品/小時)缺點(diǎn):死活細(xì)胞一起檢測,消耗成本較高,儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細(xì)菌總數(shù)。流式細(xì)胞技術(shù) n美國美國ChemunexChemunex公司微生物快速檢測系統(tǒng)公司微生物快速檢測系統(tǒng)將流式細(xì)胞技術(shù)與活細(xì)胞熒光探針標(biāo)記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合,推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。其最大的特點(diǎn)是只檢測活細(xì)胞數(shù),速度極快,處理量大。檢測步驟:1、過濾;2、標(biāo)記,直接對活細(xì)胞和酵母進(jìn)行標(biāo)記;3、激光

11、掃描。流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù) 三種型號的差異三種型號的差異產(chǎn) 品 型 號主 要 參 數(shù)總 活 菌 數(shù)酵 母 和 霉 菌 數(shù)大 腸 桿 菌 和 大 腸 菌 群賈 第 鞭 毛 蟲 和 隱 孢 子 蟲處 理 速 度靈 敏 度適 用 范 圍BactiflowChemScan RDIReal-time analyser D-count10-14/個 樣 品小 時100-100,000/g個 細(xì) 胞適 用 于 含 菌 量 較 高 的食 品 、 化 妝 品 及 水 等樣 品 。 每 天 檢 測 量 不大 于 個 樣 品 。40適 用 于 含 菌 量 較 低 的不 可 過 濾 的 食 品 、 化妝 品 等

12、樣 品 。 每 天 檢測 量 大 于 個 樣 品 。4090分 鐘 內(nèi) 出 定 量 結(jié) 果1-5000個 細(xì) 胞特 別 適 用 于 醫(yī) 藥 工 業(yè) 、 飲 用 水尤 其 是 直 飲 水 中 對 可 過 濾 的 樣品 進(jìn) 行 有 害 腸 道 菌 及 原 生 動 物進(jìn) 行 快 速 檢 測50/個 樣 品小 時1-1000cfu/g(mL) 放射測量法放射測量法利用細(xì)菌在代謝碳水化合物時產(chǎn)生CO2的原理,把微量的放射性標(biāo)記引入葡萄糖或其他糖類分子中。細(xì)菌生長時,糖被利用并放出標(biāo)記的CO2,將生成的放射性標(biāo)記CO2從培養(yǎng)裝置中導(dǎo)出或用化學(xué)法吸收后,利用專用的放射測量儀來測定放射性CO2 。放射量與菌數(shù)

13、成正比。致病菌快速檢測方法致病菌快速檢測方法n顯色培養(yǎng)基法:技術(shù)成熟,產(chǎn)品很多。n免疫學(xué)方法:產(chǎn)品最多,特異性和敏感性都很高,但有假陽性存在,陽性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有EIA,ELISA,GLISA,熒光酶免、免疫磁分離等方法。n分子生物學(xué)方法:以基因探針檢測法和PCR法為主。n基因芯片酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)mini-Vidas全自動免疫分析儀n利用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器,用已知抗體來捕捉目標(biāo)生物體,然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合,經(jīng)充分沖洗,通過激發(fā)光源檢測,即能自動讀出發(fā)光的陽性標(biāo)本。n優(yōu)點(diǎn)是檢測靈敏度高,速度快,可以在48小時的時間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單核李斯特菌,空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法n基因探針法及PCR方法在國外已經(jīng)有相當(dāng)成熟的表現(xiàn)。n有普通PCR,熒光PCR,實(shí)時熒光PCR(定量PCR)等多種方法。n基因探針法一般也需要增菌,然后加探針試劑雜交,然后在熒光顯

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