2 遺傳圖繪制

1、第2章 遺傳圖的繪制結構基因組的研究策略為何要繪制遺傳圖與物理圖為何要繪制遺傳圖與物理圖1)1)基因組太大基因組太大, ,必需分散測序必需分散測序, ,然后將分散的順然后將分散的順 序按原來位置組裝序按原來位置組裝, ,需要圖譜進行指導。需要圖譜進行指導。2)2)基因組基因組存在大量重復順序存在大量重復順序, ,會干擾排序會干擾排序, ,因此因此 要高密度基因組圖。要高密度基因組圖。3)3)遺傳圖和物理圖遺傳圖和物理圖各有優(yōu)缺點各有優(yōu)缺點, ,必須相互整合校正必須相互整合校正 DNA測序有一個極大的局限性：即使是最精確測序有一個極大的局限性：即使是最精確的技術，在一個反應中也很難測出大于的技術

2、，在一個反應中也很難測出大于750bp的的序列。這就需要將大分子分解為片段。序列。這就需要將大分子分解為片段。問題：分析基因組的重復區(qū)域時會發(fā)生錯誤。問題：分析基因組的重復區(qū)域時會發(fā)生錯誤。 因此，必須首先建立一個基因組的圖譜，通過因此，必須首先建立一個基因組的圖譜，通過標明基因和其他顯著特征的位置，為測序提供指導。標明基因和其他顯著特征的位置，為測序提供指導。一旦得到了基因組的圖譜，測序階段可以采用以下一旦得到了基因組的圖譜，測序階段可以采用以下方法進行：方法進行：1. 全基因組鳥槍法全基因組鳥槍法（whole-genome shotgun method）全基因組鳥槍法是一種快速獲得真核基因

3、組的方法全基因組鳥槍法是一種快速獲得真核基因組的方法。2. 克隆重疊群法克隆重疊群法（clone contig method）：（）：（作圖法測作圖法測序，限制測序）。序，限制測序）。這種逐步測序的方法花時間多，但精確。這種逐步測序的方法花時間多，但精確。 克隆重疊群法克隆重疊群法：contig，指相互間存在重疊順序，指相互間存在重疊順序的一組克隆。根據(jù)重疊順序的相對位置將各個克的一組克隆。根據(jù)重疊順序的相對位置將各個克隆首尾連接，覆蓋的物理長度可達百萬級堿基對。隆首尾連接，覆蓋的物理長度可達百萬級堿基對。在單個的重疊群中，采用鳥槍法測序，然后在重在單個的重疊群中，采用鳥槍法測序，然后在重疊群

4、內(nèi)進行組裝。疊群內(nèi)進行組裝。由上至下由上至下。 直接鳥槍法：直接鳥槍法：首先進行全基因組鳥槍法首先進行全基因組鳥槍法測序測序，再，再以基因組圖的以基因組圖的分子標記分子標記為起點，將鳥槍法為起點，將鳥槍法DNA片片段進行段進行組裝組裝。根據(jù)高密度的基因組圖分子標記，。根據(jù)高密度的基因組圖分子標記，檢測組裝片段是否處在正確的位置，校正因重復檢測組裝片段是否處在正確的位置，校正因重復順序的干擾產(chǎn)生的序列誤排。順序的干擾產(chǎn)生的序列誤排。由下至上由下至上全基因組鳥槍法測序和克隆重疊群法測序最后全基因組鳥槍法測序和克隆重疊群法測序最后都必須將都必須將DNA序列回歸到基因組圖上，因此序列回歸到基因組圖上，

5、因此基因組圖的繪制是基因組測序和組裝的核心內(nèi)容基因組圖的繪制是基因組測序和組裝的核心內(nèi)容之一，是基因組全面測序的必要前提。之一，是基因組全面測序的必要前提。傳統(tǒng)上將基因組作圖方法分為兩類。傳統(tǒng)上將基因組作圖方法分為兩類。 1. 遺傳作圖遺傳作圖 2. 物理作圖物理作圖2.1 遺傳圖譜與物理圖譜遺傳圖譜與物理圖譜 1）遺傳作圖遺傳作圖（Genetic mapping）：采用采用遺傳學遺傳學分析方法分析方法將基因或其它將基因或其它DNA序列標定在染色體序列標定在染色體上構建連鎖圖。這一方法包括雜交實驗，家系分上構建連鎖圖。這一方法包括雜交實驗，家系分析。遺傳圖距單位為析。遺傳圖距單位為厘摩厘摩(c

6、M), 每單位厘摩定義每單位厘摩定義為為1%交換率。交換率。 2）物理作圖物理作圖（Physical mapping）：采用采用分子生分子生物學技術物學技術直接將直接將DNA分子標記、基因或克隆標分子標記、基因或克隆標定在基因組定在基因組實際位置實際位置。物理圖的距離依作圖方法。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳而異，如輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳(cR), 限制性片段作圖與克隆作圖的圖距為限制性片段作圖與克隆作圖的圖距為DNA的分的分子長度，即堿基對子長度，即堿基對(bp, kb)。2.1 基因組作圖的方法 通過通過遺傳圖譜遺傳圖譜，我們可以大致了解各個基因或，我們可

7、以大致了解各個基因或DNADNA片斷片斷之間的之間的相對距離與方向相對距離與方向，如哪個基因更靠近著絲粒，那個，如哪個基因更靠近著絲粒，那個更靠近端粒等更靠近端粒等 遺傳距離是通過遺傳連鎖分析獲得的，使用的遺傳距離是通過遺傳連鎖分析獲得的，使用的DNADNA厘摩厘摩標志越多，越密集，所得到的遺傳連鎖圖的分辨率就越高標志越多，越密集，所得到的遺傳連鎖圖的分辨率就越高 遺傳圖譜不僅是現(xiàn)階段定位基因的重要手段，即使在人類遺傳圖譜不僅是現(xiàn)階段定位基因的重要手段，即使在人類基因組全物理圖譜建立起來之后，它依然是研究人類基因基因組全物理圖譜建立起來之后，它依然是研究人類基因組遺傳與變異的重要手段組遺傳與變

8、異的重要手段2.2 遺傳作圖標記遺傳作圖標記任何一類圖譜都有可識別的標記。遺傳圖譜任何一類圖譜都有可識別的標記。遺傳圖譜的標記是什么呢？的標記是什么呢？標記1標記2標記3染色體上的基因和基因和DNADNA序列序列均可作為路標, 路標具有物理屬性,他們由特定的DNA順序組成. 路標位于染色體上的位置是固定的,不會更改的,因而提供了作圖的依據(jù)2.2.1 基因標記基因標記在經(jīng)典遺傳學中，研究一種性狀的遺傳必須要求同在經(jīng)典遺傳學中，研究一種性狀的遺傳必須要求同一性狀至少一性狀至少2種不同的存在形式或稱表型。種不同的存在形式或稱表型。起初只有那些能通過起初只有那些能通過視覺區(qū)分視覺區(qū)分的基因表型用于研究

9、。的基因表型用于研究。最初的遺傳圖譜是在最初的遺傳圖譜是在20世紀初針對果蠅等生物使用世紀初針對果蠅等生物使用基因作為標記構建的。基因作為標記構建的。2.2.1 基因標記 表型（表型（phenotype) phenotype) ：一個遺傳性狀必須以兩種替換形式一個遺傳性狀必須以兩種替換形式或表型存在才能用于遺傳學分析或表型存在才能用于遺傳學分析 等位基因（等位基因（alleleallele）：每種表型是由不同的等位基因控制每種表型是由不同的等位基因控制 肉眼分辨的表型：肉眼分辨的表型：顏色、形狀等。如用于果蠅遺傳圖的顏色、形狀等。如用于果蠅遺傳圖的構建構建 生化表型：生化表型：微生物遺傳學研究

10、微生物遺傳學研究2.2.1 基因標記 人類的生化性狀人類的生化性狀ABOABO血型血型HLAHLA（人類白細胞抗原）（人類白細胞抗原） 復等位基因（復等位基因（multiple allelesmultiple alleles）：）：人類白細胞人類白細胞抗原（抗原（HLAHLA）是最復雜最具多態(tài)性的體系，位于）是最復雜最具多態(tài)性的體系，位于6 6 號染色體號染色體HLA-DRBIHLA-DRBI（human leukocyte antigens-DRBIhuman leukocyte antigens-DRBI）基因位點）基因位點至少有至少有5959個等位基因個等位基因HLA-BHLA-B抗原編

11、碼位點有抗原編碼位點有6060多個等位基因多個等位基因ABO 血型基因座上具有編碼不同血型基因座上具有編碼不同半乳糖轉移酶復等位基因半乳糖轉移酶復等位基因其特異性決定了血型的差別其特異性決定了血型的差別基因是非常有用的標記，但并不是理想的。原因基因是非常有用的標記，但并不是理想的。原因：1. 可用作標記的可用作標記的基因十分有限基因十分有限，許多性狀都涉及，許多性狀都涉及 多基因。多基因。 2. 高等生物基因組中存在高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，大量的基因間隔區(qū)，遺遺 傳圖中留下大片的無標記區(qū)段。傳圖中留下大片的無標記區(qū)段。3. 只有部分基因其等位基因成員可以通過常規(guī)實只有部分基因其等

12、位基因成員可以通過常規(guī)實 驗予以區(qū)分，因而產(chǎn)生的遺傳圖是不完整的。驗予以區(qū)分，因而產(chǎn)生的遺傳圖是不完整的。2.2.1 基因標記基因標記 基因之外的作圖工具統(tǒng)稱為基因之外的作圖工具統(tǒng)稱為DNA標記。與基標記。與基因標記一樣，因標記一樣，DNA標記必須有至少兩個等位標記必須有至少兩個等位基因才是有用的基因才是有用的。有三種類型的。有三種類型的DNA序列特序列特征可以滿足這一要求：征可以滿足這一要求：1. 限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphisms, RFLP）2. 簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性（simple

13、sequence length polymorphisms, SSLP）3. 單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）2.2.2 DNA標記標記 遺傳標記的發(fā)展：遺傳標記的發(fā)展： 第一代標記第一代標記 經(jīng)典的遺傳標記（蛋白質(zhì)和免疫學的標記）經(jīng)典的遺傳標記（蛋白質(zhì)和免疫學的標記） 7070年代中后期，限制酶片段長度多態(tài)性（年代中后期，限制酶片段長度多態(tài)性（RFLPRFLP） 第二代標記第二代標記 8585年，年，“小衛(wèi)星序列小衛(wèi)星序列 （minisatelliteminisatellite） 8989年，年，“微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列

14、（microsatellitemicrosatellite） 第三代標記第三代標記 單核苷酸多態(tài)性標記（單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotidesingle nucleotide polymorphism polymorphism ，SNPSNP） 7070年代發(fā)展起來的年代發(fā)展起來的DNADNA重組技術、重組技術、DNADNA克隆技術和克隆技術和DNADNA探針技術探針技術為拓展遺傳圖譜的構建途徑創(chuàng)造了技術條件為拓展遺傳圖譜的構建途徑創(chuàng)造了技術條件使人類基因定位的方法從使人類基因定位的方法從細胞及染色體細胞及染色體水平過渡到水平過渡到分子水平分子水平DNADNA水平的多態(tài)性標記

15、位點作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標，水平的多態(tài)性標記位點作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標，提高圖譜的提高圖譜的 精確度、準確性。遺傳圖譜的繪制進入了一個嶄新精確度、準確性。遺傳圖譜的繪制進入了一個嶄新的時代的時代 現(xiàn)代遺傳圖譜的概念現(xiàn)代遺傳圖譜的概念由由Botstein DBotstein D等等(1980)(1980)首先提出，首先提出，在此基礎上，限制性片段長度多態(tài)性（在此基礎上，限制性片段長度多態(tài)性（RFLPRFLP）作為遺）作為遺傳圖譜的第一代嶄新標記得以問世傳圖譜的第一代嶄新標記得以問世 。 限制性位點限制性位點能夠用作基因標記。廣泛應用到基因組研究能夠用作基因標記。廣泛應用到基因組研

16、究中。基因或基因組可以用中。基因或基因組可以用重疊的限制性片段重疊的限制性片段來作圖。最來作圖。最終擴展到整個序列，構建連鎖圖譜終擴展到整個序列，構建連鎖圖譜同一物種的亞種、品系或個體間基因組同一物種的亞種、品系或個體間基因組DNA 受受到同一種限制性內(nèi)切酶作用而形成不同的酶切圖到同一種限制性內(nèi)切酶作用而形成不同的酶切圖譜的現(xiàn)象，譜的現(xiàn)象，稱為限制性片段長度多態(tài)性（稱為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)。這是由于基因組這是由于基因組DNA某一位點上的變異有可能某一位點上的變異有可能引起該位點特異性的限制性內(nèi)切酶識別位點的改引起該位點特異性的限制性內(nèi)切酶識別位點的改變，包括原有位點的消失或出現(xiàn)新的

17、酶切位點，變，包括原有位點的消失或出現(xiàn)新的酶切位點，致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化而產(chǎn)生。致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化而產(chǎn)生。最早發(fā)現(xiàn)的最早發(fā)現(xiàn)的DNADNA分子標記分子標記RFLP：由于同源由于同源染色體同一區(qū)段染色體同一區(qū)段DNADNA序列的差異，當用限制酶處理序列的差異，當用限制酶處理時，可產(chǎn)生長度不同的限制性片段時，可產(chǎn)生長度不同的限制性片段RFLP:restriction fragment length polymorphism, 限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性RFLP是如何發(fā)現(xiàn)的是如何發(fā)現(xiàn)的? 在猶他州鹽湖城滑雪勝地艾爾塔的一場例行的在猶他州鹽湖城滑雪勝地艾爾塔的一場例行的

18、學術討論中學術討論中, 從事經(jīng)典人類遺傳學研究的專家從事經(jīng)典人類遺傳學研究的專家與從事分子生物學研究的專家進行學術交流。與從事分子生物學研究的專家進行學術交流。分子生物學家從經(jīng)典遺傳學的研究中獲得靈感。分子生物學家從經(jīng)典遺傳學的研究中獲得靈感。David Botstein David BotsteinDavid Botstein開創(chuàng)核酸限制性片段開創(chuàng)核酸限制性片段長度多態(tài)性分析技術，用于標志不同長度多態(tài)性分析技術，用于標志不同個體間的基因差別，為后來的人類基個體間的基因差別，為后來的人類基因組計劃奠定了基礎。因組計劃奠定了基礎。 PRINCETON, N.J. - Princeton Univ

19、ersity has named David Botstein, a renowned geneticist,educator and pioneer of the Human Genome Project, as thenew director of the Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics. 第第1篇有關人類篇有關人類RFLP實驗論文實驗論文 A Highly Polymorphic Locus in Human DNA Arlene R. Wyman and Ray White, MIT A locus in the huma

20、n genome, not associated with any specific gene, has been found to be a site of restriction fragment length polymorphism. The polymorphism was found by hybridizing a 16-kilobase-pair segment of single-copy human DNA, selected from the human genome library cloned in phage CH4A, to a Southern transfer

21、 of total human DNA digested with EcoRI. DNAs from a number of individuals from within Mormon pedigrees as well as random individuals have been examined. The locus is highly variable, with at least eight alleles present, homozygotes accounting for less than 25% of the individuals examined. -PNAS | N

22、ovember 1, 1980 | vol. 77 | no. 11 | 6754-6758對對RFLP的檢測主要是用的檢測主要是用Southern雜交雜交的方法進行的方法進行基本流程：基本流程：組織或細胞組織或細胞基因組基因組DNA限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳印跡轉移至濾膜印跡轉移至濾膜加入探針加入探針雜交雜交洗膜洗膜放射自顯影放射自顯影獲得反映個體特異性獲得反映個體特異性的的RFLP圖譜。圖譜。 RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生與檢測所用的探針位于染色體的不同位點，可以作為所用的探針位于染色體的不同位點，可以作為一種分子標記，構建分子圖譜。一種分子標記，構建分子圖譜。R

23、FLP標記的主要特點是：標記的主要特點是：（1）遍布于整個基因組；）遍布于整個基因組；（2）無表型效應）無表型效應,不受發(fā)育階段及器官特異性限制不受發(fā)育階段及器官特異性限制（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結果穩(wěn)定、可靠；）結果穩(wěn)定、可靠；用途：用途：RFLP主要用于群體水平和系統(tǒng)發(fā)育研究上主要用于群體水平和系統(tǒng)發(fā)育研究上.進行個體識別；繪制遺傳圖譜；目的基因定位；檢進行個體識別；繪制遺傳圖譜；目的基因定位；檢測群體內(nèi)或群體間序列差異程度；輔助育種等。測群體內(nèi)或群體間序列差異程度；輔助育種等。自自RFLP問世以來，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳問世以來，已經(jīng)在

24、基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構建、疾病的基因診斷等研究中得到了連鎖圖譜的構建、疾病的基因診斷等研究中得到了廣泛的應用。廣泛的應用。共顯性共顯性: （兩（兩個親本的性個親本的性狀在一個個狀在一個個體中同時出體中同時出現(xiàn)，沒有顯現(xiàn)，沒有顯隱關系）隱關系）問題問題：1. 克隆可表現(xiàn)基因組克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難多態(tài)性的探針較為困難2. DNA需要量大，實驗操作較繁鎖，檢測周期長需要量大，實驗操作較繁鎖，檢測周期長成本費用也很高。成本費用也很高。3. RFLP分子標記分布密度過于稀疏。分子標記分布密度過于稀疏?，F(xiàn)已逐步被其他類型分子標記所取代?，F(xiàn)已逐步被其他類型分子標記所取代。RF

25、LP是最早發(fā)現(xiàn)的分子標記，也被稱為第一代分是最早發(fā)現(xiàn)的分子標記，也被稱為第一代分子標記。子標記。2. 簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)1) 可變排列的簡單重復序列可變排列的簡單重復序列, 即重復次數(shù)不一即重復次數(shù)不一, 在染色體的同一座位重復序列拷貝數(shù)不同在染色體的同一座位重復序列拷貝數(shù)不同;2) SSLP的類型的類型: 小衛(wèi)星序列小衛(wèi)星序列(minisatellite), 有時又稱可變串聯(lián)有時又稱可變串聯(lián) 重復（重復（VNTR），重復單位較長。重復序列為），重復單位較長。重復序列為16-100個核苷酸，主要分布在染色體端粒及著絲粒個核苷酸，主要分布在染色體端粒及著絲粒 微衛(wèi)星

26、序列微衛(wèi)星序列(micrisatellite), 或稱簡單串聯(lián)重或稱簡單串聯(lián)重 復（復（STR），重復單位較短。重復序列只有），重復單位較短。重復序列只有2-6個個核苷酸，分布在整個基因組。核苷酸，分布在整個基因組。 microsatellite markermicrosatellite marker又稱簡單串連重復（又稱簡單串連重復（short short tandem repeattandem repeat，STRSTR），），最重要的優(yōu)點是高度多態(tài)最重要的優(yōu)點是高度多態(tài)性，提供的信息量相對很大；另外可用性，提供的信息量相對很大；另外可用PCRPCR技術技術使操作實現(xiàn)自動化，遺傳圖與物理圖

27、研究中非常使操作實現(xiàn)自動化，遺傳圖與物理圖研究中非常有用的工具有用的工具 2020世紀世紀8080年代后期年代后期, ,人們開始應用人們開始應用微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列(microsatellite,MS(microsatellite,MS) )繪制圖譜。繪制圖譜。19941994年底，美、法完年底，美、法完成了以成了以RFLPRFLP及微衛(wèi)星為標志的遺傳圖譜及微衛(wèi)星為標志的遺傳圖譜. .圖譜包含了圖譜包含了58265826位點，覆蓋位點，覆蓋4000cM4000cM，分辨率高達，分辨率高達0.7cM0.7cM19961996年法國報道了完全以微衛(wèi)星年法國報道了完全以微衛(wèi)星DNADNA標標志構建的

28、遺傳連鎖圖，包含志構建的遺傳連鎖圖，包含23352335位點，分辯率為位點，分辯率為1.6cM1.6cM微衛(wèi)星序列（SSR）共顯性共顯性如何檢測如何檢測SSR根據(jù)簡單重復順序兩側的序列根據(jù)簡單重復順序兩側的序列設計引物設計引物, PCR，經(jīng)，經(jīng)聚丙烯胺凝膠聚丙烯胺凝膠電泳電泳分辨分辨.SSR技術的技術的優(yōu)點是：優(yōu)點是：（1）在基因組中隨機分布，檢測的多態(tài)性頻率高；）在基因組中隨機分布，檢測的多態(tài)性頻率高；（2）PCR特異引物，重復性好；特異引物，重復性好；（3）共顯性，操作相對簡單。）共顯性，操作相對簡單。問題是：問題是：（1）SSR需要測序和需要測序和設計引物設計引物，因而需要大量，因而需要

29、大量 的人力、物力和時間；的人力、物力和時間；（2）另外其種屬特異性強，開發(fā)所需的費用高）另外其種屬特異性強，開發(fā)所需的費用高 昂，因此一些實驗室進行了合作，共同開昂，因此一些實驗室進行了合作，共同開 發(fā)微衛(wèi)星引物。發(fā)微衛(wèi)星引物。 利用利用SSR標記的關鍵是引物的設計標記的關鍵是引物的設計對于已經(jīng)進行基因組全序列測定的生物或遺傳對于已經(jīng)進行基因組全序列測定的生物或遺傳學研究比較經(jīng)典的生物，可以直接從其基因組學研究比較經(jīng)典的生物，可以直接從其基因組進行查找和利用有關程序進行引物的設計或利進行查找和利用有關程序進行引物的設計或利用別人已經(jīng)發(fā)表的引物來進行實驗；用別人已經(jīng)發(fā)表的引物來進行實驗；而對于

30、沒有基因組序列信息的生物，就需要進而對于沒有基因組序列信息的生物，就需要進行有關引物的設計工作。行有關引物的設計工作。微衛(wèi)星序列標記研究微衛(wèi)星序列標記研究1) 1982年年Hamada等首次報道等首次報道m(xù)icrosatrllite現(xiàn)象現(xiàn)象 (PNAS, 79:6564, 1982)2) 1989年年Weber等從等從GenBank中發(fā)現(xiàn)人類基因中發(fā)現(xiàn)人類基因組的組的8個位點中個位點中, 有有7個位點存在個位點存在(CA)n拷貝數(shù)的拷貝數(shù)的變化變化(Am.J.Hum.Genet., 44:388, 1989).3) 現(xiàn)已證實人和老鼠基因組中平均每現(xiàn)已證實人和老鼠基因組中平均每18-28 kb含

31、含有一個多態(tài)性有一個多態(tài)性(CA)n.4) 獲取方法獲取方法: a) 計算機搜尋計算機搜尋; b) 用限制酶酶切基用限制酶酶切基因組因組DNA, 構建構建DNA文庫。合成簡單寡聚重復文庫。合成簡單寡聚重復核苷酸作為探針從庫中篩選核苷酸作為探針從庫中篩選.SSLP標記在基因組中的分布具有多態(tài)性頻率高標記在基因組中的分布具有多態(tài)性頻率高以及分布比較均勻的特點，此外以及分布比較均勻的特點，此外SSLP標記可以標記可以采用采用PCR方法直接擴增，經(jīng)聚丙烯胺凝膠電泳分方法直接擴增，經(jīng)聚丙烯胺凝膠電泳分辯，現(xiàn)已成為主流的分子標記，辯，現(xiàn)已成為主流的分子標記，又稱為第二代分又稱為第二代分子標記。子標記。SS

32、R標記應用標記應用：現(xiàn)已證明微衛(wèi)星：現(xiàn)已證明微衛(wèi)星DNA 存在于絕存在于絕大多數(shù)真核生物基因組中，因此已廣泛應用于大多數(shù)真核生物基因組中，因此已廣泛應用于遺傳圖譜構建、品種純度檢測及遺傳多樣性分遺傳圖譜構建、品種純度檢測及遺傳多樣性分析、重要性狀基因的定位等。析、重要性狀基因的定位等。3. SNP(單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性)SNP是指同一物種不同個體基因組是指同一物種不同個體基因組DNA的等位序列上單個核的等位序列上單個核苷酸存在差異的現(xiàn)象。苷酸存在差異的現(xiàn)象。SNPSNP只涉及單個堿基的變異，這種變異可以由單個堿基的轉只涉及單個堿基的變異，這種變異可以由單個堿基的轉換（包括換（包括C C

33、與與T T互換，互換，G G與與A A互換），或顛換（包括互換），或顛換（包括C C與與A A、G G與與T T、C C與與G G、A A與與T T互換）引起?；Q）引起。點突變，位于密碼子的點突變，位于密碼子的搖擺位置搖擺位置，表現(xiàn)為沉默突變而被大，表現(xiàn)為沉默突變而被大量保留下來。大多數(shù)不能被限制酶識別，必須采取量保留下來。大多數(shù)不能被限制酶識別，必須采取測序測序或寡或寡聚核苷酸雜交檢測聚核苷酸雜交檢測在人類基因組中可達到在人類基因組中可達到300300萬個，平均每萬個，平均每10001000個堿基對就有個堿基對就有一個一個數(shù)目多，覆蓋密度大，被稱為第三代分子標記數(shù)目多，覆蓋密度大，被稱為第

34、三代分子標記根據(jù)根據(jù)SNP在基因中的位置，在基因中的位置，SNP可分為：可分為：基因編碼區(qū)基因編碼區(qū)SNP（coding SNP, cSNP）基因周邊基因周邊SNP（peripheral SNP, pSNP）基因間基因間SNP （intronicSNP, iSNP）從對生物的遺傳性狀的影響，基因編碼區(qū)從對生物的遺傳性狀的影響，基因編碼區(qū)SNP cSNP又可分為兩種：又可分為兩種：1.同義同義cSNP(synonymous cSNP)：SNP引起的編碼引起的編碼序列的改變并不影響其翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序序列的改變并不影響其翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列列;2. 非同義非同義cSNP（non-synon

35、ymous cSNP）：）：指堿指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質(zhì)序列基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。常是導致生物性狀改變的直接原因。SNP標記可用標記可用DNA芯片技術檢測：將不同的寡芯片技術檢測：將不同的寡核苷酸固定在芯片上，標記待測核苷酸固定在芯片上，標記待測DNA，一次就，一次就可檢測很多可檢測很多SNP標記。標記。盡管單一的盡管單一的SNP所提供的信息量遠小于現(xiàn)在常所提供的信息量遠小于現(xiàn)在常用的分子標記，但用的分子標記，但SNP的數(shù)量極其豐富，并且的數(shù)

36、量極其豐富，并且可以自動化檢驗，因此其具有廣泛的應用前景?？梢宰詣踊瘷z驗，因此其具有廣泛的應用前景。SNP數(shù)量比微衛(wèi)星標記數(shù)要高出幾個數(shù)量級。數(shù)量比微衛(wèi)星標記數(shù)要高出幾個數(shù)量級。例如：例如：34個個SNP這種相鄰的界標構成的這種相鄰的界標構成的單倍型（單倍型（haplotype）就可以有）就可以有816種：種：Haplotype:一條同源染色體上的等位基因或遺傳一條同源染色體上的等位基因或遺傳標記所構成的組合。標記所構成的組合。人類不同群體中存在的人類不同群體中存在的SNP鐮刀形紅細胞鐮刀形紅細胞貧血癥貧血癥2.3 遺傳作圖的方法遺傳作圖的方法理論基礎理論基礎：采用一組分子標記構建遺傳圖：采用

37、一組分子標記構建遺傳圖的方法主要依賴于的方法主要依賴于連鎖分析連鎖分析?；痉椒ɑ痉椒ǎ簝牲c測驗法和三點測驗法：兩點測驗法和三點測驗法2.3 遺傳作圖的方法 連鎖分析是遺傳作圖的基礎：連鎖分析是遺傳作圖的基礎：1905，Bateson，Saunder和和Punnett首創(chuàng)；首創(chuàng)；1911年年Morgan揭示了連鎖分析的意義揭示了連鎖分析的意義在同一條染色體上的基因間表現(xiàn)出在同一條染色體上的基因間表現(xiàn)出遺傳連鎖遺傳連鎖(Genetic linkage)，因為它們都是在同一條長的因為它們都是在同一條長的DNA分子上分子上 部分連鎖與重組：部分連鎖與重組： 比利時細胞學家比利時細胞學家Jansse

38、ns發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂時同源染色體的交換發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂時同源染色體的交換 Sturtevant：2 個彼此靠近的基因之間因交換而分離的頻率，要比個彼此靠近的基因之間因交換而分離的頻率，要比相互遠離的相互遠離的2個基因之間發(fā)生分離的頻率要小個基因之間發(fā)生分離的頻率要小 重組率則可成為測量基因之間相對距離的尺度，只要獲得不同基重組率則可成為測量基因之間相對距離的尺度，只要獲得不同基因之間的重組率，就可繪制一份基因位于染色體上相對位置的地因之間的重組率，就可繪制一份基因位于染色體上相對位置的地理圖理圖部分連鎖與遺傳作圖 構建遺傳圖譜的基本原理構建遺傳圖譜的基本原理真核生物遺傳過程中會發(fā)生減數(shù)分裂，此過程中染

39、色體要進真核生物遺傳過程中會發(fā)生減數(shù)分裂，此過程中染色體要進行重組和交換，這種重組和交換的概率會隨著染色體上任意行重組和交換，這種重組和交換的概率會隨著染色體上任意兩點間相對距離的遠近而發(fā)生相應的變化。兩點間相對距離的遠近而發(fā)生相應的變化。根據(jù)概率大小，人們就可以推斷出同一條染色體上兩點間的根據(jù)概率大小，人們就可以推斷出同一條染色體上兩點間的相對距離和位置關系。相對距離和位置關系。正因為如此，我們得到的這張圖譜也就只能顯示標記之間的正因為如此，我們得到的這張圖譜也就只能顯示標記之間的相對距離相對距離。我們稱這一距離。我們稱這一距離( (概率概率) )為遺傳距離為遺傳距離(cM(cM) )，由此

40、構建，由此構建的圖譜也稱為遺傳圖譜。的圖譜也稱為遺傳圖譜。連鎖遺傳圖的做法 一般以最左端的基因位置為一般以最左端的基因位置為0，如發(fā)現(xiàn)有新的基因，如發(fā)現(xiàn)有新的基因在更左端的位置時，把在更左端的位置時，把0點讓給新基因，其余的基點讓給新基因，其余的基因座位作相應移動因座位作相應移動 由于較遠的兩基因之間發(fā)生偶數(shù)次交換，但沒有由于較遠的兩基因之間發(fā)生偶數(shù)次交換，但沒有出現(xiàn)重組類型，所以交換值要大于重組率。繪制出現(xiàn)重組類型，所以交換值要大于重組率。繪制連鎖遺傳圖時，需根據(jù)重組率進行圖距的校正連鎖遺傳圖時，需根據(jù)重組率進行圖距的校正遺傳圖的偏離 重組熱點：重組熱點：近端粒區(qū)、著絲點區(qū)近端粒區(qū)、著絲點區(qū)

41、特異基因區(qū)段（小鼠主要組織兼容性復合特異基因區(qū)段（小鼠主要組織兼容性復合座位）座位）性別影響：不同性別具有不同的重組熱點性別影響：不同性別具有不同的重組熱點2.3.3 不同模式生物的連鎖分析不同模式生物的連鎖分析連鎖分析分為連鎖分析分為3大范疇：大范疇： 1. 有性雜交實驗有性雜交實驗 2. 系譜分析系譜分析 3. DNA轉移轉移雜交實驗的連鎖分析 選擇已知基因型的親本，設計雜交方案，獲得交配的子選擇已知基因型的親本，設計雜交方案，獲得交配的子代并分析其表型和基因型代并分析其表型和基因型 對于高等真核生物的常規(guī)連鎖分析并不是直接檢查配子，對于高等真核生物的常規(guī)連鎖分析并不是直接檢查配子，而是檢

42、測分別來自兩個親本配子融合形成的二倍體基因而是檢測分別來自兩個親本配子融合形成的二倍體基因型，即進行遺傳雜交型，即進行遺傳雜交 兩點雜交和多點雜交兩點雜交和多點雜交 兩點雜交：常用測交方法分析子代基因型分離比測交：雜合體X隱性純合體 子代表型逆推親代交換率 多點雜交：三個位點分析雙雜交子代基因型子代基因型觀測數(shù)觀測數(shù)推測的重組事件推測的重組事件ABC/abcabc/abc987無重組，均為親代基因型aBC/abcAbc/abc51A和BC之間發(fā)生一次重組ABc/abcabC/abc63B和AC之間發(fā)生一次重組AbC/abcaBc/abc2發(fā)生兩次重組，一次發(fā)生在C與A之間，一次發(fā)生在C與B之間

43、RFLP連鎖圖 RFLP是第一種用于研究的是第一種用于研究的DNA標記（標記（David Bostein，1980） 基本設想基本設想：由于同源染色體同一區(qū)段由于同源染色體同一區(qū)段DNA順序的差異，用順序的差異，用限制酶消化時，會得到長度各不相同的限制性片段。經(jīng)過限制酶消化時，會得到長度各不相同的限制性片段。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離，可直接顯示不同個體同一位點瓊脂糖凝膠電泳分離，可直接顯示不同個體同一位點DNA組成的差異組成的差異 由于限制酶的專一性，用不同的限制酶處理同一由于限制酶的專一性，用不同的限制酶處理同一DNA樣品樣品時，可以產(chǎn)生與之對應的不同限制性片斷，從而提供大量時，可以產(chǎn)生與之對

44、應的不同限制性片斷，從而提供大量位點多態(tài)性信息位點多態(tài)性信息親本：親本：A1/B1和和A2/B2，個體，個體231；新組合：；新組合：A1/B2和和A2/B1，個體，個體39交換率：交換率：39/（231+39）=14%；A與與B相距相距14cMRFLP原理圖示：標記1標記2 人類遺傳圖譜的構建人類遺傳圖譜的構建系譜分析作圖系譜分析作圖v 人類不可能根據(jù)需要選擇親本，設計雜交組人類不可能根據(jù)需要選擇親本，設計雜交組 合，構建分離群體。合，構建分離群體。v 只能檢測現(xiàn)存家庭連續(xù)幾代成員的基因型。只能檢測現(xiàn)存家庭連續(xù)幾代成員的基因型。v 家系分析法家系分析法。v 資料有限、必須借助于統(tǒng)計學方法。資

45、料有限、必須借助于統(tǒng)計學方法。系譜分析 系譜分析法即對某家庭性狀相關成員進行系譜分析法即對某家庭性狀相關成員進行 統(tǒng)計，分析性統(tǒng)計，分析性狀之間的連鎖關系，通過重組率進行相關基因定位，這種狀之間的連鎖關系，通過重組率進行相關基因定位，這種方法又稱方法又稱家系分析法家系分析法(pedigree method) 不能進行有計劃的遺傳實驗，只能收集家系成員的相關資不能進行有計劃的遺傳實驗，只能收集家系成員的相關資料進行連鎖分析，主要涉及人類和多年生樹木料進行連鎖分析，主要涉及人類和多年生樹木 優(yōu)勢對數(shù)值（優(yōu)勢對數(shù)值（lod score）分析：）分析：lod值是基因連鎖可能性的值是基因連鎖可能性的對數(shù)

46、，用于判定所研究的兩個標記是否在同一染色體上，對數(shù)，用于判定所研究的兩個標記是否在同一染色體上，換句話說就是基因是否連鎖。如果優(yōu)勢對數(shù)分析確定了連換句話說就是基因是否連鎖。如果優(yōu)勢對數(shù)分析確定了連鎖，然后可以提供最可能的重組頻率程度。理想的情況是鎖，然后可以提供最可能的重組頻率程度。理想的情況是資料來自不同系譜資料來自不同系譜細菌的遺傳作圖 轉化（轉化（ transformation ）：）：供體細胞釋放的一段供體細胞釋放的一段DNA（通常小于（通常小于50kb），經(jīng)受體細胞攝取后整合到基因組中，），經(jīng)受體細胞攝取后整合到基因組中，可借助抗性培養(yǎng)基篩選重組克隆可借助抗性培養(yǎng)基篩選重組克隆 轉導

47、（轉導（transduction)：通過噬菌體將小片段通過噬菌體將小片段DNA從供從供體細胞轉移到受體細胞體細胞轉移到受體細胞 接合轉移接合轉移(conjugation)：兩個細菌形成物理接觸，兩個細菌形成物理接觸，DNA從供體轉移到受體從供體轉移到受體細菌的遺傳重組細菌的遺傳重組 細菌遺傳作圖中采用的都是細菌遺傳作圖中采用的都是生化標記生化標記（如合成色氨酸的能（如合成色氨酸的能力、對抗生素的敏感性等），隱性表型（如不能合成色氨力、對抗生素的敏感性等），隱性表型（如不能合成色氨酸）是可以互補的性狀。酸）是可以互補的性狀。 基因轉移在具有基因轉移在具有野生野生型等位基因的型等位基因的供體供體品

48、系與具有品系與具有隱性隱性等等位基因的位基因的受體受體品系之間進行，根據(jù)受體細胞是否獲得基因品系之間進行，根據(jù)受體細胞是否獲得基因指令的生化功能來監(jiān)測轉移的指令的生化功能來監(jiān)測轉移的DNA是否進入受體細胞是否進入受體細胞 接合：根據(jù)野生型基因進入受體的時間表，可以確定基因接合：根據(jù)野生型基因進入受體的時間表，可以確定基因所在的位置所在的位置 轉導及轉化：依據(jù)所研究的基因是否同時出現(xiàn)在受體細胞轉導及轉化：依據(jù)所研究的基因是否同時出現(xiàn)在受體細胞中，緊密連鎖的基因總是有最高的機率被同時轉移。中，緊密連鎖的基因總是有最高的機率被同時轉移?；蚺c分子標記的共分離 共分離：共分離：如果限制酶多態(tài)性在基因組

49、中自由發(fā)生，則有如果限制酶多態(tài)性在基因組中自由發(fā)生，則有些會在特定基因附近產(chǎn)生。我們可以確定這樣的限制性些會在特定基因附近產(chǎn)生。我們可以確定這樣的限制性標記，因為該標記與突變表型密切相關。如果比較患病標記，因為該標記與突變表型密切相關。如果比較患病者的和正常人的者的和正常人的DNA DNA 限制圖譜，可能發(fā)現(xiàn)一個特定的限制圖譜，可能發(fā)現(xiàn)一個特定的限制性位點通常出現(xiàn)限制性位點通常出現(xiàn)( (或者丟失或者丟失) )在患者在患者DNA DNA 中，原因是中，原因是限制性標記與表型間限制性標記與表型間100%100%相關。它暗示限制性標記與相關。它暗示限制性標記與突變基因距離很緊，以至于它們在重組中不能分離突變基因距離很緊，以至于它們在重組中不能分離2.4 遺傳圖繪制遺傳圖繪制2.4.1 人類