發(fā)酵生產(chǎn)中雜菌的檢查和防治

1、第一節(jié)發(fā)酵生產(chǎn)中雜菌的檢查與防治一染菌的檢查與判斷但凡在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統(tǒng)稱為雜菌污染,及早發(fā)現(xiàn)雜菌, 及早采取相應(yīng)舉措,對(duì)減少由雜菌污染造成的損失至關(guān)重要.因此檢查的方法要求準(zhǔn)確、 快速.目前發(fā)酵生產(chǎn)上常用的檢查方法有以下幾種：1 .顯微鏡檢查一般單染色后用油鏡觀察,但凡從視野中發(fā)現(xiàn)有形態(tài)與生產(chǎn)菌株不同的菌體都可認(rèn)為是污染了雜菌.優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速,能及時(shí)檢查出雜菌.缺點(diǎn)：(1)對(duì)固形物多的發(fā)酵液檢查較困難；(2)對(duì)含雜菌少的樣品不易得出正確結(jié)論,應(yīng)多檢查幾個(gè)視野；(3)由于菌體較小,本身又處于非同步狀態(tài),應(yīng)注意區(qū)別不同生理狀態(tài)下的生 產(chǎn)菌與雜菌,必要時(shí)可用進(jìn)行革藍(lán)氏染色

2、、芽抱染色等輔助方法進(jìn)行鑒別.2 .平板檢查假設(shè)疑心發(fā)酵液被細(xì)菌污染,可取少量待檢發(fā)酵液涂布在肉湯平板上,在適宜條件下培養(yǎng),假設(shè)出現(xiàn)與生產(chǎn)菌株形態(tài)不一的菌落,就說明可能被雜菌污染； 假設(shè)要進(jìn)一步確證,可配合顯微鏡形態(tài)觀察,假設(shè)個(gè)體形態(tài)與菌落形態(tài)都與生產(chǎn)菌相異,那么可確認(rèn)污染了雜菌.優(yōu)點(diǎn)：(1)適于固形物多的發(fā)酵液；(2)形象直觀,肉眼可辯,不需儀器.缺點(diǎn)：(1)所需時(shí)間較長(zhǎng),至少也需 8小時(shí)；(2)無法區(qū)分形態(tài)(包括細(xì)胞形態(tài)與菌落形態(tài))與生產(chǎn)菌相似的雜菌,如啤酒 生產(chǎn)中污染野生酵母時(shí),由于啤酒酵母與野生酵母很難從形態(tài)上加以區(qū)分,只能借助生理生化試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn).(3)檢查過程需嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作技術(shù)

3、.3 .肉湯培養(yǎng)檢查法此法主要用于空氣過濾系統(tǒng)和液體培養(yǎng)基的無菌檢查.具體方法是將葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基(牛肉膏0.3%,蛋白月東0.8%,葡萄糖0.5%,氯化鈉0.5%, 1%酚紅溶液0.4%, pH7.2) 裝在吸氣瓶中,經(jīng)滅菌后,置 37 C培養(yǎng)24小時(shí),假設(shè)培養(yǎng)液未變渾濁,說明吸氣瓶中的培 養(yǎng)液是無菌的,就可用于空氣過濾系統(tǒng)的雜菌檢查.把過濾后的空氣引入吸氣瓶的培養(yǎng)液中,經(jīng)培養(yǎng)后,假設(shè)培養(yǎng)液變混,說明過濾后的空氣中仍有雜菌,說明過濾系統(tǒng)有問題,假設(shè)培養(yǎng)液未變混,說明空氣無菌.此法還可用于檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底,取少量培養(yǎng)基接入肉湯中,培養(yǎng)后觀察肉湯 的渾濁情況即可.4 .根據(jù)發(fā)酵過程中的

4、異常現(xiàn)象來判斷是否染菌(1) 溶解氧水平異常變化顯示染菌每一種生產(chǎn)菌都有其特定的耗氧曲線,當(dāng)雜菌污染時(shí),如果污染的是好氣性雜菌,會(huì)使溶解氧在較短的時(shí)間下降,甚至接近零,且長(zhǎng)時(shí)間不能上升；當(dāng)污染的是非好氣菌,生產(chǎn)菌的代由于受污染而遭抑制時(shí),會(huì)使耗氧量減少,發(fā)酵液中的溶解氧就會(huì)升高.如味精生產(chǎn)上受噬菌體污染時(shí),使菌體利用的氧氣量減少,DO上升.(2) 排氣中CO2的異常變化顯示染菌對(duì)特定的發(fā)酵,排氣中 CO2的含量變化也是有規(guī)律的.在染菌后,糖的消耗發(fā)生變化,從而引起排氣中 CO2含量的異常變化.一般說來污染雜菌后,糖耗加快,CO2含量增加；污染噬菌體,糖耗減慢,CO2含量減少.(3) 根據(jù)pH的

5、變化及菌體酶活力的變化來判斷雜菌的有無.二雜菌污染的原因分析1 .發(fā)酵染菌率發(fā)酵的總?cè)揪适侵敢荒臧l(fā)酵染菌的批次與總投料批次數(shù)之比.即總?cè)揪?發(fā)酵染菌批數(shù)/總投料批數(shù) x 100%發(fā)酵染菌率是指發(fā)酵罐中的染菌率.假設(shè)種子罐染菌因及早發(fā)現(xiàn)未投入發(fā)酵罐中就不能 計(jì)算入.2 .發(fā)酵原因分析及防治舉措要防治雜菌污染,首先要知道造成污染的途徑,然后對(duì)癥下藥,堵塞污染源,到達(dá)平安 生產(chǎn)的目的.造成發(fā)酵污染的原因很多,現(xiàn)介紹如下.根據(jù)造成污染的途徑看,主要有：(1)種子帶菌在發(fā)酵前期染菌,很可能是種子帶菌.種子帶菌的原因主要有以下幾方面a培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底,特別是滅菌鍋冷空氣排放不完全,使溫度達(dá)不到要

6、求；b菌種在移接過程中受污染.應(yīng)嚴(yán)格無菌治理制度,合理設(shè)計(jì)無菌室,并重視人員培 訓(xùn),嚴(yán)格按無菌操作規(guī)程接種；c菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染.應(yīng)注意培養(yǎng)室清潔衛(wèi)生, 規(guī)試管的棉塞,搖瓶的瓶口布等.(2)無菌空氣系統(tǒng)染菌.主要是由過濾介質(zhì)的效能下降引起,包括a過濾介質(zhì)(棉花、玻璃纖維等)被油水浸濕,失去了過濾效能；b忽然停電時(shí),由于發(fā)酵罐壓力高于過濾器的壓力,導(dǎo)致培養(yǎng)基倒流入過濾器的介質(zhì) 中,使之成為雜菌生長(zhǎng)繁殖的場(chǎng)所.所以在遇停電時(shí),要立即關(guān)閉發(fā)酵罐上的進(jìn)氣閥,再關(guān)閉排氣閥；c過濾介質(zhì)鋪放松緊不均勻, 空氣從疏松的部位穿過, 造成過濾不完全,過濾后的空氣 中仍帶有雜菌；d過濾系統(tǒng)發(fā)生滲漏,密

7、封性能差,造成染菌.3培養(yǎng)基滅菌不徹底.主要原因有a對(duì)淀粉質(zhì)原料,假設(shè)攪拌時(shí)間缺乏,沒有讓淀粉與冷水充分混勻,一經(jīng)加熱,淀粉容易 結(jié)成塊狀,蒸汽就不易穿入其,致使滅菌不徹底而染菌；b冷空氣未放盡,雖到預(yù)定壓力,但達(dá)不到預(yù)定溫度,致使滅菌不徹底；c對(duì)黏度高的培養(yǎng)基, 假設(shè)在滅菌過程中攪動(dòng)不均勻,會(huì)造成受熱不均,使一局部培養(yǎng)基滅菌不徹底.（4） 設(shè)備管道滅菌不徹底.主要原因有a設(shè)備管道存在死角,使蒸汽不能有效地到達(dá),造成染菌；b操作不當(dāng)引起.在管道系統(tǒng)滅菌時(shí),應(yīng)把所有進(jìn)氣閥門都翻開,讓蒸汽均勻地進(jìn)入 管道,并維持一段時(shí)間.所有放氣料閥門及進(jìn)料閥門如接種閥或加料閥也應(yīng)微開, 以消除死角.（5） 設(shè)備

8、管道系統(tǒng)滲漏.可能原因有a、罐體部位腐蝕；b、罐中冷卻用的蛇形管穿孔；c、管路上的閥門不配套,或閥門連接方式、管路安裝方法等不當(dāng).綜上所述,發(fā)酵染菌的原因很多,我們應(yīng)根據(jù)發(fā)酵的現(xiàn)象,合理地分析污染的原因,并提出相應(yīng)的挽救舉措,表 2-3-1表2-3-3是前人在這方面的一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié).表2-3-1根據(jù)發(fā)酵時(shí)期來分析原因染菌的現(xiàn)象污染的原因分析挽救舉措發(fā)酵早期染菌接種后1224小時(shí)1、種子帶菌1、染菌的種子滅菌后棄之2、增強(qiáng)火菌,增強(qiáng)設(shè)備的檢修3、輕者加大接種量,重看補(bǔ)料后滅菌,再重新接種2、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌小徹底發(fā)酵后期染菌1、操作過程中,特別是中間4、輕者照常發(fā)酵補(bǔ)料時(shí)帶入5、重者提前放罐2、設(shè)

9、備滲漏或空氣過濾系統(tǒng)污染表 2-3-2根據(jù)染菌的類型來分析原因染菌的現(xiàn)象污染的原因分析挽救舉措芽胞桿菌、霉菌1、培喬基火菌/、徹底1、增強(qiáng)培喬基的火菌及管道夕匕角的火 菌工作2、營(yíng)也設(shè)備火國(guó)小徹底不耐熱的細(xì)菌1、種子帶菌2、增強(qiáng)設(shè)備檢修一些G菌在葡 萄糖酚紅培養(yǎng)基中 菌落呈綠色2、設(shè)備滲漏由水帶入,一般由設(shè)備滲漏或冷卻器穿孔引起3、輕者加大接種量,重看補(bǔ)料后滅菌, 冉重新接種表2-3-3根據(jù)染菌的圍來分析原因染菌的現(xiàn)象大批發(fā)酵罐染同一種菌污染的原因分析空氣過濾器除菌不凈局部發(fā)酵罐染菌個(gè)別發(fā)酵罐染菌菌種帶菌或補(bǔ)料時(shí)染菌或其它操作不 當(dāng)帶入雜菌一般是設(shè)備損壞,如閥門的滲漏、罐 體的破損等挽救舉措1

10、、保持過濾介質(zhì)枯燥2、介質(zhì)鋪放均勻 嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作增強(qiáng)設(shè)備的檢查和維修根據(jù)對(duì)多個(gè)廠家的綜合分析,造成雜菌污染的原因以設(shè)備問題為主,如設(shè)備的滲漏、 管道不嚴(yán)密、設(shè)備中存在死角、空氣過濾系統(tǒng)失效等； 其次是種子(主要是二級(jí)種子) 染菌, 而培養(yǎng)基滅菌不徹底造成的染菌極少發(fā)生.第二節(jié) 噬菌體的污染和防治在許多發(fā)酵生產(chǎn)中,如氨基酸發(fā)酵、丙酮-丁醇發(fā)酵和抗生素發(fā)酵中常常遇到噬菌體(bacteriaphage)污染,引起溶菌,并隨之出現(xiàn)發(fā)酵緩慢或停止發(fā)酵等異?，F(xiàn)象.本節(jié)主要 介紹噬菌體污染的特征,檢查方法及防治舉措.一噬菌體污染的特征1發(fā)酵液光密度上升緩慢,甚至下降,肉眼可見發(fā)酵液逐漸變清；2耗糖速度緩

11、慢或停止,產(chǎn)物生成量少或不增加,發(fā)酵液中殘?zhí)歉撸?產(chǎn)生大量泡末,發(fā)酵液呈粘稠狀；4菌體不規(guī)那么,甚至出現(xiàn)畸形.二噬菌體的檢查方法1 .雙層瓊脂平板法(1) 雙層瓊脂平板的制備：先用78mL 2%的瓊脂培養(yǎng)基作底層,凝固后,參加34mL冷 至45c的1%瓊脂上層培養(yǎng)基(其中含 0.2mL發(fā)酵菌種懸液和0.1mL待檢發(fā)酵液), 讓其平整凝固；(2) 在發(fā)酵菌的適宜溫度下培養(yǎng),假設(shè)是細(xì)菌,一般培養(yǎng)1620小時(shí).(3) 檢查有無透明的噬菌斑.2 .液體培養(yǎng)檢查法將培養(yǎng)基、發(fā)酵菌種及待檢發(fā)酵液三者混合,培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)液是否變清.3 .斑點(diǎn)試驗(yàn)法先制備好涂布有發(fā)酵菌種的平板,再用接種環(huán)或無菌吸管取少許發(fā)酵

12、液在平板上點(diǎn)種, 培養(yǎng)后,觀察是否有噬菌斑.4 .玻片快速法將發(fā)酵菌種、發(fā)酵液和少量瓊脂培養(yǎng)基(含0.50.8%的瓊脂)混勻后涂布于無菌載玻片上,經(jīng)短期培養(yǎng)后,在低倍鏡下觀察是否有噬菌斑.三噬菌體的防治發(fā)酵液中污染噬菌體,不外乎有兩種原因.1菌種本身帶噬菌體,特別是溶源性噬菌體,對(duì)這種菌種,一經(jīng)發(fā)現(xiàn),應(yīng)立即棄去.2生產(chǎn)的環(huán)境中有噬菌體.因此,可采取相應(yīng)的預(yù)防舉措：1決不使用可疑菌種；2去除周圍環(huán)境中存在的噬菌體.能滅菌的滅菌,能消毒的消毒,搞好清潔衛(wèi)生工作；3選育抗噬菌體菌株4輪換使用菌株.由于一個(gè)菌株用的時(shí)間一長(zhǎng),就有可能出現(xiàn)該菌種的噬菌體.5注意通氣質(zhì)量.取風(fēng)口應(yīng)設(shè)在3040米的高空,空氣

13、過濾器要保證質(zhì)量；四發(fā)酵液污染噬菌體后的搶救舉措如果一旦發(fā)現(xiàn)噬菌體污染,應(yīng)及時(shí)采取補(bǔ)救舉措1 .假設(shè)在發(fā)酵前期污染了噬菌體,由于此時(shí)耗糖還不多,常用以下舉措(1) 補(bǔ)加抗性種子,并根據(jù)發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)多少,適當(dāng)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；(2) 補(bǔ)加約50%的已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的正常的發(fā)酵液,再進(jìn)行發(fā)酵；(3) 假設(shè)噬菌體輕度污染,菌體仍能較正常地生長(zhǎng),并積累代產(chǎn)物,那么可照常進(jìn)行發(fā)酵,假設(shè)污染嚴(yán)重,那么用加熱法(7080C)滅活噬菌體,放罐后重消毒.2 .假設(shè)在發(fā)酵中后期污染了噬菌體,且比擬嚴(yán)重,那么應(yīng)提前放罐,盡快提取產(chǎn)物.發(fā)酵罐、管道、洗滌水及用具均應(yīng)徹底滅菌,預(yù)防噬菌體擴(kuò)散而造成新的污染.并及時(shí)改用抗該噬菌體的生產(chǎn)菌株.3 .對(duì)某些產(chǎn)品可用藥物防治.選擇能特異性地抑制噬菌體而對(duì)生產(chǎn)菌株及其發(fā)酵產(chǎn)物的積 累和提取均無影響,又符合衛(wèi)生要求、對(duì)人無毒的藥物.盡可能選活性高(用藥量少)、價(jià)格低的藥物.如在谷氨酸發(fā)酵中常選用的藥物有：(1) 螯合劑.如植酸鹽(0.05-1%),檸檬酸鹽(0.20.5%),草酸鹽(0.20.5%),三聚磷酸鹽(0.5