同核核磁試驗(yàn)方法

1、第六章同核核磁實(shí)驗(yàn)方法通常所謂同核核磁譜指的是1H同核譜,由于一般有機(jī)物富含氫,而 1H的天然豐度達(dá)99.98%,而且1H的旋磁比最大,因而核磁信號(hào)最強(qiáng).其他核的核磁信號(hào)的檢測(cè)相對(duì)來講都 比擬困難,尤其是蛋白質(zhì)中有意義的如13C, 15N的天然豐度分別只有1.11%和0.36%,相對(duì)1H的檢測(cè)靈敏度只有 0.0159和0.00104,因此要檢測(cè)蛋白質(zhì)中的 13C及15N 一定要有同位素 標(biāo)記才行,而且還需長(zhǎng)時(shí)間累加.一般同核譜可研究的蛋白質(zhì)分子量的上限在1萬左右,當(dāng)然還要求蛋白質(zhì)在溶液中有足夠的溶解度,化學(xué)位移的分布比擬分散.蛋白質(zhì)中質(zhì)子的化學(xué)位移根本上是random coil的化學(xué)位移加上不

2、同構(gòu)象的影響.如折疊多的蛋白質(zhì)同螺旋多的蛋白質(zhì)相比,化學(xué)位移更為分散,譜峰也更容易解析；同種氨基酸殘基多的蛋白質(zhì),即使分子量較小,由于化學(xué) 位移可能會(huì)比擬密集,譜峰解析可能比稍大一些的蛋白質(zhì)還要困難.已經(jīng)發(fā)表的脈沖序列有上百,但通?？梢钥醋鞒Ｒ?guī)實(shí)驗(yàn)的為數(shù)不多.6.1 一維氫譜在記錄二維譜或三維譜等之前均需要記錄一維氫譜,通常蛋白質(zhì)溶于水或適當(dāng)?shù)木彌_液,加5-10%的D2O作為鎖場(chǎng)介質(zhì).一維氫譜可用于檢查樣品是否有足夠濃度,通常 16- 32次采樣要能得到足夠信噪比的譜圖,甲基由于快速旋轉(zhuǎn)呈現(xiàn)窄峰,而酰胺質(zhì)子由于化學(xué) 交換及14N的標(biāo)量弛豫呈現(xiàn)寬峰；一維氫譜還可用于檢查樣品的共振峰寬是否合理,蛋

3、白質(zhì)在高濃度下容易聚集從而增寬譜 線,嚴(yán)重時(shí)甚至1H譜上看不到明顯的峰,樣品在這種條件下顯然無法進(jìn)行核磁研究；一維 氫譜還可用于判別樣品的化學(xué)位移分布情況,可判別樣品是否變性,同時(shí)也對(duì)研究工作的 難度提供一些預(yù)測(cè).864201H(ppm)上圖顯示ubiquitin 一種蛋白質(zhì),76個(gè)殘基的一維譜：a水溶液中,b箭頭所指甲基區(qū) 的放大,c 8M尿素溶液中,顯示變性譜.蛋白質(zhì)的一維氫譜一般不應(yīng)該有非常尖的峰,假設(shè)出現(xiàn)這種峰,往往是殘留的小分子雜 質(zhì),當(dāng)然蛋白質(zhì)的末端及 loop區(qū)由于分子運(yùn)動(dòng)較快也會(huì)出現(xiàn)一些較尖的峰.當(dāng)樣品條件不佳時(shí),一維譜以及假設(shè)干信號(hào)強(qiáng)的二維譜可用來探索適合的樣品條件.6.2

4、COSY型實(shí)驗(yàn)6.2.1 COSYA COSYcorrelated spectroscopy,是人們創(chuàng)造的第一種二維譜,同時(shí)也是研究蛋白質(zhì)的最有 用的二維譜之一.二個(gè)有J偶合的核在COSY上可產(chǎn)生一個(gè)交叉峰,由于蛋白質(zhì)包括多數(shù)其他有機(jī)物中有 J偶合意味著這兩個(gè)核最多通過3個(gè)共價(jià)鍵連接,所以 COSY譜對(duì)于分子結(jié)構(gòu)的拓?fù)溥B接可提供非常有價(jià)值的信息.12左圖是COSY的脈沖序列,只由 2個(gè)90度 脈沖組成,兩脈沖之間是演化期,理想脈沖本身不產(chǎn)生其他雜信號(hào),故不需相循環(huán)抑制：因此根本的相循環(huán)為：1 =X； 2=X； ref=X實(shí)際上由于演化期的弛豫以及第一個(gè)90度脈沖的不準(zhǔn)確會(huì)產(chǎn)生軸峰,需要用2步循

5、環(huán)抑制：第一個(gè)脈沖及接收機(jī)相位同時(shí)反轉(zhuǎn) 通常還加上CYCLOPS循環(huán)以抑制硬件不平衡產(chǎn)生的其他雜信號(hào) 這樣形成8步循環(huán)：1= 0 2 1 3 2 0 3 12= 0 0 1 1 2 2 3 3ref= 0 2 1 3 2 0 3 1二維譜有幅度譜和相敏譜之分,由于相敏譜的分辨率高,通常要盡量用相敏譜.B以下是可以在 Bruker核磁譜儀上用于記錄蛋白質(zhì)COSY譜的脈沖程序,脈沖序列在Bruker譜儀上稱作微程序： ;cosyprst.WJH#include <Avance.incl>p2=p1*2d0= in0/2-p1*4/3.14159 d11=30md12=20ud13=3u

6、l3=(td1/2)1 ze2 d113 d114 d12 pl9:f1 d1 cw:f1 d13 do:f1 d12 pl1:f1p1 ph1 d0p1 ph2go=2 ph31d11 wr #0 if #0 ip1 zd lo to 3 times 2d11 id0lo to 4 times l3 exitph1= 0 2 2 0 1 3 3 1 ph2= 0 0 2 2 1 1 3 3ph31=0 2 2 0 1 3 3 1C脈沖序列分析a二自旋體系 考慮相循環(huán)的第一步l(/ltil izl iyl 1 y cos( iti ) 11 x sin( iti )cos( iti )(Iiy

7、 cos( Ji2ti ) 2Iixl2zSin( Ji2ti)sin( iti )(lixcos( Ji2ti) 211yl2zSin( J偌G )11 y cos( i ti )cos( Ji2ti )2lixl2zcos( iti)sin( Ji2ti ) l1xsin( iti )cos( J12t )211yl2zSin( iti )sin( J偌ti )(2)xliz cos( iti )cos( J12tI )2lixl2y cos( iti )sin( Ji2ti)l ix sin( iti )cos( J12t )2lizl2y sin( iti )sin( J12ti )第

8、一項(xiàng)為縱向磁化,第二項(xiàng)為多量子項(xiàng),均不能被觀測(cè)到；第三項(xiàng)仍然是第一核的橫向磁化,在檢測(cè)期的頻率同演化期類似,均是第一核的,對(duì) 應(yīng)于對(duì)角峰；第四項(xiàng)是第二核的反向磁化,在檢測(cè)期的頻率為第二核的化學(xué)位移,與演化期不同, 對(duì)應(yīng)于交叉峰,這是二維譜最有意義的峰.進(jìn)一步將后兩項(xiàng)的系數(shù)分解：1sin( iti )cos( J12t) -sin(i.,sin( iti )sin( Ji2ti) -cos(itiitiJ12t)sin( itiJi2ti ) cos( itiJi2ti )Ji2ti )可見,對(duì)角峰在 Fi維位于而交叉峰在Fi維也位于 正弦調(diào)制,另一個(gè)為余弦調(diào)制, 者不能同時(shí)調(diào)相成吸收型信號(hào).1

9、 ,同相裂分成兩個(gè)成分,距離 2 Ji2；i,但反相裂分成兩個(gè)成分,距離也是2對(duì)角峰信號(hào)與交叉峰信號(hào)在相位上相差Ji2o由于一個(gè)信號(hào)為 90度,故在Fi維兩再看F2維,對(duì)角峰為同向磁化l僅,在檢測(cè)期呈現(xiàn)同相裂分,距離交叉峰在F2維為反向磁化2l1zl2y ,在檢測(cè)期呈現(xiàn)反相裂分,距離也是2 Ji2；2 Ji2o由于個(gè)信號(hào)在x方向,另一個(gè)在y方向,兩者在相位上也相差 90度,故在F2維兩者也不能同時(shí) 調(diào)相成吸收型信號(hào).COSY的交叉峰為反相峰,這一點(diǎn)非常重要,決定了 COSY型實(shí)驗(yàn)采樣及處理時(shí)需要注意的問題.而交叉峰與對(duì)角峰在相位相差 影響.90度,對(duì)于譜圖在對(duì)角線附近的質(zhì)量有重要的b多自旋體系

10、 考慮li和l2間的交叉峰,類似的計(jì)算可得其系數(shù)為： Ksin( iti )sin( Ji2ti) cos( Jikti ) k 3其中的余弦項(xiàng)說明在 Fi維第一核相對(duì)除第二核(稱為主動(dòng)偶合)外的其他核(稱為被動(dòng)偶合)呈現(xiàn)同相裂分；同樣在F2維由于交叉峰的密度算符為第二核相對(duì)第一核的反相磁化,其中沒有出現(xiàn)被動(dòng)偶合核的算符,即相對(duì)于被動(dòng)偶合核為同相磁化,因此也呈現(xiàn)同相 裂分.pascal三角形描述；反相峰用反pascal三角形描述.當(dāng)其中一個(gè)核為甲基時(shí),由于磁全同的緣故,出現(xiàn)多重裂分：同相峰可用Fi維的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)也越大,而實(shí)驗(yàn)時(shí)間與Pascal triangle antiphase Pascal

11、triangle11J L3 d12110-11| 33111-1 -1|D 實(shí)驗(yàn)方案同其他二維譜相同處如確定譜寬,照射頻率,測(cè)定90度脈寬,選擇循環(huán)延遲時(shí)間等反相譜的特殊處1由于兩維的交叉峰均是反相峰,因此兩維都要有足夠的分辨率,否那么正負(fù)兩局部的信號(hào) 產(chǎn)生局部重疊,而使信號(hào)減弱；2交叉峰的觀測(cè)信號(hào)包含 sin( J12t1 )sin( Ji2t2), 由于同核偶合常數(shù)不大,通常幾Hz至十幾Hz,因.1 一 1此t1及t2的最大值要到達(dá) 至,這樣才能4J12 2J12獲得足夠強(qiáng)度的信號(hào),這相當(dāng)于62-125ms (假定4Hz的偶合常數(shù)).對(duì)于 t2一般不成問題,但 t1那么不然： 由于t1的

12、增量由譜寬確定,t1的最大值越大意味著 Fi維點(diǎn)數(shù)成正比.對(duì)一般蛋白質(zhì)而言,通常置照射頻率在水峰處,譜寬大致10ppm,接近5000Hz ,因此t1的增量為0.2ms,假設(shè)F1維點(diǎn)數(shù)取512, t1的最大值可達(dá)50ms左右；假設(shè)Fi維點(diǎn)數(shù)取1024, t1的最大值可達(dá)100ms左右.因此一般 Fi維點(diǎn)數(shù)取512至1024.左圖顯示不同F(xiàn)i維點(diǎn)數(shù)的QCHAPTER 6 EipfrimfwtLh NMR Method 效果：a t1max=69ms,NS=16;b t1max=34.5ms,NS=32;以18.084 8.03.1 3.0F2 tppm)An/Gi fr峰班c t1max=17.2

13、ms,NS=64E數(shù)據(jù)處理通常交叉峰總是調(diào)相成吸收線型,此 時(shí)對(duì)角峰呈色散線型.由于色散峰的 長(zhǎng)拖尾對(duì)靠近對(duì)角線的交叉峰產(chǎn)生干 擾,所以必須加適當(dāng)?shù)拇昂瘮?shù),通常 以不帶相移或略有相移的正弦函數(shù)或 正弦平方函數(shù).左圖顯示不同相移的正弦窗函數(shù)作用 于Fi維的效果：a 30 度；b 20 度；c 10 度；d 5 度F應(yīng)用在高場(chǎng)區(qū)由于化學(xué)位移的簡(jiǎn)并, 譜峰的重疊,對(duì)角峰的干擾,通常不 容易由COSY識(shí)別整個(gè)自旋系統(tǒng),在 蛋白質(zhì)COSY特別有用處是用于檢查 所謂的指紋區(qū)特別是酰胺質(zhì)子與質(zhì)子的交叉峰.在這個(gè)區(qū)域,脯氨酸由 于沒有氨基沒有交叉峰；甘氨酸有兩 個(gè) 質(zhì)子故有兩個(gè)交叉峰 除非兩者的 化學(xué)位移相同

14、；N端殘基上的NH由 于與水交換快也沒有交叉峰.除特殊情況外,對(duì)于不大的蛋白質(zhì),所有的峰都應(yīng)該能找到.CHAPTEH h'NNMA MtncoosFhjUW Ilk ihc 皿 llit OiSV /現(xiàn)ruw加方唾邛rml仃5小24,蛋白質(zhì)COSY上的幾個(gè)主要區(qū)域唱瓦M(jìn) TFL LAleucine,isoleucine,valine 側(cè)鏈交叉峰alanine,threonine 甲基區(qū)T9 T55T7 門 T22n 口跑SH6ESV5口時(shí)其G J偶合常數(shù)的測(cè)量在沒有被動(dòng)偶合時(shí),COSY的精細(xì)結(jié)構(gòu)可以用于測(cè)定 J偶合常數(shù),但直接由譜峰的裂分 得到的值有較大的誤差.11日颼6J0 ossc

15、r汨依3 Ummami»" plasc "即,"dmbl" jig1副 pu,t pUTiiwP 四篇 4d t-iTi(iwn a' lifKY.nJl kI 屆 Jjjfealijj n Imts、e $膽舊刷 w : 4,閡axRih qU adid cid 生胤策IUZ. All nirvCK 01四式 wll llw *line "劃上版t 1帕濁 1 ofinjly顯示表觀裂分與線寬的關(guān)系7.97.8797.8Fa (ppm)H COSY的變型1 COSY- 第二個(gè)90度脈沖用小于90度的脈沖代替,其結(jié)果是：對(duì)角峰

16、被減弱多核體系中被動(dòng)偶合產(chǎn)生的某些交叉峰被減弱,導(dǎo)致精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化,起到簡(jiǎn)化圖譜 的作用2 COSY-Type likPLRiMtMs上圖比擬 COSY-35 同普通COSY的圖 譜,GLY 的 1HN-1H 交叉峰結(jié)構(gòu)發(fā)生變 化,因而有利于 J 偶合常數(shù)的測(cè)定2 pre-TOCSYCOSY 預(yù)飽和同時(shí)抑制接近水峰的 H信號(hào),因而從 H到其他質(zhì)子特別是 NH的交叉峰 減弱甚至消失,而NH到H的交叉峰往往淹沒在水峰產(chǎn)生的 ti噪聲中.在pre-TOCSY COSY 中,在COSY序列前插入一個(gè)短時(shí)間的 TOCSY混合脈沖,使其他質(zhì)子的信號(hào)先傳遞給 H,這樣可局部恢復(fù) H到其他質(zhì)子的信號(hào).3 .2

17、.2 Relayed COSY(R-COSY)A所謂接力譜,COSY的一種擴(kuò)展,在 COSY的二個(gè)脈沖后加一個(gè)延遲,使反向磁化進(jìn) 步傳遞給第三個(gè)核,最后一個(gè) 90度脈沖完成第二核至第三核的相干傳遞,這樣觀測(cè)的第一核同第三核的交叉峰,雖然兩者可能并沒有 旋同屬一個(gè)自旋系統(tǒng).ref1 Pl2 P24 P 4° ,即J偶合.顯然,接力譜中的交叉峰說明兩個(gè)自左圖為R-COSY的脈沖序列,根本相循環(huán)為8步：1= 0 2 0 2 0 2 0 22= 0 0 0 0 2 2 2 23= 0 0 0 0 0 0 0 04= 0 0 2 2 0 0 2 2ref= 0 2 0 2 0 2 0 2整個(gè)循

18、環(huán)由二步1,二步2,二步4組成,而ref= 1,選擇條件變成2 P24 P4 0,由于三者均是完整的二步循環(huán),因此得選擇的相干傳遞1 Pl 1途徑為：P1= 1； P2=0, 2; P4=°, 2需要時(shí)可加上 CYCLOPS擴(kuò)展成32步循環(huán)B脈沖序列分析考慮三核體系,1, 2核間以及2, 3核間有J偶合,而1, 3核間無J偶合.同樣只考 慮第一步相循環(huán).經(jīng)過前二個(gè)脈沖作用,第一核產(chǎn)生的信號(hào)如COSY中所計(jì)算,在回波序列的作用下：22I1x sin(也)cos( J12L ) 2I1zl2ySin(缶)sin( J12L ) xlxcos( J12 ) 211yl2zSin( J12 )sln(小)cos( J5)2lzl2ycos( J23 ) 4I1zl2xl3zsin( J23 )sin(冷)sin(1/1 )cos( J12 )12xcos( J23 ) 212yl3zsin( J23 )sin(小)sin( J12L )sin( J12 )最后一個(gè)90度脈沖產(chǎn)生：lxcos( J12 ) 2l1zl2ysin( J12 )sin(也)cos( J12G )2l1yl2zcos( J23 ) 4l1yl2xl3y sin( J23 )sin(也)sin( J12G )cos( J12 )12xcos( J23 ) 2l2