植物組織中可溶性糖含量的測定（蒽酮比色法）(共8頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實驗方案一、 實驗?zāi)康耐ㄟ^實驗，掌握測定蘿卜品質(zhì)的方法（一） 蘿卜外部形態(tài)的測定1、 實驗材料取鮮樣3個小區(qū) 直尺、蒸餾水、筆、記錄本、吸水紙2、 實驗方法用自來水將各組蘿卜洗凈后，再用蒸餾水洗滌，擦干表面水分每個小區(qū)取3個重復(fù)，用電子天平稱量每株的鮮重，用直尺測量植株的莖長、莖粗、葉長，取平均值作為指標(biāo)值實驗(二) 植物體內(nèi)可溶性糖含量的測定（蒽酮法）一、實驗?zāi)康?了解蒽酮法測定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度計的使用二、實驗原理 糖類物質(zhì)是構(gòu)成植物體的重要組成成分之一，也是新陳代謝的主要原料和貯存物質(zhì)。不同載培條件，不同成熟度都可以影響水果、蔬菜中糖類的含量。因此

2、對水果、蔬菜中可溶性糖的測定，可以了解和鑒定水果、蔬菜品質(zhì)的高低。蒽酮比色定糖法是一個快速而方便的定糖方法，在強酸性條件下，蒽酮可以與游離的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（還原性和非還原性）作用生成藍綠色的糖醛衍生物，其顏色的深淺與糖的含量在一定范圍內(nèi)成正比。蒽酮也可以和其他一些糖類發(fā)生反應(yīng)，但顯現(xiàn)的顏色不同。當(dāng)存在含有較多色氨酸的蛋白質(zhì)時，反應(yīng)不穩(wěn)定，呈現(xiàn)紅色。上述特定的糖類物質(zhì)，反應(yīng)較穩(wěn)定。該法特點：靈敏度高，測定量少，快速方便。三、材料、儀器及試劑 1.材料：植物種子、白菜葉、柑桔2.儀器：分光光度計；恒溫水箱； 20ml具塞刻度試管（3支） 漏斗；100ml容量瓶；刻度試

3、管；試管架；剪刀；研缽3.試劑 （1）200g/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖：AR級葡萄糖100mg，蒸餾水溶解，定容至500ml。（2）蒽酮試劑：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光處貯藏；（3）濃硫酸四、實驗方法 1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支20ml具寒試管，編號，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮試劑，再緩慢地加入5ml濃H2SO4，搖勻后，打開試管塞，置沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻至室溫，在620nm波長下比色，測各管溶液的光密度值（OD），以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 管  號123456

4、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖原液(ml)(200g/ml)00.20.40.60.81.0蒸 餾 水2.01.81.61.41.21.0葡萄糖含量（g）040801201602002.樣品中可溶性糖的提取稱取1克白菜葉，剪碎，置于研缽中，加入少量蒸餾水，研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入20ml刻度試管中，用10ml蒸餾水分次洗滌研缽，洗液一并轉(zhuǎn)入刻度試管中。置沸水浴中加蓋煮沸10分鐘，冷卻后過濾，濾液收集于100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。3.糖含量測定用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度試管中，加1ml水和0.5ml蒽酮試劑。再緩慢加入5ml濃H2SO4（注意：濃硫酸遇水會產(chǎn)生大量的熱?。?，蓋上試管

5、塞后，輕輕搖勻，再置沸水浴中10分鐘（比色空白用2ml蒸餾水與0.5ml蒽酮試劑混合，并一同于沸水浴保溫10分鐘）。冷卻至室溫后，在波長620nm下比色，記錄光密度值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知對應(yīng)的葡萄糖含量（g）。五、結(jié)果計算樣品含糖量（g/100g鮮重）=查表所得糖含量（g）×稀釋倍數(shù)×100/樣品重（g）×106六、注意事項（1）加濃H2SO4時應(yīng)緩慢加入，以免產(chǎn)生大量熱量而爆沸，灼傷皮膚，如出現(xiàn)上述情況，應(yīng)迅速用自來水沖洗。（2）水浴加熱時應(yīng)打開試管塞。實驗（三） 維生素C的定量測定（2,6-二氯酚靛酚滴定法） 一、目的要求:（1）學(xué)習(xí)并掌握定量測定維生

6、素C的原理和方法。（2）了解蔬菜、水果中維生素C含量情況。二、實驗原理: 維生素C是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺少它時會產(chǎn)生壞血病，因此又稱為抗壞血酸（ascorbic acid）。它對物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。近年來，發(fā)現(xiàn)它還有增強機體對腫瘤的抵抗力，并具有化學(xué)致癌物的阻斷作用。 維生素C是具有L系糖型的不飽和多羥基物，屬于水溶性維生素。它分布很廣，植物的綠色部分及許多水果（如橘子、蘋果、草莓、山楂等）、蔬菜（黃瓜、洋白菜、西紅柿等）中的含量更為豐富。 維生素c具有很強的還原性。它可分為還原性和脫氫型。金屬銅和酶（抗壞血酸氧化酶）可以催化維生素C氧化為脫氫型。根據(jù)它具有還原性質(zhì)可測定

7、其金屬含量。 還原型抗壞血酸能還原染料2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身則氧化為脫氫型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈紅色，還原后變?yōu)闊o色。因此，當(dāng)用此染料滴定含有維生素C的酸性溶液時，維生素C尚未全部被氧化前，則滴下的染料立即被還原成無色。一旦溶液中的維生素C已全部被氧化時，則滴下的染料立即使溶液變成粉紅色。所以，當(dāng)溶液從無色變成微紅色時即表示溶液中的維生素C剛剛?cè)勘谎趸?，此時即為滴定終點。如無其它雜質(zhì)干擾，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所含還原型抗壞血酸量成正比。本法用于測定還原型抗壞血酸，總抗壞血酸的量常用2,4-二硝基苯肼法和熒光分光光度法測定。 三、試劑和器

8、材: （一）試劑2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸餾水中。1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸餾水中。標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液（1mg/ml）: 準(zhǔn)確稱取100mg純抗壞血酸（應(yīng)為潔白色，如變?yōu)辄S色則不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中，冷藏。最好臨用前配制。0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150ml含有52mg NaHCO3的熱水中，冷卻后加水稀釋至250ml，貯于棕色瓶中冷藏（4）約可保存一周。每次臨用時，以標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液標(biāo)定。（二）材料辣椒、蘋果、卷心菜等。（三）器材錐形瓶（100ml），組織搗碎器，吸量管（10ml），漏

9、斗，濾紙，微量滴定管（5ml），容量瓶（100ml，250ml）。四、操作方法:1.提取水洗干凈整株新鮮蔬菜或整個新鮮水果，用紗布或吸水紙吸干表面水分。然后稱取20g，加入20ml 2%草酸，用研缽研磨，四層紗布過濾，濾液備用。紗布可用少量2%草酸洗幾次，合并濾液，濾液總體積定容至50ml。2.標(biāo)準(zhǔn)液滴定準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液1ml置100ml錐形瓶中，加9ml 1%草酸，用微量滴定管以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡紅色，并保持15s不褪色，即達終點。由所用染料的體積計算出1ml染料相當(dāng)于多少毫克抗壞血酸（取10ml 1%草酸作空白對照，按以上方法滴定）。3.樣品滴定準(zhǔn)確吸取濾液兩

10、份，每份10ml, 分別放入2個錐形瓶內(nèi)，滴定方法同前。另取10ml 1%草酸作空白對照滴定。4.計算式中：VA為滴定樣品所耗用的染料的平均毫升數(shù)； VB為滴定空白對照所耗用的染料的平均毫升數(shù)； C為樣品提取液的總毫升數(shù)；D為滴定時所取的樣品提取液毫升數(shù)；T為1ml染料能氧化抗壞血酸毫克數(shù)（由操作二計算出）；W為待測樣品的重量（g）。五、注意事項:1.某些水果、蔬菜（如橘子、西紅柿等）漿狀物泡沫太多，可加數(shù)滴丁醇或辛醇。2.整個操作過程要迅速，防止還原型抗壞血酸被氧化。滴定過程一般不超過2min。滴定所用的染料不應(yīng)小于1ml或多于4ml，如果樣品含維生素C太高或太低時，可酌情增減樣液用量或改變

11、提取液稀釋度。3.本實驗必須在酸性條件下進行。在此條件下，干擾物反應(yīng)進行得很慢。4.2%草酸有抑制抗壞血酸氧化酶的作用，而1%草酸無此作用。5.干擾滴定因素有：若提取液中色素很多時，滴定不易看出顏色變化，可用白陶土脫色，或加1ml氯仿，到達終點時，氯仿層呈現(xiàn)淡紅色。Fe2可還原二氯酚靛酚。對含有大量Fe2的樣品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此時Fe2不會很快與染料起作用。樣品中可能有其它雜質(zhì)還原二氯酚靛酚，但反應(yīng)速度均較抗壞血酸慢，因而滴定開始時，染料要迅速加入，而后盡可能一點一點地加入，并要不斷地搖動三角瓶直至呈粉紅色，于15s內(nèi)不消退為終點。6.提取的漿狀物如不易過濾，亦可離心，留取上

12、清液進行滴定。六、思考題：1為了測得準(zhǔn)確的維生素C含量，實驗過程中都應(yīng)注意哪些操作步驟？為什么？2試簡述維生素C的生理意義。實驗（四） 蛋白質(zhì)含量測定（考馬斯亮藍G250法）一、目的1.學(xué)習(xí)一種蛋白質(zhì)染色測定的方法2.掌握考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量的基本原理和方法二、原理蛋白質(zhì)的存在影響酸堿滴定中所用某些指示劑的顏色變化，從而改變這些染料的光吸收。在些基礎(chǔ)上發(fā)展了蛋白質(zhì)染色測定方法。涉及的指示劑有甲基橙、考馬斯亮藍、溴甲酚綠和溴甲酚紫。目前廣泛使用的染料是考馬斯亮藍?？捡R斯亮藍G-250在酸性溶液中為棕紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合后，變?yōu)樗{色，且在蛋白質(zhì)一定濃度范圍內(nèi)符合比爾定律，可在5

13、95nm處比色測定。25分鐘即呈最大光吸收，至少穩(wěn)定1小時。在0.011.0 mg蛋白質(zhì)/ml范圍內(nèi)均可。該法操作簡便迅速，消耗樣品量少，但不同蛋白質(zhì)之間差異大，且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去污劑時測定有干擾。緩沖液濃度過高時，改變測定液pH值會影響顯色?？捡R斯亮藍染色能力強，比色杯不洗干凈會影響光吸收值，不可用石英懷測定。三、器材與試劑1.儀器（1）分析天平；（2）具塞刻度試管10ml×8；（3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I；（4）研缽；（5）漏斗；（6）離心管10ml；（7）

14、容量瓶10ml；（8）離心機；（9）721型分光光度計2.試劑 （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100ml，制成 100 pgml的原液。 （2）考馬斯亮藍G250蛋白試劑 稱取100mg考馬斯亮藍G250，溶于50ml 90乙醇中，加入 85（mv）的磷酸 100ml，最后用蒸餾水定容到 1000ml。此溶液在常溫下可放置一個月。3.材料 植物種子四、操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支具塞試管，編號后，按下表加入試劑。操作項目管 號1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0蒸餾水(ml)1.0 0.8 0.6 0

15、.4 0.2 0G-250試劑(ml)各5蛋白質(zhì)含量（g）0 20 40 60 80 100 蓋上塞子，搖勻。放置2min后在595 nm波長下比色測定（比色應(yīng)在 l h內(nèi)完成）。以牛血清白蛋白含量（g）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品中蛋白質(zhì)含量的測定（1）準(zhǔn)確稱取約200mg綠豆芽下胚軸，放入研缽中，加入5ml蒸餾水在冰浴中研成勻漿，離心（4000rmin，10min），將上清液倒入10ml容量瓶，再向殘渣中加入2ml蒸餾水，懸浮后再離心10min，合并上清液，定至刻度。（2）另取1支具塞試管，準(zhǔn)確加入0.l ml樣品提取液，再加入0.9 ml蒸餾水，5ml考馬斯亮藍G2

16、50試劑，充分混合，放置2min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號試管做參比，在595 nm波長下比色，記錄吸光度。3.結(jié)果處理根據(jù)所測樣品提取液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量（g），按下式計算： 樣品蛋白質(zhì)含量（gg鮮重）（查得的蛋白質(zhì)含量（g）×提取液總體積（ml）（樣品鮮重（g）×測定時取用提取液的體積（ml）六、注意事項1.由于染料本身的兩種顏色形式的光譜有重疊，試劑背景值會因與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料增加而不斷降低，因而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較大時，標(biāo)準(zhǔn)曲線稍有彎曲，但直線彎曲程度很輕，不致影響測定2.測定工作應(yīng)在蛋白質(zhì)染料混合后2min開始，力爭1hr內(nèi)完成，否則會因蛋白質(zhì)一染料復(fù)合

17、物發(fā)生凝集沉淀而影響測定結(jié)果。3.樣品中的Tris、乙酸、2-巰基乙醇、EDTA等物質(zhì)對實驗結(jié)果有少量顏色干擾，可以在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時可以用緩沖液代替蒸餾水，就可以將干擾扣除，（五）有機酸含量的測定一、實驗?zāi)康?.掌握強堿滴定弱酸的基本原理和指示劑的選擇；2.學(xué)會有機酸含量的測定方法；3.進一步熟練滴定操作技術(shù)。二、實驗原理大多數(shù)有機酸是弱酸，如果某有機酸易溶于水，解離常數(shù)10-7，用標(biāo)準(zhǔn)堿可以直接測其含量，反應(yīng)產(chǎn)物為強堿弱酸鹽。本實驗我們選用的有機酸是苯甲酸，其解離常數(shù)Ka為6.2×10-5，若CspKa10-8采用指示劑判斷終點時,直接準(zhǔn)確滴定某一元弱酸的可行性判據(jù)。Csp是計量點時體積計算被滴定物質(zhì)的分析濃度。如果我們配制的苯甲酸濃度不是特別小，就可以用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液直接測定其含量，計量點時反應(yīng)產(chǎn)物為強堿弱酸鹽，滴定突躍在堿性范圍內(nèi)，可以選用酚酞指示劑，滴定溶液由無色變?yōu)槲⒓t色即為終點。根據(jù)N