流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用

1、第十七章第十七章 流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。 細(xì)胞組成細(xì)胞組成細(xì)胞功能細(xì)胞功能大小大小細(xì)胞表面細(xì)胞表面/ /胞漿胞漿/ /核核-特異性抗原特異性抗原粒度粒度細(xì)胞活性細(xì)胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞內(nèi)細(xì)胞因子胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子鈣離子, PH, PH值值, , 膜電位膜電位酶活性酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性采用激光作為激發(fā)光源，利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記

2、技術(shù)用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，一、工作原理 （1） 液流系統(tǒng) （2） 光學(xué)系統(tǒng) （3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)： 由樣本和鞘液組成由樣本和鞘液組成 待測(cè)細(xì)胞待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色 受受清潔氣體壓力清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流（1）液流系統(tǒng)鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而

3、細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。阻塞噴孔。噴嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液液流系統(tǒng)示意圖FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管鞘液管 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長(zhǎng)分色反光鏡：反射長(zhǎng)/ /短波長(zhǎng)，通過(guò)短短波長(zhǎng)，通過(guò)短/ /長(zhǎng)波長(zhǎng)長(zhǎng)波長(zhǎng) 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光 濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS, SSFS, SS（散射光），（散射光），

4、FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector光學(xué)系統(tǒng)示意圖主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本工作原理單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動(dòng)室噴嘴熒光檢測(cè)系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號(hào)熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過(guò)程區(qū)別區(qū)別流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀顯微鏡顯微鏡光源光源激光激光自然光、燈光自然光、燈光對(duì)象對(duì)象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、組織等細(xì)胞、組織等承載

5、工具承載工具鞘液及流動(dòng)室鞘液及流動(dòng)室載玻片載玻片檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)信號(hào)光學(xué)信號(hào)光學(xué)信號(hào)形態(tài)及染色形態(tài)及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大電路、放大電路目鏡目鏡物鏡、光學(xué)放大物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)，50005000人工，人工，200200結(jié)果結(jié)果多參數(shù)，綜合分析多參數(shù)，綜合分析簡(jiǎn)單，單參數(shù)簡(jiǎn)單，單參數(shù)流式細(xì)胞儀與顯微鏡的區(qū)別 細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光的測(cè)定前向散射光前向散射光（forward scatter, forward scatter, FSFS）：

6、激光束照射細(xì)胞時(shí)，激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度光以相對(duì)軸較小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的訊號(hào)用于向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比正比。FALS SensorLaser前向散射光示意圖側(cè)向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)向散射光示意圖 測(cè)得的測(cè)得的FSFS與與SSSS信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到理，可得到FS-SSFS-SS圖，圖，由

7、此可僅用散射光由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。選。 此為血細(xì)胞分此為血細(xì)胞分類的基本原理，但類的基本原理，但不能分析表面分子。不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光染料的特性熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)熒光補(bǔ)償 通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。四、細(xì)胞分選原理細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)不充電充電（一）分選基本原理 參數(shù)

8、：參數(shù)：FS,SS,FLFS,SS,FL 數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖 、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖 、二維等高圖、二維等高圖 、假三維等高圖假三維等高圖 、三參數(shù)散點(diǎn)圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖 ） 設(shè)門分析技術(shù)設(shè)門分析技術(shù) 第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析FSFS：反映顆粒的大?。悍从愁w粒的大小SSSS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FLFL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、 參數(shù) 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖: :點(diǎn)圖點(diǎn)圖 二維等高圖二維等高圖 假三維等高圖假三維等高圖 三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析

9、多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式 由一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒光散射光或熒光) )與顆粒計(jì)數(shù)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道(channel )1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖 多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)

10、胞儀的多參數(shù)分析 Gate Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 三、設(shè)門分析技術(shù)A 淋巴細(xì)胞B 單核細(xì)胞C 中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門線性門Region設(shè)置設(shè)置: 區(qū)閾（區(qū)閾（region, R）與門）與門(gate, G ) 是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可

11、與門對(duì)應(yīng)，是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門。但是也可以包含于門。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時(shí)，起就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。 樣本制備樣本制備 標(biāo)記染色標(biāo)記染色 液相芯片技術(shù)液相芯片技術(shù) 質(zhì)量控制質(zhì)量控制 第四節(jié)第四節(jié) 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求求 外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備分離單個(gè)核細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備 蛋白酶消化蛋白酶消化 機(jī)械吹打機(jī)械吹打 使貼壁細(xì)胞脫落使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌洗

12、滌 尼龍網(wǎng)過(guò)濾尼龍網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液一、免疫檢測(cè)樣品制備新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備 機(jī)械法機(jī)械法 酶處理法酶處理法 化學(xué)試劑處理法化學(xué)試劑處理法 表面活性劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存單細(xì)胞懸液的保存 深低溫保存法（一年）深低溫保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周） 甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）適用條件適用條件: : 有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù) 對(duì)對(duì)488nm488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收 發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光

13、波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差 易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料名稱名稱染料染料激發(fā)激發(fā)波長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光顏熒光顏色色溶解性溶解性對(duì)對(duì)PHPH敏感敏感性性特點(diǎn)特點(diǎn)異硫氰酸熒異硫氰酸熒光素光素FITCFITC488488綠綠 525525易易敏感敏感易溶于水，與抗體結(jié)易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性合不影響特異性得州紅得州紅Texas Texas redred568568紅紅 61561

14、5不易不易不敏感不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低額低藻紅蛋白藻紅蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488別藻青蛋白別藻青蛋白APCAPC633633紅紅670670能量傳遞復(fù)能量傳遞復(fù)合染料合染料PEcy5PEcy5488488紅紅670670易易不敏感不敏感減少交叉，成本高減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm488nm激發(fā)光照射下，激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒

15、光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制第四節(jié)第四節(jié) 在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用T T淋巴細(xì)胞及其亞群分析淋巴細(xì)胞及其亞群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細(xì)胞及其亞群分析淋巴細(xì)胞及其亞群分析B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生產(chǎn)生IgM型自身抗體型自身抗體, 參與免疫調(diào)節(jié)、參與免疫調(diào)節(jié)

16、、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)B2(CD19+CD5-):受外來(lái)抗原刺激受外來(lái)抗原刺激, 產(chǎn)生高親和性特異產(chǎn)生高親和性特異性抗體性抗體NK細(xì)胞分析細(xì)胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析 細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)( (死細(xì)胞與活細(xì)胞比例死細(xì)胞與活細(xì)胞比例) ) 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定二、淋巴細(xì)胞功能分析二、淋巴細(xì)胞功能分析三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對(duì)淋巴瘤和白血病進(jìn)行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預(yù)后及檢出微小殘留病變CD4+Th細(xì)胞、CD4+/CD8+比例MDR(+)表示對(duì)化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析四

17、、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用HLA-B27可出現(xiàn)在58%97%的強(qiáng)直性脊椎炎(As) 患者六、自身免疫病相關(guān)六、自身免疫病相關(guān)HLA抗原分抗原分析析 FCM作為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，已應(yīng)用于作為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，已應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，其在移植免疫分析中的應(yīng)用也越多個(gè)領(lǐng)域，其在移植免疫分析中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。目前移植免疫中的來(lái)越廣泛。目前移植免疫中的FCM應(yīng)用主要應(yīng)用主要包括流式細(xì)胞術(shù)的交叉配型（包括流式細(xì)胞術(shù)的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和）和群體反應(yīng)性抗體（群體反應(yīng)性抗體（Panel reactive antibody, PRA）檢測(cè)。）檢測(cè)。七、移植免疫中的應(yīng)用七、移植免疫中的應(yīng)用 （1） 液流系統(tǒng) （2） 光學(xué)系統(tǒng) （3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)： 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長(zhǎng)分色反光鏡：反射長(zhǎng)/ /短波長(zhǎng)，通過(guò)短短波長(zhǎng)，通過(guò)短/ /長(zhǎng)波長(zhǎng)長(zhǎng)波長(zhǎng) 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光 濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS