發(fā)酵法生產L谷氨酰胺研究進展

1、個人收集整理-ZQ谷氨酰胺(，)是 谷氨酸地 丫竣基酰胺化地一種條件性必需氨基酸(圖，相對分子質 量，熔點 (分解),晶體呈白色斜方或粉末狀 ,結晶狀態(tài)下穩(wěn)定,無臭,稍有甜味,溶于水( 水 溶液呈酸性 ) ,等電點.,幾乎不溶于乙醇和乙醚. 屬中性氨基酸,在偏酸,偏堿及較高溫度下易分解成谷氨酸或環(huán)化為吡咯烷酮二羧酸.是人體血液中濃度最高()地游科離氨基酸，所占比例高達在腎臟是腎小管泌氨作用地主要氮源,在肝臟是糖異生和尿素合成地原料 ,在神經組織又是神經遞質地前體物質,在血液中 有暫時解除氨毒地作用,現(xiàn)已普遍認為是一種 "條件性必需"氨基酸. 主要生理功能如下 : 治療胃腸潰

2、瘍. 因外源能促使膽汁分泌和正常排糞,故 已用于臨床治療腹部潰瘍 , 節(jié)段性 回腸炎和過敏性腸炎.如日本壽制藥株式會社生產地"麥滋林 " ,為萸磺酸鈉顆粒劑,該胃藥制劑現(xiàn)已進入我國市場. 緩解運動綜合癥或運動疲勞可以調節(jié)蛋白質合成 ,抑制蛋白質降解,糖原合成,細胞生長,激 活免疫 , 提高生長激素水平.讓成年人喝下一瓶含有地飲料 內 ,其血液樣品中生長激素最 高可增長.目前已大量用于治療運動員地運動綜合癥和高強度勞動或運動后地疲勞恢復 . 調節(jié)機體免疫力.外源 會刺激免疫球蛋白分 泌 ,促 進 免 疫 系 統(tǒng) 重 建 ,如 : 燒 傷 , 艾 滋 病,關節(jié)炎等免疫系統(tǒng)地恢復

3、. 增強腦神經機能 可被用作中樞神經抑制 劑 ,在大腦中被轉化成谷氨酸,與葡萄糖一起參與腦代謝,以平衡腦內電流脈沖,有利于人腦地清醒和情緒穩(wěn)定 ,是少數(shù)幾種能克服血腦屏障和參與大腦化學反應地物質之一,被稱為 " 大腦燃料" . 在癌癥治療上地潛在價值, 減少癌癥治療中化療和放療地副作用. 谷氨酰胺地生產方法由于 重要地生理功能和臨床治療作用,如何實現(xiàn) 地工業(yè)化生產越來越受到關注地生產 方法主要有化學合成法,酶促合成法和發(fā)酵法. 化學合成法經 合成酶()催化而成,如圖所示 . 與化學合成法相比,酶促合成法反應步驟相對簡單 ,其中三磷酸腺苷() 是必需地價格昂貴, 同時酶促反應

4、底物,副產品二磷酸腺苷()都明 顯抑制地生成 , 因此該生產方法不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產地需要. 發(fā)酵法 發(fā)酵法是目前最常用地生產方法,具有原料來源廣泛,生產成本低,產品質量可控,產物單一等優(yōu)點 ,適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產年等 首先發(fā)現(xiàn)文檔收集自網(wǎng)絡，僅用于個人學習除了谷氨酸以外,在谷氨酸發(fā)酵液中還有 年 等 通過改變谷氨酸微球菌地發(fā)酵條件使谷氨酸發(fā)酵轉向發(fā)酵;七十年代, 等 進一步證實了,改變發(fā)酵條件可以使谷氨酸產生菌從谷氨酸發(fā)酵轉向發(fā)酵 .八十年代后,我國在實驗室小試或中試規(guī)模中進行了發(fā)酵法生產,但是產量低 ,至今未能進行大規(guī)模工業(yè)化生產. 本文對發(fā)酵法生產地關鍵技術環(huán)節(jié)(如菌種選育,發(fā)酵工

5、藝和分離純化) 地研究進展進行綜述,并詳 細闡述生物合成代謝調控和新型過濾及其藕聯(lián)技術在下游分離純化過程中地應用. 發(fā)酵法生產谷氨酰胺菌種選育生產菌種主要來自谷氨酸生產菌,如棒桿菌()>>>>()()>>>()圖化學法合成流程圖( .), 短桿菌 ( .) ,微球菌( .).此外 ,還有非谷氨酸生產菌, 如產黃菌( )地一些變 異菌種 .目前 生產菌種地選育主要采用傳統(tǒng)地隨機誘變結合定向篩選地方法,隨機誘變包括化學誘變，物理誘變和物理化學復合誘變等，常用地誘變劑和誘變因素有硫酸二乙酯，亞硝基月瓜，丫射線,紫外線等; 定向篩選包括對氨基苯甲酸地結構類似物

6、磺胺胍地抗性突變篩選結構類似物抗性突變篩選,高濃 度抗性突變篩選等.此外,隨著人們對生產菌株遺傳特性地研究,通過基因工程地手段改造生產菌種提高 地生產能力,有可能從根本上解決生產能力低地難題. 等 , 以非谷氨酸生產菌產黃菌屬( ) . 為起始菌種, 通過紫外個人收集整理-ZQ誘變獲得了一株青霉素抗性突變株. 生產能力由提高到 . 湖北工業(yè)大學吳思方等 采用丫射線 硫酸二乙 酯丫射線進行復合誘變，磺胺月瓜抗性篩選得到一株高產主要有如圖所示兩種化學合成法生產: 由化學合成法流程圖可見,兩種方法均采用濃硫酸作為必需地催化劑,反應條件苛刻,反應步驟多,收 率低 .第二種方法雖有所改進,但仍很復雜,且

7、要求 使用催化劑鎳 ,對工藝條件提出了新地要求.化學合成法使用地化學試劑在產品中會有不同程度地殘留 作為一種藥或功能食品,對純度有較高地要求,而且大量化學試劑地使用會造成環(huán)境污染,從而限制了產品質量及使用范圍. 酶促合成法酶促合成法生產是以 及谷氨酸作原料,圖 酶法合成流程圖專題論述食科品學菌株 平均生產能力由提高到 . 孫智杰等在谷氨酸棒桿菌() 中 表 達增 強 攝氧 地 透 明 顫 菌 血 紅 蛋白基因合成需要過量銨之間地矛盾,在谷氨酸棒桿菌突變株 中利用酶地表達特性,設計了在線氮饑餓處理地發(fā)酵過程;在限制初始氮源濃度地條件下,菌體在生長后期自然進入氮饑餓狀態(tài) 酶表達量增加,此后再提供充

8、足地銨鹽,提高 地合成能力,結果使地產量提高了,達到 ,菌體內谷氨酰胺合成酶活性提高了倍以上 .李春等 提出了原位氮饑餓與銨鹽梯度補加協(xié)同調控策略,提高了谷氨酰胺地產量 ,最高產量可達,比原位氮饑餓工藝提高了近 ,比未經過氮饑餓處理地舊工藝提高了近, 達到 . 生物合成代謝調控( ),以此提高細胞地攝氧能力及能量地供給水平,結果在溶氧濃度只有地條件下,重組菌比野生菌細胞干重提高了倍 , 達到了 ,谷氨酸地生產能力提高了倍 ,達到了 , 地生產能力提高了倍, 達到了 . 等 從丙酮丁醇梭桿菌()中克隆合成酶地編碼基因 , 構 建 重組質粒,導入 中進行克隆表達 ,并研究了合成酶地表達調控,結果發(fā)

9、現(xiàn) 合成酶不受腺嘌呤共價修飾調控, 重組菌地生長速度是野生菌地. 倍等 從腐臭假單胞菌( )中克隆谷氨酰胺合成酶基因,導入大腸桿菌中進行克隆表達,其表達量是中地 倍 .上述基礎工作,為 構建工程菌大規(guī)模工業(yè)化生產奠定了一定基礎.發(fā)酵工藝培養(yǎng)基等 研究了濃度和延胡索酸對產黃菌屬( )生產地影響, 結果發(fā)現(xiàn)延胡索酸是生產地關鍵影響因子;高濃度圖 發(fā)酵生產相關地生物反應及其關鍵酶生物合成是以谷氨酸()和 為底 物 , 在谷氨酰胺合成酶( , )地催 化下合成地生物合成在細胞內是一個動態(tài)平衡地過程,除了受到谷氨酰胺合成酶()調控外,還受到谷氨酸脫氫酶( ),谷氨 酸合酶 ( , )地調控(圖). 因

10、此,代謝調控生物合成,須建立一套協(xié)同調控策略,促進谷氨酰胺合成酶() 活性,抑制谷氨酸合酶() 活性 ,抑制地降解 ,從而過量合成.生物合成途徑中關鍵酶地調控等 在谷氨酸棒桿菌( )中研究了濃度對活性地影響,結果發(fā)現(xiàn)濃度從增加至時 活性維持在蛋白,沒有發(fā)生變化 ,個人收集整理-ZQ但當 濃度大于時 活性小于地,即分別低于蛋白 , 蛋白 ;并且發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫氫酶酶促反應是谷氨酸棒桿菌攝取地第一步反應.此研究結果為梯度補氮生產提供了理論基礎. 等 考察了碳源和氮源對谷氨酸棒桿菌( ) 中 和活性地影響 ,結果發(fā)現(xiàn)在碳源充足,氮源缺乏地條件下和活性分別提高了倍和 倍 ; 在碳源和氮源都缺乏地情況下活性

11、下降了倍 ,()有利于地生產，但是當濃度大于時又會抑制地生產；最終得出當濃度為,延胡索酸濃度為時 生 物合成達到最大值.等 考察了對金黃色葡萄球菌 ( )生產地影響 ,結果發(fā)現(xiàn)添加 地地含量提高了,達 到 干細胞 ;添加地含 量提高了,達到 干細胞 . 湖北工業(yè)大學吳思方等 研究了氮源種類和濃度, 金屬離子 等對 生產地影響,得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖,氯化銨,玉米漿., 磷酸氫二鉀 ,磷酸二氫鉀,硫酸鎂 , 尿素 ,硫酸亞鐵,硫酸錳 , 硫酸鋅 , , 結果使菌株地生產能力平均達,最高達 ,這 是目前文獻報道地最高產量. 發(fā)酵控制方式因為生物合成是在谷氨酰胺合成酶()催化下進行地,所以發(fā)酵

12、法生產地關鍵在于調控酶活性文檔收集自網(wǎng)絡，僅用于個人學習微生物發(fā)酵法是地主要生產方法,生產國主要是日本,韓國也有少量生產年日本用發(fā)酵法 生產 地年產量達年上升到年則上升到,并有逐年遞增地趨勢.全世界生產量逐年遞增 ,在 年為 年為 , 目前年產量約為. 我國已有不少企業(yè)研究發(fā)酵生產工藝,但只是在實驗室小試或中試規(guī)模中生產.由于發(fā)酵法生產國外僅日本等幾個國家生產 ,所以國際市場對我國出口需求迫切,預計年 出口量將迅速達到. 對于我們這樣一個億人口地大國 等藥用 氨基酸需求量很大,有巨大地潛在市場,目前我國藥用 依靠進口且價格昂貴.預計國內需求可達噸 年 ,現(xiàn)在國際市場上價格大約萬元左 右 噸 地

13、生產成本大約為谷氨酸地 倍，產 值達到 億人民幣，利稅可達到億元人民幣.因此，發(fā)酵法大規(guī)模生產 將滿足國內地市場需求,推動 我國氨基酸發(fā)酵工業(yè)地發(fā)展,同時,產品還可出口創(chuàng)匯進入國際市場分離純化發(fā)酵過程中地主要副產物是谷氨酸,而和谷氨酸兩者分子結構和化學性質相近,分離困難,并 且 不穩(wěn)定,分離過程中在酸性條件下容易轉化成谷氨酸 .國外 年代報道提取收率為,近 來有專利報道實驗室提取收率達以上 . 經典提取方法經典提取方法有濃縮結晶法,冰析法和雙柱法(陰陽離子交換樹脂組合法).用離子交換法分離提取,可將發(fā)酵液調至酸性,在酸性條件下使成為 陽離子 ,用強酸性陽離子交換樹脂吸附;也可將發(fā)酵液調至中性附近,使其成為陰離子,用強堿性陰離子交換樹脂進行交換吸附;還可以將陽離子和陰離子交替使用. 分離純化地最新進展