病原微生物應(yīng)急檢測

1、病原微生物應(yīng)急檢測柯昌文廣東省疾病預(yù)防控制中心一、病原微生物引起的傳染病我國傳染病法規(guī)定的法定報告?zhèn)魅静》诸悾杭?、乙、?類，從數(shù)量上共有39種，主要由病毒、細(xì)菌和寄生蟲引起。 （一）甲類傳染病主要鼠疫和霍亂。 （二）乙類傳染病 （1）病毒引起的：傳染性非典型肺炎、人感染高致病性禽流感、新型甲型H1N1流感、麻疹、病毒性肝炎、艾滋病、脊髓灰質(zhì)炎、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎。（2）細(xì)菌引起的：傷寒和副傷寒、淋病、梅毒、百日咳、白喉、流行性腦脊髓膜炎、猩紅熱、鉤端螺旋體病、布魯氏菌病、炭疽、肺結(jié)核、新生兒破傷風(fēng)。（3）寄生蟲和細(xì)菌：瘧疾、血吸蟲病、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾。 （三）丙類傳染病

2、（1）病毒引起的主要有：流行性感冒、流行性腮腺炎、急性出血性結(jié)膜炎、手足口病、風(fēng)疹及除霍亂、痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病。（2）細(xì)菌和寄生蟲引起的：麻風(fēng)病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、絲蟲病、包蟲病。（四）病原微生物引起的綜合征1、急性腹瀉綜合征（1）細(xì)菌性腹瀉：霍亂弧菌、志賀氏菌、大腸桿菌（腸毒素性和腸出血性）、沙門菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌、艱難梭菌等。（2）病毒性腹瀉：輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒、埃博拉和其他出血熱病毒等。（3）寄生蟲性腹瀉：痢疾阿米巴、隱孢子蟲、賈迪鞭毛蟲等。 2、急性出血熱綜合征登革熱病毒、漢坦病毒、克里米亞-剛果熱病毒、埃博拉病毒、拉薩熱病毒、馬爾

3、堡出血熱病毒、裂谷熱病毒、南美沙粒病毒、蜱傳播的黃病毒、黃熱病病毒等。3、急性黃疸綜合征A，B，E型肝炎病毒、鉤端螺旋體、黃熱病病毒等、 4、急性神經(jīng)性綜合征(1)細(xì)菌性腦膜炎：腦膜炎奈瑟氏菌、鉤體、肺炎鏈球菌、嗜血流感桿菌、大腸桿菌、李斯特菌等。(2)病毒性腦炎：乙型腦炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、腸道病毒、蜱傳播的腦炎病毒等(3)寄生蟲性腦炎：錐形蟲、瘧原蟲等。 5、急性呼吸綜合征（1）細(xì)菌性：炭疽桿菌、鼠疫桿菌、百日咳桿菌、白喉桿菌、A群鏈球菌、TB、軍團(tuán)菌、支原體、衣原體等。（2）病毒性：冠狀病毒、流感和禽流感病毒、肺綜合征漢坦病毒和腺病毒等。 6、急性皮膚綜合征水痘病毒、麻疹病毒、風(fēng)

4、疹病毒、腸道病毒71、柯薩奇病毒A組16型、斑疹傷寒立克次氏體、炭疽桿菌、猴豆病毒、細(xì)小病毒B19、基孔肯雅熱病毒等。 7、急性眼綜合征腺病毒、腸道病毒、沙眼衣原體 8、急性全身性綜合征炭疽桿菌、鼠疫桿菌、布氏菌、傷寒沙門菌、鉤體、HIV、登革病毒、漢坦病毒、瘧原蟲萊姆病螺旋體。 二、應(yīng)急檢測的目的和意義應(yīng)急檢測的目的和意義是1、識別暴發(fā)、確定病因2、確定傳染來源3、確定傳播鏈和流行范圍4、發(fā)現(xiàn)新的病原微生物5、提供仲裁依據(jù) 三、病原微生物的特點及其應(yīng)急檢測病毒不是完整的生物體，結(jié)構(gòu)簡單，需要再電子顯微鏡下才能看清楚。電鏡是研究病毒和細(xì)胞相互作用的重要工具，但是在診斷實驗室的使用卻非常有限。要

5、想直接用電鏡觀察檢測病毒，樣品必須含有高滴度的病毒顆粒（106到107個 / ml）但也可通過樣品濃縮和使用標(biāo)記抗體提高敏感性。電鏡主要用于不可培養(yǎng)的病毒檢測，特別是病毒性胃腸炎病原體檢測。細(xì)菌的診斷相對容易，培養(yǎng)也較方便。 （一）病原微生物及其抗原和核酸的檢測方法和初步結(jié)果報告時限1、分離培養(yǎng)（細(xì)菌：4872小時，病毒1428天）2、免疫熒光法（48小時）3、固相免疫分析膠體金法（3060分鐘）4、酶聯(lián)免疫分析（ELISA) （48小時）5、核酸擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） （48小時）6、實時熒光PCR （34小時）7、核酸序列分析（1624小時）8、形態(tài)學(xué)診斷（ 2472小時） 二）血清

6、學(xué)抗體檢測方法和初步結(jié)果報告時限1、ELISA檢測感染早期IgM抗體（48小時）2、ELISA檢測感染急性期和恢復(fù)期IgG抗體（48小時）3、病毒抗體中和試驗測定急性期和恢復(fù)期中和抗體（7天）4、血球凝集抑制檢測病毒抗體（48小時）5、試管凝集試驗檢測細(xì)菌抗體（48小時）6、間接血球凝集抑制試驗檢測病毒抗體（48小時）7、補(bǔ)體結(jié)合試驗（2448小時） （三）選擇檢驗方法需考慮的因素1、疑似病原微生物感染的病理學(xué)知識2、病人感染的病程和采樣時間3、各種方法對疑似病原微生物感染的適用性4、可用于檢測標(biāo)本類別 （四）實驗室結(jié)果的意義和解釋1、病原微生物感染的實驗室診斷需要多方面的信息，包括：對可疑病

7、原體的致病機(jī)理的理解，對感染階段的認(rèn)識，被感染者的年齡和免疫狀況等。2、病原微生物分離培養(yǎng)的成功與多個因素有關(guān)，包括：選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)本，仔細(xì)收集標(biāo)本以最大限度收集到致病因子，標(biāo)本的運輸必須盡量保持病原體活性，減少污染菌的增殖等。3、如果從疑似病人的標(biāo)本中分離到目標(biāo)細(xì)菌和病毒，可以確診。4、如果在疑似病人的標(biāo)本中檢測到目標(biāo)細(xì)菌和病毒核酸，可以確診。5、如果目標(biāo)病原微生物感染的中和抗體或IgG抗體或其他方法測定的抗體滴度穩(wěn)定維持在高水平，或者出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)血清抗體滴度，或是恢復(fù)期血清的抗體滴度比急性期有4倍或4倍以上的增長，則表明病人確有感染相應(yīng)病原體。6、如病人血清或腦脊液標(biāo)本中檢測到目標(biāo)病原微生物感染

8、的IgM抗體陽性，表示有近期感染、7、如果腦脊髓液標(biāo)本或血清IgM抗體檢測陰性，可能是因為患者體內(nèi)的抗體還沒達(dá)到可被檢測的濃度，需結(jié)合發(fā)病和采樣日期，進(jìn)一步對患者的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測。 三、應(yīng)急檢測標(biāo)本的采集和運輸（一）標(biāo)本的選擇1、為了說明病原體與某種特殊疾病的關(guān)系，標(biāo)本應(yīng)盡可能取自靶器官2、許多病原微生物感染的臨床癥狀可以用來確定靶器官，以取得適當(dāng)?shù)臉?biāo)本3、分離立克次氏體的標(biāo)本種類有限，主要是血液和內(nèi)臟組織 （二）采樣器材1、無菌、耐低溫、密閉帶螺口蓋的容器。包括尿杯和一次性離心管（1550ml），適于盛裝24mlVTM的標(biāo)本收集管，25ml血清收集管2、無菌棉簽和專用采樣拭子3、無菌玻珠(

9、直徑5mm)每管加34個玻璃珠，以便于將結(jié)合在拭子上的細(xì)胞釋放出來4、注射器配26和27號針頭，用于吸取囊泡液5、含抗凝劑的血液收集管 （三）病毒運輸液（VTM）1、運輸液可以防止標(biāo)本干燥，在標(biāo)本收集和接種的間隔期內(nèi)有助于保持病毒活性，同時延緩污染菌的增殖。2、使用的VTM有多種配方，VTM既可在實驗室自行配制，也可以購買商品化的，盡管綜合性的研究不多，但使用不同的VTM對選擇的病毒的回收檢測結(jié)果沒有顯著影響。 （四）細(xì)菌運送培養(yǎng)基1、維持活力，不增菌的非營養(yǎng)性半固體培養(yǎng)基2、四種主要運送培養(yǎng)基：Stuarts、 Cary-Blair、 Amies、 STGG （五）標(biāo)本收集1、出現(xiàn)臨床癥狀后

10、盡可能早地采集標(biāo)本，最好在沒有進(jìn)行抗病毒和抗生素治療之前采集。2、最易分離到病毒的時間是發(fā)病后3天內(nèi)，5天以后分離到病毒的機(jī)會將大大降低。病例死亡后應(yīng)盡快采集尸解標(biāo)本。3、收集立克次氏體培養(yǎng)標(biāo)本應(yīng)盡量無菌。4、詳細(xì)詢問病史，包括發(fā)病日期、臨床表現(xiàn)、近期暴露史、動物和節(jié)肢動物接觸史和叮咬史、近期到流行區(qū)的旅行史和疫苗接種史。5、用于細(xì)菌血培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)盡早采集，并注意無菌操作。 （六）標(biāo)本的運送、接收與保存1、專人負(fù)責(zé)標(biāo)本運輸2、新鮮的臨床采集標(biāo)本應(yīng)在4條件下24小時內(nèi)運送至實驗室；未能24小時內(nèi)送至實驗室的，應(yīng)置-70或以下保存3、凍存的標(biāo)本應(yīng)使用干冰或液氮送檢，低溫送至實驗室4、標(biāo)本核對無誤后

11、置-70冰箱保存，并做好相應(yīng)的記錄 （七）標(biāo)本的盛裝1、盛裝標(biāo)本的容器應(yīng)堅固、密封、無菌2、容器的材料要求“兩耐三防” ：耐高（低）溫耐高壓、防水、防破損、防泄漏3、容器上貼規(guī)范的標(biāo)簽以利于識別4、樣品的有關(guān)表格和或說明應(yīng)單獨放置于防水的袋子里以防發(fā)生污染，不要綁在容器外 （八）容器的外包裝1、外包裝內(nèi)有吸水性材料和干冰、熱水袋等保溫性材料2、外包裝上應(yīng)有生物安全標(biāo)識 （九）標(biāo)本的接收1、大規(guī)模接收標(biāo)本的實驗在專用房間或區(qū)域進(jìn)行2、接收由2人同時完成，接收人員應(yīng)受過防護(hù)培訓(xùn)。明確所操作標(biāo)本的潛在健康危害，采取防護(hù)措施。3、檢查容器的外觀和標(biāo)簽是否完整、標(biāo)簽與內(nèi)容物：是否相符、是否有污染及容器是

12、否破損等，并登記標(biāo)本接收登記表，記錄處置方法。4、對于容器破損、有液體外滲或懷疑污染的樣品，可以拒絕接收，囑其再次采集樣品送檢。 （十）標(biāo)本包裝的打開1、標(biāo)本應(yīng)在生物安全柜中打開包裝，同時備有適當(dāng)?shù)南緞┮员闾幚砜赡艹霈F(xiàn)的標(biāo)本泄漏。2、操作人員應(yīng)穿防水的防護(hù)服，戴生物安全專用口罩、眼罩和手套。 （十一）標(biāo)本的保存專人負(fù)責(zé)保存1、保存者需對照標(biāo)本送檢單，核對標(biāo)本數(shù)量、送檢狀態(tài)、標(biāo)本編號，并填寫標(biāo)本保存登記表。2、不同標(biāo)本按照不同存放要求分類存放，同時填寫標(biāo)本存放登記表。 5種常見標(biāo)本分別是血培養(yǎng)標(biāo)本、血清標(biāo)本、尿液標(biāo)本、痰標(biāo)本和鼻咽拭子標(biāo)本。（一）血培養(yǎng)標(biāo)本1、用70%乙醇擦拭血液培養(yǎng)瓶，分別包

13、裝后于室溫環(huán)境下立即送往實驗室（冬季需保溫）；如果不能及時送檢，置于室溫，勿放冰箱2、標(biāo)本接收單位在接到標(biāo)本后，首先應(yīng)檢查血培養(yǎng)物狀態(tài)及運輸溫度記錄，確認(rèn)溫度記錄無誤血培養(yǎng)物狀態(tài)良好后及時進(jìn)行培養(yǎng) （二）血清標(biāo)本1、新鮮的血清標(biāo)本可在4條件下運輸，冷凍的血清標(biāo)本需在保持凍存的狀態(tài)下運輸2、需長期保存的標(biāo)本應(yīng)置于-70冰箱 （三）尿液標(biāo)本1、新鮮標(biāo)本在4條件下運輸，冷凍的標(biāo)本需在保持凍存的狀態(tài)下運輸2、標(biāo)本接收單位在接到標(biāo)本后，首先應(yīng)檢查標(biāo)本狀態(tài)，填寫標(biāo)本接收登記表，并立即進(jìn)行尿抗原檢測3、需長期保存的標(biāo)本應(yīng)置于-70冰箱 （四）痰標(biāo)本1、采用專用采痰盒采集痰液，并注意送檢期間的安全防護(hù)2、標(biāo)本

14、需及時送檢以避免干燥，不能及時送檢者可暫存4冰箱內(nèi)12小時。不可在室溫下放置過長時間3、標(biāo)本接收單位在接到標(biāo)本后，首先應(yīng)檢查痰標(biāo)本狀態(tài)，填寫標(biāo)本接收登記表，確認(rèn)痰標(biāo)本狀態(tài)良好后及時進(jìn)行培養(yǎng)4、接收標(biāo)準(zhǔn)，目測：黃色、灰色、血性、鐵銹色、渾濁、稠厚呈現(xiàn)團(tuán)塊狀的標(biāo)本為合格標(biāo)本；而無色透明有灰白片狀物或黑色小點、有明顯食物渣滓、紙屑或灰塵等為不合格標(biāo)本。顯微鏡下：取約0.1ml痰液用接種環(huán)均勻涂布成22cm大小的涂膜，在顯微鏡下合格痰標(biāo)本的涂片鏡檢，鱗狀上皮細(xì)胞10個/低倍視野白細(xì)胞25個/低倍視野，或兩者比例小于1：2.5為合格標(biāo)本，可進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng) （五）鼻咽拭子標(biāo)本1、未能24小時內(nèi)送至實驗室的，

15、應(yīng)置-70或以下保存2、凍存的標(biāo)本應(yīng)用干冰在保持冷凍的條件下，低溫送至實驗室3、標(biāo)本核對無誤后，置-70冰箱保存4、新鮮采集的標(biāo)本應(yīng)立即放置于冰盒或在4條件下保存，并于24小時內(nèi)運送至實驗室 四、應(yīng)急檢測案例分析（一）2010年東莞基孔肯雅熱暴發(fā)疫情（1）10年9月30日傍晚，東莞市長熱線接到萬江區(qū)新村社區(qū)發(fā)熱伴關(guān)節(jié)痛病人近期增加很多。（2）10月1日上午，東莞市疾控中心派員調(diào)查，并采集15份血清標(biāo)本送市CDC實驗室進(jìn)行登革熱抗體和核酸檢測，結(jié)果不支持登革熱診斷。（3）步查明原因，10月1日17時與省疾控中心溝通，并立刻將血清標(biāo)本上送省中心進(jìn)行登革熱復(fù)核和基孔肯雅熱等病毒核酸檢測。（4）月2日

16、凌晨0時，省疾控中心檢測結(jié)果顯示15份標(biāo)本中有10份檢測到基孔肯雅病毒核酸，登革熱病毒核酸均為陰性。（5）市疾控中心遂于10月2日凌晨通過突發(fā)公共衛(wèi)生事件管理系統(tǒng)報告了該起事件。 1、流行病學(xué)調(diào)查（1）回顧搜索調(diào)查：新村社區(qū)所轄的江村一組和二組自7月開始搜查；其余村組自9月1日開始搜查（2）查結(jié)果a.首例疑似病例9月1日出現(xiàn)在江村b.9月上中旬在江村一組和二組有零星散在疑似病例發(fā)生c.9月下旬病例急劇增加，并波及至江村一、二組以外的其他村組 2、東莞市CDC早期實驗室檢測情況（1）9月7日東莞市CDC實驗室收集到新村5例發(fā)熱伴關(guān)節(jié)痛和皮疹的病人血清標(biāo)本（2）9月8日進(jìn)行登革熱抗體和核酸檢測，結(jié)

17、果陰性（3）流行病醫(yī)生根據(jù)結(jié)果排出了登革熱 3、反映的問題（1）疾病監(jiān)測系統(tǒng)不敏感（2）公共衛(wèi)生專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)對新發(fā)傳染病的意識不強(qiáng)（3）地市級公共衛(wèi)生實驗室能力不足（4）未建立參比實驗室服務(wù)體系、服務(wù)能力不足 （二）2011香港猩紅熱爆發(fā)（1）2011年6月香港宣布該地區(qū)猩紅熱爆發(fā)，并出現(xiàn)2例死亡病例（2）實驗室檢測發(fā)現(xiàn)有多種基因型的A群鏈球菌菌株在社區(qū)循環(huán)并引起猩紅熱（3）通過調(diào)查香港認(rèn)為猩紅熱病例增加可能是局部現(xiàn)象（4）本次爆發(fā)病例的流行病學(xué)和臨床特征與以往的病例相似（5）病死率與歷史數(shù)據(jù)和國際上報道的數(shù)據(jù)相比也沒有顯著增高 廣東省2011年猩紅熱病例異常增加，由往年的200例，300例增加到1300多例。疾控中心從醫(yī)院手機(jī)菌株和標(biāo)本，進(jìn)行實驗室應(yīng)急檢測，發(fā)現(xiàn)菌株的耐藥譜增加，帶有獨立基因。與香港的不一樣。 反映的問題：（1）2011年與往年相比法定傳染病報告系統(tǒng)報告的猩紅熱病例明顯增加，但沒有引起重視，公共衛(wèi)生部門對傳染病報告信息不敏感（2）醫(yī)院有基本的病原學(xué)檢測能力，但實驗室檢測信息未充分共享（3）大部分臨床實驗室較少開展傳染病病原學(xué)診斷（4）治療沒有實驗室依據(jù)主要依賴抗生素（5）公共衛(wèi)生實驗室缺少臨床標(biāo)本和臨床細(xì)菌分離株 （三）案例總