DNA的質(zhì)量監(jiān)測通常有兩個方法

1、2） DNA的質(zhì)量監(jiān)測通常有兩個方法：首先OD260/OD280比值應(yīng)該在1.8左右（1.7-1.9），否則意味著DNA樣品中存在大量的蛋白質(zhì)或RNA污染。其次，瓊脂糖電泳分析時應(yīng)主要以超螺旋條帶為主。最多不超過三條帶（分別為超螺旋DNA，線性化DNA和環(huán)狀DNA）。否則意味質(zhì)粒DNA的質(zhì)量不高，應(yīng)該重新制備。2. 限制性內(nèi)切酶的活性1）限制性內(nèi)切酶一般需要低溫保存，而且反復(fù)的升降溫過程對酶活性的損害很明顯。因而為了確保在有效期內(nèi)的限制性內(nèi)切酶不會失活，限制性內(nèi)切酶的日常保存和使用應(yīng)當(dāng)很小。2）建議購買具有保溫功能的凍存盒保存限制性內(nèi)切酶（-20度），而且取用限制性內(nèi)切酶時，也應(yīng)該使用具有保溫

2、功能的凍存盒，盡量防止酶的溫度反復(fù)出現(xiàn)大的波動。3.限制性內(nèi)切酶的用量1）限制性內(nèi)切酶的單位定義通常為：在合適的溫度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定義為一個單位。2）在這個單位定義中，有幾個不確定因素：首先是底物，不同的酶單位定義是選擇的底物可能不同（常用的幾個底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些質(zhì)粒DNA）；第二個不確定因素是限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的酶切位點的個數(shù)。由于單位定義中要求完全消化，因而底物上某個酶的酶切位點的個數(shù)的多少，就直接影響了該酶的單位定義。3）因而，在進行酶切時，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科學(xué)的，

3、這也導(dǎo)致在實際工作中，大家要進行多次預(yù)實驗才能確定最合適酶切條件。4）以前，我推薦了一個在線的雙酶切設(shè)計軟件，double digestion designer, 可以精確地計算酶切時的限制性內(nèi)切酶的用量。使用中，能夠注意到，用來進行雙酶切的兩個酶的用量有時竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且發(fā)現(xiàn)，小片段PCR產(chǎn)物（100-500bp）進行酶切時，需要的酶量比質(zhì)粒DNA酶切時用量多10倍以上。5）該軟件目前可以免費使用，用戶名和密碼都是test。全基因組甲基化測序：DNA 甲基化是指在 DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組 CpG 二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結(jié)合一個

4、甲基基團。DNA 甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。甲基化是基因表達的主要調(diào)控方式之一，研究染色體DNA甲基化情況是了解基因調(diào)控的重要手段。對已經(jīng)有參考基因組的物種的基因組DNA用標準亞硫酸氫鹽（Bisulfite）處理后，未甲基化的胞嘧啶C會脫氨基形成尿嘧啶U，經(jīng)PCR擴增，U替換為胸腺嘧啶T，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶C保持不變。將處理組與參考基因組序列進行比對，可發(fā)現(xiàn)甲基化位點并對甲基化情況進行定量分析的方法叫做全基因組甲基化測序。在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5甲基胞嘧啶，這常見于基因的5'-CG-3'序列。大

5、多數(shù)脊椎動物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5'端的非編碼區(qū)，并成簇存在。甲基化位點可隨DNA的復(fù)制而遺傳，因為DNA復(fù)制后，甲基化酶可將新合成的未甲基化的位點進行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，從而影響了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，甲基化達到一定程度時會發(fā)生從常規(guī)的B-DNA向Z-DNA的過渡，由于Z-DNA結(jié)構(gòu)收縮，螺旋加深，使許多蛋白質(zhì)因子賴以結(jié)合的原件縮入大溝而不利于轉(zhuǎn)錄的起始，導(dǎo)致基因失活。 一代測序技術(shù)：即傳統(tǒng)的Sanger測序法，Sanger法是根據(jù)核苷酸在待定序列模板上的引物點開始，隨機在某一個特定的堿基處

6、終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，通過檢測得到DNA堿基序列。二代測序技術(shù)：next generation sequencing（NGS）又稱為高通量測序技術(shù)，與傳

7、統(tǒng)測序相比，二代測序技術(shù)可以一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子同時進行序列測定，從而使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序（Deep sequencing）。NGS主要的平臺有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等?；颍篏ene，是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA或RNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列?；蛲ㄟ^復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代，使后代出現(xiàn)與親代相似的性狀。DNA：Deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸，一個脫氧核苷酸分子由三部分組

8、成：含氮堿基、脫氧核糖、磷酸。脫氧核糖核酸通過3',5'-磷酸二酯鍵按一定的順序彼此相連構(gòu)成長鏈，即DNA鏈，DNA鏈上特定的核苷酸序列包含有生物的遺傳信息，是絕大部分生物遺傳信息的載體。RNA：Ribonucleic Acid，核糖核酸，一個核糖核苷酸分子由堿基，核糖和磷酸構(gòu)成。核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成長鏈狀分子稱之為RNA鏈。RNA是存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。不同種類的RNA鏈長不同，行使各式各樣的生物功能，如參與蛋白質(zhì)生物合成的RNA有信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA和核糖體RNA等。16S rDNA："S"是沉降系數(shù)，是反映生物大分

9、子在離心場中向下沉降速度的一個指標，值越高，說明分子越大。rDNA（ribosome DNA）指的是原核生物基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子對應(yīng)的DNA序列，16S rDNA 是原核生物編碼核糖體小亞基16S rRNA的基因。細菌rRNA（核糖體RNA）按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細菌染色體基因中。16S rRNA 普遍存在于原核生物中。16S rRNA 分子，其大小約1540bp，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，其可變區(qū)序列因細菌不同而異，恒定區(qū)序

10、列基本保守，所以可利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物，將16S rDNA片段擴增出來，通過高通量測序利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定。cDNA：complementary DNA，互補脫氧核糖核酸，與RNA鏈互補的單鏈DNA，以RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下所合成的DNA。Small RNA：生物體內(nèi)一類高度保守的重要的功能分子，其大小在18-30nt，包括microRNA、siRNA、snRNA、snoRNA和piRNA（piwi-interacting RNA）等，它的主要功能是誘導(dǎo)基因沉默，調(diào)控細胞生長、發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等生物學(xué)過程。以miRNA為例介紹它們的功能：mi

11、RNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex, RISC）結(jié)合，并將此復(fù)合體與其互補的mRNA序列結(jié)合，根據(jù)靶序列與miRNA的互補程度，從而導(dǎo)致靶序列降解或干擾靶序列蛋白質(zhì)的翻譯過程。SD 區(qū)域：Segment duplication，串聯(lián)重復(fù)是由序列相近的一些 DNA 片段串聯(lián)組成。串聯(lián)重復(fù)在人類基因多樣性的靈長類基因中發(fā)揮重要作用。Genotype and phenotype：基因型與表型，基因型是指某一生物個體全部基因組合的總稱；表型，又稱性狀，是基因型和環(huán)境共同作用的結(jié)果?；蚪M：Genome，單倍體細胞核、細胞器（線粒體、葉綠體）或病毒粒

12、子所含的全部DNA分子或RNA分子。全基因組de novo測序：又稱從頭測序，它不依賴于任何現(xiàn)有的序列資料，而直接對某個物種的基因組進行測序，然后利用生物信息學(xué)分析手段對序列進行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組序列圖譜。全基因組重測序：對已有參考序列（Reference Sequence）物種的不同個體進行基因組測序，并以此為基礎(chǔ)進行個體或群體水平的遺傳差異性分析。全基因組重測序能夠發(fā)現(xiàn)大量的單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）、拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation，CNV）、插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）、結(jié)構(gòu)變異（Structure Variati

13、on，SV）等變異類型，以準確快速的方法 將單個參考基因組信息上升為群體遺傳特征。轉(zhuǎn)錄組：Transcriptome，是指特定生長階段某組織或細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合；狹義上指所有mRNA的集合。轉(zhuǎn)錄組測序：對某組織在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA進行測序，獲得特定狀態(tài)下的該物種的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。通常轉(zhuǎn)錄組測序是指對mRNA進行測序獲得相關(guān)序列的過程。其根據(jù)所研究物種是否有參考基因組序列分為轉(zhuǎn)錄組de novo測序（無參考基因組序列）和轉(zhuǎn)錄組重測序（有參考基因組序列）。外顯子組：Exome，人類基因組全部外顯子區(qū)域的集合稱為外顯子組，是基因中重要的編碼蛋白的部分，并涵蓋了與個體

14、表型相關(guān)的大部分的功能性變異。外顯子組測序：是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對于基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、InDel 等具有較大的優(yōu)勢。目標區(qū)域測序：應(yīng)用相關(guān)試劑盒對基因組上感興趣的目標區(qū)域進行捕獲富集后進行大規(guī)模測序，一般需要根據(jù)目標區(qū)域?qū)ｉT定制捕獲芯片。宏基因組：Metagenome，指特定生活環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因。目前主要指環(huán)境樣品中的細菌和真菌的基因組總和。宏基因組16S rRNA測序：可以對特定環(huán)境下的細菌和古細菌群體的微生物種類和風(fēng)度進行有

15、效的鑒定。對不同地點、不同條件下的多個樣本16S rRNA的PCR產(chǎn)物平行測序，可以比較不同樣本間的微生物組成及成分差異，進而闡明物種豐度、種群結(jié)果等生態(tài)學(xué)信息。表觀遺傳學(xué)：Epigenetics，是指在基因組DNA序列沒有改變的情況下，基因的表達調(diào)控和性狀發(fā)生了可遺傳的變化。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因組印記（genomic impriting），母體效應(yīng)（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁顯性，休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯（RNA editing）等。全基因組甲基化測序：DNA 甲基化是指在

16、DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組 CpG 二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團。DNA 甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。甲基化是基因表達的主要調(diào)控方式之一，研究染色體DNA甲基化情況是了解基因調(diào)控的重要手段。對已經(jīng)有參考基因組的物種的基因組DNA用標準亞硫酸氫鹽（Bisulfite）處理后，未甲基化的胞嘧啶C會脫氨基形成尿嘧啶U，經(jīng)PCR擴增，U替換為胸腺嘧啶T，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶C保持不變。將處理組與參考基因組序列進行比對，可發(fā)現(xiàn)甲基化位點并對甲基化情況進行定量分析的方法叫做全基因組甲基化測序。ChIp-Seq：Chromatin Immuno

17、precipitation sequencing，即染色質(zhì)免疫共沉淀-測序技術(shù)，即通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。對富集得到的DNA片段進行純化與文庫構(gòu)建，然后進行高通量測序，從而得到全基因組范圍內(nèi)可以與目的蛋白相互作用的DNA片段的方法叫做ChIP-Seq。數(shù)字表達譜：Digital Gene Expression Profile，利用新一代高通量測序技術(shù)和高性能計算分析技術(shù)，能夠全面、經(jīng)濟、快速地檢測某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達情況，即運用特定的酶對mRNA距polyA tail 21-25nt的位置進行酶切，所獲得的帶polyA尾的序列(Tag)通

18、過高通量測序，該tag被測得的次數(shù)即是對應(yīng)基因的表達值。數(shù)字基因表達譜已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。特點是經(jīng)濟，但獲得的數(shù)據(jù)量有限。若想獲得轉(zhuǎn)錄本的更多信息的話，一般都采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法來測序。SBS：sequencing by synthesis，邊合成邊測序反應(yīng)，是指在DNA聚合酶的作用下延伸堿基所進行的測序。Run：指高通量測序平臺單次上機測序反應(yīng)。圖1. Flow Cell結(jié)構(gòu)示意圖Lane：也叫channel，單泳道，每條泳道包含2列（column），每列分布有多個小區(qū)（tile），如圖1。不同的測序平臺Flow Cell中所含的Lane不一樣，如HiSeq

19、 2000是2個flow cell，每個flow cell中含有8個lane；HiSeq 2500是包含2個mini flow cell（快速運行模式）和2個high output flow cell，兩個模式不能同時運行，其中每個mini flow cell包含2個lane，每個high output flow cell中包含8個lane；Miseq系統(tǒng)的flow cell僅含有1個lane。Tile：小區(qū)，每條Lane中有2列tile，合計120個小區(qū)。每個小區(qū)上分布數(shù)目繁多的簇結(jié)合位點，如圖1。Cluster：簇，在Illumina測序平臺中會采用橋式PCR方式生產(chǎn)DNA簇，每個DNA簇

20、才能產(chǎn)生亮度達到CCD可以分辨的熒光點。Index：標簽，在Illumina平臺的多重測序（Multiplexed Sequencing）過程中會使用Index來區(qū)分樣品，并在常規(guī)測序完成后，針對Index部分額外進行7個循環(huán)的測序，通過Index的識別，可以在1條Lane中區(qū)分12種不同的樣品。Barcode：與Index同義，多指在Roche GS FLX 454測序平臺的16S PCR產(chǎn)物的測序過程中接頭序列所包含的的用來區(qū)分不同樣本的序列。PF%：PF%是指符合測序質(zhì)量標準的簇的百分比，與測序的通量相關(guān)聯(lián)。Fasta：一種序列存儲格式。一個序列文件若以FASTA格式存儲，則每一條序列的

21、第一行以“>”開頭，而跟隨“>”的是序列的ID號（即唯一的標識符）及對該序列的描述信息；第二行開始是序列內(nèi)容，序列短于61nt的，則一行排列完；序列長于61nt的，則每行存儲61nt，最后剩下小于61nt的，在最后一行排列完；第二條序列另起一行，仍然由“>”和序列的ID號開始，以此類推。Fastq：Fastq是Solexa測序技術(shù)中一種反映測序序列的堿基質(zhì)量的文件格式。第一行以“”符號開頭，后面緊跟一個序列的描述信息；第二行是該序列的內(nèi)容；第三行以“+”符號開頭，后面可以是該序列的描述信息，也可省略；而第四行是第二行中的序列內(nèi)容每個堿基所對應(yīng)的測序質(zhì)量值。Read：高通量測序

22、平臺產(chǎn)生的序列標簽就稱為 reads?；蚪M組裝：進行基因組或轉(zhuǎn)錄組de novo測序時，物種基因組經(jīng)構(gòu)建不同的文庫測序所得的片段需經(jīng)過生物信息學(xué)手段對其進行整理拼接，并通過一定的標準（如N50）對后續(xù)組裝結(jié)果進行質(zhì)量評估等，最終獲得高準確度的基因組序列的過程?；蚪M測序深度：測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。如測一個物種的全基因組的重測序，基因組大小約為5G，測序獲得100G的數(shù)據(jù)量，則測序深度為20×?；蚪M覆蓋率：指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱

23、為Gap。例如一個細菌基因組測序，覆蓋率是98%，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。Contig：在de novo測序中拼接軟件基于 reads 之間的 overlap 區(qū)，拼接獲得的中間沒有g(shù)ap的序列稱為Contig（重疊群）。Scaffold：基因組 de novo 測序，通過 reads 拼接獲得 Contigs 后，往往還需要構(gòu)建 454 Paired-end 庫或Illumina Mate-pair 庫，以獲得一定大小片段（如 3Kb、8Kb、10Kb、20Kb）兩端的序 列?；谶@些序列，可以確定一些 Contig 之間的順序關(guān)系，這些先后順序已知的 Contigs 組

24、成 Scaffold。Contig N50：Reads拼接后會獲得一些不同長度的Contigs。將所有的Contig長度相加，能獲得一個Contig總長度。然后將所有的Contigs按照從長到短進行排序，如獲得Contig 1，Contig 2，Contig 3Contig 25。將Contig按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達到Contig總長度的一半時，最后一個加上的Contig長度即為Contig N50。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig總長度*1/2時，Contig 4的長度即為Contig N50。Contig N50可

25、以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標準。Scaffold N50：Scaffold N50與Contig N50的定義類似。Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds。將所有的Scaffold長度相加，能獲得一個Scaffold總長度。然后將所有的Scaffolds按照從長到短進行排序，如獲得Scaffold 1，Scaffold 2，Scaffold 3Scaffold 25。將Scaffold按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達到Scaffold總長度的一半時，最后一個加上的Scaffold長度即為Scaffold N50。舉例：Scaffold 1+Scaffold 2

26、+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold總長度*1/2時，Scaffold 5的長度即為Scaffold N50。Scaffold N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標準。Isotig：指在轉(zhuǎn)錄組de novo測序時，用454平臺測序完成后組裝出的結(jié)果，一個isotig可視為一個轉(zhuǎn)錄本。Isogroup：指轉(zhuǎn)錄組de novo測序中，用454平臺測序完成后組裝出的結(jié)果獲得的可聚類到同一個基因的轉(zhuǎn)錄本群。GC%：GC含量，全基因組范圍內(nèi)或在特定基因組序列內(nèi)的4種堿基中，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率。SNP：single nucleotide

27、 polymorphism，單核苷酸多態(tài)性，個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異(替代、插入或缺失)所引起的多態(tài)性；不同物種個體基因組 DNA 序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現(xiàn)象。有這種差別的基因座、DNA序列等可作為基因組作圖的標志。SNP 在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換為T，原因是CG中的C 常為甲基化的，自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指變異頻率大于1 %的單核苷酸變異，主要用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等。InDel：Insertion/Deletion，插入/缺失，在基因組重測序進行mapping時

28、，進行容Gap的比對并檢測可信的Short InDel，如基因組上小片段>50bp的插入或缺失。在檢測過程中，Gap的長度為15個堿基。CNV：copy number variation，基因組拷貝數(shù)變異，是基因組變異的一種形式，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數(shù)量。如人類正常染色體拷貝數(shù)是2，有些染色體區(qū)域拷貝數(shù)變成1或3，這樣，該區(qū)域發(fā)生拷貝數(shù)缺失或增加，位于該區(qū)域內(nèi)的基因表達量也會受到影響。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個區(qū)域，則A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D 分別發(fā)生了C區(qū)域的擴增及缺失，擴增的位置可以是連續(xù)擴增如 A

29、-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴增，如A-C-B-C-D。SV：structure variation，基因組結(jié)構(gòu)變異，染色體結(jié)構(gòu)變異是指在染色體上發(fā)生了大片段的變異。主要包括染色體大片段的插入和缺失（引起 CNV 的變化），染色體內(nèi)部的某塊區(qū)域發(fā)生重復(fù)復(fù)制、翻轉(zhuǎn)顛換、易位、兩條染色體之間發(fā)生重組（inter-chromosome trans-location）等?；虮磉_差異：是指某一物種或特定細胞在特定時期/功能狀態(tài)下，多樣本間不同基因在mRNA水平上表達量的差異，可通過RPKM/FPKM值來體現(xiàn)。RPKM：Reads Per Kilobase per Million mapped

30、reads Mortazavietal.,2008，是指每 1 百萬個map 上 的reads 中 map 到外顯子的每1K 個堿基上的reads 個數(shù)。計算公式四RPKM=106C/NL/103，其中C為唯一比對到目的基因的reads數(shù)；N為唯一比對到參考基因的總reads數(shù)，L是目的基因編碼區(qū)的堿基數(shù)。RPKM法可以消除基因長度、數(shù)據(jù)量之間的差異進行計算基因表達量?？勺兗羟校篴lternative splicing大多數(shù)真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體是按一種方式剪接產(chǎn)生出一種mRNA，因而只產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。但有些基因產(chǎn)生的mRNA前體可按不同的方式剪接，產(chǎn)生出兩種或更多種mRNA，即可變剪

31、接?；蛉诤希篏ene fusion，將基因組位置不同的兩個或多個基因中的一部分或全部整合到一起，形成新的基因，稱作融合基因或嵌合體基因，該基因有可能翻譯出融合或嵌合體蛋白。基因家族分析：通過進行BLASTN/ HMM比對等查找基因歸屬的基因家族并添加相關(guān)功能注釋?；蚪M注釋：Genome annotation是利用生物信息學(xué)方法和工具,對基因組所有基因的生物學(xué)功能進行高通量注釋,是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的一個熱點?；蚪M注釋的研究內(nèi)容包括基因識別和基因功能注釋兩個方面?；蜃R別的核心是確定全基因組序列中所有基因的確切位置。常見的基因組注釋有GO注釋、pathway分析。GO注釋：gene on

32、tology是指對基因功能的注解。GO強調(diào)基因產(chǎn)物在細胞中的功能。GO不能反映此基因的表達情況，即是否在特定細胞中、特定組織中、特定發(fā)育階段或與某種疾病相關(guān)，但GO支持其他的OBO(open biology ontologies)成員成立其他類型的本體論數(shù)據(jù)庫（如發(fā)育本體學(xué)、蛋白組本體學(xué)、基因芯片本體學(xué)等）Pathway注釋：是指對功能基因參與的信號通路等進行分析注釋。甲基化率：是指在甲基化測序中，發(fā)生甲基化的胞嘧啶占所有胞嘧啶的比率。CpG島：CpG island 是指DNA上一個區(qū)域，此區(qū)域含有大量相聯(lián)的胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G），以及使兩者相連的磷酸酯鍵（p）?；蚪M中長度為300300

33、0 bp的富含CpG二核苷酸的一些區(qū)域，主要存在于基因的5區(qū)域。啟動子區(qū)中CpG島的未甲基化狀態(tài)是基因轉(zhuǎn)錄所必需的，而CpG序列中的C的甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄被抑制。什么是高通量測序？高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS）是對傳統(tǒng)Sanger測序（稱為一代測序技術(shù)）革命性的改變, 一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定, 因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep se

34、quencing)。什么是Sanger法測序（一代測序）Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離

35、大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。什么是基因組重測序（Genome Re-sequencing）全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)域擴大到全基因組范圍。通過構(gòu)建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結(jié)合的策略進行高通量測序，實現(xiàn)在全基因組水平上檢測疾病關(guān)聯(lián)的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結(jié)構(gòu)變異等，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價值。什么是de novo測序de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對某個

36、物種進行測序，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑。隨著新一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測序所需的成本和時間較傳統(tǒng)技術(shù)都大大降低，大規(guī)?；蚪M測序漸入佳境，基因組學(xué)研究也迎來新的發(fā)展契機和革命性突破。利用新一代高通量、高效率測序技術(shù)以及強大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地測定并分析所有生物的基因組序列。什么是外顯子測序（whole exon sequencing）外顯子組測序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對于基因組重測序成本較低

37、，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢，但無法研究基因組結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等。什么是mRNA測序 （RNA-seq）轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在基因組學(xué)后新興的一門學(xué)科，即研究特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類型與拷貝數(shù)。Illumina提供的mRNA測序技術(shù)可在整個mRNA領(lǐng)域進行各種相關(guān)研究和新的發(fā)現(xiàn)。mRNA測序不對引物或探針進行設(shè)計，可自由提供關(guān)于轉(zhuǎn)錄的客觀和權(quán)威信息。研究人員僅需要一次試驗即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表達、cSNP、全新的轉(zhuǎn)錄、全新異構(gòu)體、剪接位點

38、、等位基因特異性表達和罕見轉(zhuǎn)錄等最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。簡單的樣品制備和數(shù)據(jù)分析軟件支持在所有物種中的mRNA測序研究。什么是small RNA測序Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活動重要的調(diào)控因子，在基因表達調(diào)控、生物個體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠?qū)毎蛘呓M織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄做成cDNA再做進一步處理后，利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序。通過Illu

39、mina對Small RNA大規(guī)模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現(xiàn)包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預(yù)測和鑒定、樣品間差異表達分析、miRNAs聚類和表達譜分析等科學(xué)應(yīng)用。什么是miRNA測序成熟的microRNA（miRNA）是1724nt的單鏈非編碼RNA分子，通過與mRNA相互作用影響目標mRNA的穩(wěn)定性及翻譯，最終誘導(dǎo)基因沉默，調(diào)控著基因表達、細胞生長、發(fā)育等生物學(xué)過程?；诘诙鷾y序技術(shù)的microRNA測序，可以一次性獲得數(shù)百萬條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的microRNA及其表達差異，為

40、研究microRNA對細胞進程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。什么是Chip-seq染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員

41、通過將獲得的數(shù)百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。什么是CHIRP-SeqCHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一種檢測與RNA綁定的DNA和蛋白的高通量測序方法。方法是通過設(shè)計生物素或鏈霉親和素探針，把目標RNA拉下來以后，與其共同作用的DNA染色體片段就會附在到磁珠上，最后把染色體片段做高通量測序，這樣會得到該RNA能夠結(jié)合到在基因組的哪些區(qū)域，但由于蛋白測序技術(shù)不夠成熟，無法知道與該RNA結(jié)合的蛋白。什么是RIP-seqRNA Immunoprecipitat

42、ion是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。這種技術(shù)運用針對目標蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進行測序分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等）。RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地

43、了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。什么是CLIP-seqCLIP-seq,又稱為HITS-CLIP，即紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測序(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing), 是一項在全基因組水平揭示RNA分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用的革命性技術(shù)。其主要原理是基于RNA分子與RNA結(jié)合蛋白在紫外照射下發(fā)生耦聯(lián)，以RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀之后，回收其中的RNA片段，經(jīng)添加接頭、RT-PCR等步驟，對這些分子進行高通量測序，再經(jīng)生物信息學(xué)的分析和處理、總結(jié)，挖掘出其特定規(guī)律，

44、從而深入揭示RNA結(jié)合蛋白與RNA分子的調(diào)控作用及其對生命的意義。什么是metagenomic（宏基因組）Magenomics研究的對象是整個微生物群落。相對于傳統(tǒng)單個細菌研究來說，它具有眾多優(yōu)勢，其中很重要的兩點：(1) 微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它們的很多特性是基于整個群落環(huán)境及個體間的相互影響的，因此做Metagenomics研究比做單個個體的研究更能發(fā)現(xiàn)其特性；(2) Metagenomics研究無需分離單個細菌，可以研究那些不能被實驗室分離培養(yǎng)的微生物。    宏基因組是基因組學(xué)一個新興的科學(xué)研究方向。宏基因組學(xué)（又稱元基因組學(xué)，環(huán)境基因組學(xué)，生態(tài)

45、基因組學(xué)等），是研究直接從環(huán)境樣本中提取的基因組遺傳物質(zhì)的學(xué)科。傳統(tǒng)的微生物研究依賴于實驗室培養(yǎng)，元基因組的興起填補了無法在傳統(tǒng)實驗室中培養(yǎng)的微生物研究的空白。過去幾年中，DNA測序技術(shù)的進步以及測序通量和分析方法的改進使得人們得以一窺這一未知的基因組科學(xué)領(lǐng)域。什么是SNP、SNV（單核苷酸位點變異）單核苷酸多態(tài)性singlenucleotide polymorphism，SNP 或單核苷酸位點變異SNV。個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異(替代、插入或缺失)所引起的多態(tài)性。不同物種、個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現(xiàn)象。有這種差別的基因座、DNA序列等可作為基因

46、組作圖的標志。人基因組上平均約每1000個核苷酸即可能出現(xiàn)1個單核苷酸多態(tài)性的變化，其中有些單核苷酸多態(tài)性可能與疾病有關(guān)，但可能大多數(shù)與疾病無關(guān)。單核苷酸多態(tài)性是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據(jù)。在研究癌癥基因組變異時，相對于正常組織，癌癥中特異的單核苷酸變異是一種體細胞突變（somatic mutation），稱做SNV。什么是INDEL (基因組小片段插入）基因組上小片段（>50bp）的插入或缺失，形同SNP/SNV。什么是copy number variation （CNV）：基因組拷貝數(shù)變異基因組拷貝數(shù)變異是基因組變異的一種形式，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的

47、拷貝數(shù)量。例如人類正常染色體拷貝數(shù)是2，有些染色體區(qū)域拷貝數(shù)變成1或3，這樣，該區(qū)域發(fā)生拷貝數(shù)缺失或增加，位于該區(qū)域內(nèi)的基因表達量也會受到影響。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個區(qū)域，則A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分別發(fā)生了C區(qū)域的擴增及缺失，擴增的位置可以是連續(xù)擴增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴增，如A-C-B-C-D。什么是structure variation （SV）：基因組結(jié)構(gòu)變異染色體結(jié)構(gòu)變異是指在染色體上發(fā)生了大片段的變異。主要包括染色體大片段的插入和缺失（引起CNV的變化），染色體內(nèi)部的某塊區(qū)域發(fā)生翻轉(zhuǎn)顛換，兩條染色

48、體之間發(fā)生重組（inter-chromosome trans-location）等。一般SV的展示利用Circos 軟件。什么是Segment duplication一般稱為SD區(qū)域，串聯(lián)重復(fù)是由序列相近的一些DNA片段串聯(lián)組成。串聯(lián)重復(fù)在人類基因多樣性的靈長類基因中發(fā)揮重要作用。在人類染色體Y和22號染色體上，有很大的SD序列。什么是genotype and phenotype既基因型與表型；一般指某些單核苷酸位點變異與表現(xiàn)形式間的關(guān)系。什么是Read高通量測序平臺產(chǎn)生的序列標簽就稱為reads。什么是soft-clipped reads當(dāng)基因組發(fā)生某一段的缺失，或轉(zhuǎn)錄組的剪接，在測序過程中

49、，橫跨缺失位點及剪接位點的reads回帖到基因組時，一條reads被切成兩段，匹配到不同的區(qū)域，這樣的reads叫做soft-clipped reads，這些reads對于鑒定染色體結(jié)構(gòu)變異及外源序列整合具有重要作用。什么是multi-hits reads由于大部分測序得到的reads較短，一個reads能夠匹配到基因組多個位置，無法區(qū)分其真實來源的位置。一些工具根據(jù)統(tǒng)計模型，如將這類reads分配給reads較多的區(qū)域。什么是Contig拼接軟件基于reads之間的overlap區(qū)，拼接獲得的序列稱為Contig（重疊群）。什么是Scaffold基因組de novo測序，通過reads拼接獲

50、得Contigs后，往往還需要構(gòu)建454 Paired-end庫或Illumina Mate-pair庫，以獲得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）兩端的序列?；谶@些序列，可以確定一些Contig之間的順序關(guān)系，這些先后順序已知的Contigs組成Scaffold。什么是Contig N50Reads拼接后會獲得一些不同長度的Contigs。將所有的Contig長度相加，能獲得一個Contig總長度。然后將所有的Contigs按照從長到短進行排序，如獲得Contig 1，Contig 2，Contig 3.Contig 25。將Contig按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達

51、到Contig總長度的一半時，最后一個加上的Contig長度即為Contig N50。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig總長度*1/2時，Contig 4的長度即為Contig N50。Contig N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標準。什么是Scaffold N50Scaffold N50與Contig N50的定義類似。Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds。將所有的Scaffold長度相加，能獲得一個Scaffold總長度。然后將所有的Scaffolds按照從長到短進行排序，如獲得Scaffold

52、1，Scaffold 2，Scaffold 3.Scaffold 25。將Scaffold按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達到Scaffold總長度的一半時，最后一個加上的Scaffold長度即為Scaffold N50。舉例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold總長度*1/2時，Scaffold 5的長度即為Scaffold N50。Scaffold N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標準。什么是測序深度和覆蓋度測序深度是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因大小為2

53、M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。覆蓋度是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap。例如一個細菌基因組測序，覆蓋度是98%，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。什么是RPKM、FPKMRPKM,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads, is defined in thisway Mortazavi etal., 2008:每1百萬個map上的reads中map到外顯子的每

54、1K個堿基上的reads個數(shù)。假如有1百萬個reads映射到了人的基因組上，那么具體到每個外顯子呢，有多少映射上了呢，而外顯子的長度不一，那么每1K個堿基上又有多少reads映射上了呢，這大概就是這個RPKM的直觀解釋。如果對應(yīng)特定基因的話，那么就是每1000000 mapped到該基因上的reads中每kb有多少是mapped到該基因上的exon的readTotal exon reads:This is the number in the column with header Total exonreads in the row for the gene. This is the numbe

55、r of reads that have beenmapped to a region in which an exon is annotated for the gene or across theboundaries of two exons or an intron and an exon for an annotated transcript ofthe gene. For eukaryotes, exons and their internal relationships are defined byannotations of type mRNA.映射到外顯子上總的reads個數(shù)。

56、這個是映射到某個區(qū)域上的reads個數(shù)，這個區(qū)域或者是已知注釋的基因或者跨兩個外顯子的邊界或者是某個基因已經(jīng)注釋的轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子、外顯子。對于真核生物來說，外顯子和它們自己內(nèi)部的關(guān)系由某類型的mRNA來注釋。Exonlength: This is the number in the column with the header Exon length inthe row for the gene, divided by 1000. This is calculated as the sum of thelengths of all exons annotated for the gene. E

57、ach exon is included only once inthis sum, even if it is present in more annotated transcripts for the gene.Partly overlapping exons will count with their full length, even though theyshare the same region.外顯子的長度。計算時，計算所有某個基因已注釋的所有外顯子長度的總和。即使某個基因以多種注釋的轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)，這個外顯子在求和時只被包含一次。即使部分重疊的外顯子共享相同的區(qū)域，重疊的外顯子以其

58、總長來計算。Mapped reads: The sum of all the numbers in the column with header Totalgene reads. The Total gene reads for a gene is the total number ofreads that after mapping have been mapped to the region of the gene. Thus thisincludes all the reads uniquely mapped to the region of the gene as well asthose of the reads which match in more places (below the limit set in thedialog in figure 18.110) that have been allocated tothis gene&#