《分子生物學(xué)與基因工程》課程論文

1、植物基因工程研究進(jìn)展摘要：自1983年美國人首先成功地獲得抗卡那霉素的煙草再生植株開始，人類就開始了植物基因工程的研究。至今已在逾200種植物中成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并有近1000例轉(zhuǎn)基因植物獲準(zhǔn)進(jìn)行田間試驗,更有十余種轉(zhuǎn)基因植物(如轉(zhuǎn)基因棉花.大豆)已進(jìn)入商業(yè)化種植.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已進(jìn)入人們?nèi)粘Ｉ?。植物基因工程的?yīng)用已進(jìn)入蓬勃發(fā)展階段。下面是我從植物基因工程改善生物質(zhì)能利用的研究進(jìn)展做一說明。關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素 細(xì)胞壁 水解酶 近幾年來全世界對能源的需求量急劇增加加速了對有限的不可再生礦物質(zhì) 能源的消耗資源的利用也增加了CO2及粉塵的排放,造成環(huán)境破壞和全球氣候變 化1可再生的清潔的生物質(zhì)能

2、成為人們關(guān)注的熱點。其中的燃料乙醇工業(yè),近年來在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的發(fā)展,我國也大力支持發(fā)酵乙醇用作能源2。目前,絕大部分乙醇來源于玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)。但是由于淀粉本身又作為食品和飼料,產(chǎn)量有限,成本較高,阻礙了乙醇工業(yè)的發(fā)展。于是,人們把注意力轉(zhuǎn)移到谷物秸稈等廉價 的含有大量 的木質(zhì) 纖維素 的生物質(zhì) 材料上希望 能夠被 充分利用 3 。但由于木質(zhì)纖維素本身難以分解,許多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生產(chǎn)生的多糖資源更利于降解,用于發(fā)酵產(chǎn)乙醇。1. 木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇發(fā)展現(xiàn)狀 在中國,大約每年會產(chǎn)生10t億農(nóng)林業(yè)廢棄物這些資源用于造紙、紡織或者直接作為燃料這些占到很少一部分

3、。絕大部分被廢棄了木質(zhì)纖維素是光合作用的基本產(chǎn)物 , 也是生物圈產(chǎn)生的最充足的可再 生生物資源被認(rèn)為是地球上最豐富的生物高分子聚合4。大部分的高等植物細(xì)胞壁由膠聯(lián)多糖、糖蛋白和木質(zhì)素組成雙 子 葉植物 , 如擬南芥等,細(xì)胞壁多糖主要有三種:纖維素半、纖維素和果膠質(zhì),包埋在非 纖 維多糖基質(zhì)(半纖維素和果膠)中的纖維素網(wǎng)絡(luò),與木質(zhì)素和結(jié)構(gòu)蛋白共同構(gòu)成植物細(xì)胞壁的聚合液晶結(jié)構(gòu)5天然狀態(tài)下由于木質(zhì)素的保護作用,阻礙了水解 纖維素酶與纖維素的接觸并發(fā)揮作用,成為影響纖維素水解的重要因素 3, 4 。YangB等人發(fā)酵降解實驗證明,雖然半纖維素對纖維素。也有一定保護作用 , 但木質(zhì)素的去除對于纖維素有效

4、降解是最關(guān)鍵的6。一般對木質(zhì)纖維素材料 的利用,首先要進(jìn)行粉碎,然后預(yù)處理(酸堿處理等),最后 添 加 微 生物 來源 的纖維素復(fù)合水解酶類,使之與處理過的木質(zhì)纖維充分接觸,將其降解為單糖 , 從而用于乙醇發(fā)酵?，F(xiàn)在雖然前期的粉碎和預(yù)處理工藝研究取得了很大進(jìn)展但成本仍然較高，而且后期發(fā)酵分解處理。要添加來源于微生物的纖維素水解復(fù)合酶,價格仍十分昂貴7。這些因素導(dǎo)致目前用木質(zhì)纖維素作為這些因素 導(dǎo)致 目前用木質(zhì)纖維素作為原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇,成本較高發(fā)展緩慢因此,現(xiàn)在對木質(zhì)纖維素進(jìn)行高效降解使用,仍然是個很大的難題。2. 植物基因工程與植物木質(zhì)纖維素利用近年來隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步,人們開始嘗試?yán)弥?/p>

5、物基因工程方法來 解決植物木質(zhì)纖維素有效利用問題研究主要集中在改善植物細(xì)胞壁木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)和含量比例等方面,使植物多糖資源利于降解使用，或者利用植物作為生物反應(yīng)器,在植物內(nèi)表達(dá)微生物來源的強活性纖維素降解酶,使植物自身表達(dá)高活性纖維素水解 酶類等研究。2.1 改善植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 過去幾十年的研究,改善木質(zhì)素含量及細(xì)胞壁已成為可能。利用基 因工程方法,控制植物內(nèi)木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá),可以改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和含量木質(zhì)素對纖維素形成的保護作用是導(dǎo)致 纖維素資源利用 的主要障礙,降低木質(zhì)素含量或改變其結(jié)構(gòu),將利于纖維素 的分解8。雖然植物體木質(zhì)素的合成過程還不是十分清楚,但近幾年的研究,已使大

6、量降低木質(zhì)素含量成為可能。 在玉米和苜蓿的研究中發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素合成單體之一的芥子醇, 其前體的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase) ,如果被抑制表達(dá),芥子單體含量會明顯減少,可導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低 9, 10但是在楊樹中抑制這種酶的表達(dá)卻不能夠改善材質(zhì),木質(zhì)素含量反而增加11。Li L等人在楊樹中研究發(fā)現(xiàn),通過反義表達(dá)4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)時,木質(zhì)素含量了減少了約40%,并且導(dǎo)致10%的纖維素含量的增加，如果正義表達(dá)控制木質(zhì)素組成單體紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈瘡木基丙

7、烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因 (Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可導(dǎo)致紫丁香基丙烷的量明顯增 高,但木質(zhì)素含量沒有變化12。當(dāng)兩基因同時轉(zhuǎn)化時,木質(zhì)素含量減少可達(dá)53%,紫丁香基丙烷含量進(jìn)一步增加,而纖維素含量能夠增加30%。Cano-Delgado A等人研究擬南芥CESA3突變體發(fā)現(xiàn),纖維素合成酶受損時,導(dǎo)致了木質(zhì)素大量合成13這表明在植物木質(zhì)部細(xì)胞中可能存在一種調(diào)控機制,當(dāng)木質(zhì)素含量減少時,為了維持支撐作用,纖維素含量會相應(yīng)增加。Chabannes M等人在煙草中研究發(fā)現(xiàn),同時抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 C

8、AD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表達(dá),可大量減少木質(zhì)素含量,但非預(yù)期 的還引起了細(xì)胞壁多糖酚類物質(zhì)及可溶性酚類物質(zhì)含量的變化14等人在番茄中抑制表達(dá)木質(zhì)素合成相關(guān)的CCR基因,導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低,同時與木質(zhì)素形成具有共同前體的酚類復(fù)合物增加15。Boudet AM等人通過抑制楊樹木質(zhì)素合成酶基因CCR,可導(dǎo)致植物細(xì)胞壁纖維 素成分更容易被纖維素分解菌Clostridium產(chǎn)糖量達(dá)到原來的2倍16這表明,降低木質(zhì)素等物質(zhì)含量后,非常利于纖維資源的利用。Li Y等人研究發(fā)現(xiàn),過氧化酶影響了木質(zhì)化過程17。Blee KA等人在煙草中反義抑制過氧化酶FBP1(Fr

9、ench bean cationic peroxidase)同系物表達(dá),在不影響植物生長發(fā)育的情況下,使木質(zhì)素含量降低了40%50% 18。通過基因工程方法,改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)與含量的方法改善植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),利于作為能源植物,具有重要的研究價值 。2.2 植物體內(nèi)表達(dá)木質(zhì)纖維素水解酶過去幾十年的發(fā)展,植物已成功的作為重組蛋白表達(dá)的生物反應(yīng)器,它相對于微生物和動物表達(dá)的優(yōu)勢是具有較低的成本已在多種植物里面進(jìn)行了異源重組蛋白的表達(dá)研究(如疫苗和工業(yè)用酶等),蛋白表達(dá)量高且保持了很好的生物學(xué)活性19。近幾年,人們開始在植物體內(nèi)進(jìn)行微生物來源的研究,希望這些植物作為生物反應(yīng)器,大量表達(dá)并在細(xì)胞內(nèi)積累纖維素

10、酶。收獲的植物,經(jīng)過粉碎和預(yù)處理(酸堿處理等)后,在分解過程中能利用自身表達(dá)的酶,不添加加來源于微生物的酶,就可以將纖維素充分分解為單糖, 進(jìn)一步用于生產(chǎn)乙醇,降低生產(chǎn)成本(Sticklen M,2006)20?？紤]到細(xì)胞質(zhì)表達(dá)對植物生長影響較大,一般采用定向胞外或細(xì)胞器積累表達(dá)（如定向質(zhì)外體葉綠體溶酶體等）Ziegler MT等人在擬南芥中,定向質(zhì)外體,積累表達(dá)了來源于Acidothermus cellulolyticus的耐熱內(nèi)切-1,4-葡聚糖酶 (Endo-1,4-glucanase),表達(dá)量約達(dá)到葉子總可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性21，同樣是在擬南芥中,Hyunjong

11、B等人定向葉綠體和過氧化酶體,積累表達(dá)來源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),達(dá)到了總可溶性蛋白的4.6%,明顯 高于細(xì)胞質(zhì)表達(dá)和單一細(xì)胞器定向表達(dá)22在煙草中Dai Z等人定向葉綠體,積累表達(dá)了A.cellulolyticu 的耐熱內(nèi)切-1,4-葡聚糖酶,達(dá)到總可溶性蛋白的1.35%23。Dai Z等人采用同樣的酶,比較了定向不同細(xì)胞器積累表達(dá)的差異,發(fā)現(xiàn)定向質(zhì)外體表達(dá)蛋 白量最高,且保持了較好的活性24。在其它的植物中,也進(jìn)行了相關(guān)的研究, Xue GP等人在大麥的胚乳中,特異表達(dá)來源于Neocallimastix patriciarum 的內(nèi)切-1,4-葡聚

12、糖酶,約達(dá)到了總種子蛋白的1.5%25。Oraby H 等人在水稻中,定向質(zhì)外體積累表達(dá)了A.cellulolyticu耐熱內(nèi)切-1,4-葡聚糖酶,達(dá)到了葉子總可溶性蛋白的 4.9% 。目前的研究集中于將植物作為生物反應(yīng)器,盡可能多的表達(dá)并積累纖維素酶,用于后期的處理。在發(fā)酵分解過程可以利用植物自身表達(dá)的異源纖維素水解酶,節(jié)省了額外添加酶的量。表達(dá) 的大都是內(nèi)切-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,為了預(yù)處理后還 能保持較好活性,多采用穩(wěn)定性強的耐高溫酶 。由于纖維素有效降解需要復(fù)合水解酶,并且木質(zhì)素對其具有很強的保護作用,這些植物不會發(fā)生自身降解 。3. 前景與展望 利用不斷發(fā)展的植物基因工程技術(shù),

13、在能源植物研究方面已經(jīng)取得了不錯的研究進(jìn)展。但是,目前要實現(xiàn)廉價充分的利用纖維資源,還有一定的困難。通過對植物細(xì)胞壁合成 代謝研究的不斷深入,應(yīng)該能夠獲得對自身生長發(fā)育不影響的低木質(zhì)素植物細(xì)胞壁木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及含量改善纖維素含量增加,利于降解發(fā)酵產(chǎn)乙醇。還希望最終能夠獲得一種能源植物,這種植物通過自身表達(dá)異源的高活性木質(zhì)纖維水解復(fù)合酶,酶的表達(dá)受到誘導(dǎo)調(diào)控,收獲前誘導(dǎo)表達(dá),收獲后送往生物能源發(fā)酵工廠。這期間,木質(zhì)纖維素多糖在植物體內(nèi)也可進(jìn)行持續(xù)降解,在發(fā)酵工廠只需添加一些簡單的輔助分解酶就可以徹底降解掉,使木質(zhì)纖維資源產(chǎn)乙醇變得十分簡單參 考 文 獻(xiàn):1. Dorian JP, Franssen

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