孫中貫--發(fā)酵工程實驗教案 - 2012級

1、生物工程技術(shù)實驗發(fā)酵工程部分實驗講義微生物生長曲線和產(chǎn)物形成曲線的測定一實驗?zāi)康?了解分批培養(yǎng)時微生物生長曲線形成的原理及各時期的主要特點。2學(xué)習(xí)微生物生長曲線和產(chǎn)物曲線的測定方法。二實驗原理將少量微生物接種到一定體積的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時測定培養(yǎng)液中微生物的生長量（吸光度或活菌數(shù)的對數(shù)），以生長量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪制的曲線就是生長曲線，它反映了微生物在一定環(huán)境條件下的群體生長規(guī)律。依據(jù)生長速率的不同，一般可把生長曲線分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。這四個時期的長短因菌種的遺傳特性、接種量和培養(yǎng)條件而異。因此，通過微生物生長曲線的測定，可了解微生物的生長

2、規(guī)律，對于科研和生產(chǎn)實踐都具有重要的指導(dǎo)意義。測定微生物的數(shù)量有多種方法，如血球計數(shù)法、平板活菌計數(shù)法、稱重法、比濁法等，本實驗采用比濁法來測定。由于菌懸液的濃度與吸光度(A) 成正比也稱光密度比濁法，只要用分光光度計測得菌液的A后與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌株的生長曲線，此法快捷、簡便。產(chǎn)物形成曲線就是產(chǎn)物產(chǎn)量對培養(yǎng)時間的曲線。工業(yè)發(fā)酵的目的是為了收獲產(chǎn)物，因此必須搞清產(chǎn)物積累最高時所需的發(fā)酵時間。如果提前終止發(fā)酵，營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全被利用，發(fā)酵液中的產(chǎn)物量偏低；如果發(fā)酵時間過長，一方面產(chǎn)物可能會分解，另一方面也降低了設(shè)備利用率。因此，學(xué)會生長曲線和產(chǎn)物形成曲線的測定對工業(yè)發(fā)酵具有非

3、常重要的指導(dǎo)意義。三實驗器材1菌種釀酒酵母2培養(yǎng)基葡萄糖10%，蛋白胨5%，酵母膏2%3器材高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、分光光度計、恒溫培養(yǎng)箱、酒精計四實驗步驟1生長曲線的測定（1） 配制培養(yǎng)基，250mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基，一共28瓶，0.1MPa滅菌20min，備用；（2） 菌種活化：活性干酵母1g，100mL2%的蔗糖溶液中(3538),搖勻，置于3032 恒溫箱中活化12h，即得1%的ADY活化液。（3） 吸取2mL活化液接入裝有100mLYPD培養(yǎng)基的三角瓶中；（4） 將三角瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中，35培養(yǎng)144h；（5） 每隔12h拿出2瓶（包括0h），以不接種的培養(yǎng)基作對照，在

4、560nm處測吸光度，離心測菌體濃度，填入表中，（6） 以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作生長曲線。2產(chǎn)物形成曲線的測定24h后，每隔12h取出2瓶，在進行生長量測定的同時，進行產(chǎn)物形成量的的測定，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物形成量為縱坐標(biāo)，作出產(chǎn)物形成曲線；培養(yǎng)時間對菌體生長量和產(chǎn)物形成量的影響培養(yǎng)時間/h01224364860728496108120132144A560菌體濃度/%酒精度/%體積分?jǐn)?shù)（20）五注意事項1各瓶的接種量、培養(yǎng)條件應(yīng)一致。2若吸光度太高，可適當(dāng)稀釋后再測定。3因培養(yǎng)液中含有較多的顆粒性物質(zhì)（包括菌體），測吸光度時應(yīng)馬上讀數(shù)，否則，顆粒沉淀，影響測定結(jié)果。稀釋10倍

5、后測定是可行的辦法。若要精確測定，可用活菌計數(shù)法，在營養(yǎng)瓊脂上觀察生長的菌落數(shù)，但應(yīng)掌握好稀釋倍數(shù)。六思考題1如果每次從同一搖瓶中取出1mL進行測定，會對結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？2比較生長曲線與產(chǎn)物形成曲線，從中可以得出哪些結(jié)論？3測定生長曲線時，除了本實驗所用的分光光度計比濁法外，還有哪些方法？它們各有哪些優(yōu)缺點？四、工業(yè)微生物的篩選、分離純化及發(fā)酵生產(chǎn)（綜合設(shè)計型）-淀粉酶發(fā)酵（綜合設(shè)計實驗）1.實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)、掌握-淀粉酶發(fā)酵原理、發(fā)酵操作技術(shù)及淀粉酶活力的測定方法。2.實驗原理-淀粉酶，是以糖原或淀粉為底物，從分子內(nèi)部切開-1,4葡萄糖苷鍵，使底物水解成糊精和少量的葡萄糖和麥芽糖。其產(chǎn)物的還

6、原性末端葡萄糖殘基C1碳原子為構(gòu)型，故稱-淀粉酶。-淀粉酶被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、發(fā)酵、制糖及防治等工業(yè)，也是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣、產(chǎn)物最大的酶種之一。目前其合成機理多發(fā)生在發(fā)酵的對數(shù)生長期，并受分解代謝遏制的調(diào)節(jié)。其容易利用的碳源有蔗糖、葡萄糖、果糖等，這可以促進其細(xì)胞的呼吸和生長，但不利于產(chǎn)酶，代謝愈快的糖對產(chǎn)酶的抑制愈嚴(yán)重；反之，一些能源利用性差的糖類，如糖原、乳糖、半乳糖、棉籽糖和木糖等對生長不利，卻能促進產(chǎn)酶。3.實驗材料（1）菌株 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BF7658（2）培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉20，蛋白胨10，NaCl5，瓊脂20，pH6.

7、77.0,121滅菌20min。搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：豆餅粉40(過40目篩)，玉米粉80(過40目篩)，Na2HPO48，(NH4)2SO44，CaCl22，自然pH，121滅菌30min。 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：豆餅粉56(過40目篩)，玉米粉88(過40目篩)，Na2HPO48，(NH4)2SO44，CaCl2 2，自然pH，121滅菌30min。（3）儀器 全自動式7L發(fā)酵罐，自控電熱壓力蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，顯微鏡，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，紫外可見分光光度計。4.實驗步驟（1）發(fā)酵 將活化好的斜面菌種，接種于裝有50mL搖瓶培養(yǎng)液的500mL三角瓶中， 37，120r/min振蕩培養(yǎng)16h

8、作菌種。再按10%的接種量接種于裝有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，37，控制溶解氧濃度不低于10%，通風(fēng)攪拌培養(yǎng)40h左右。（2）-淀粉酶活力測定 采用QB1805.1-1993測定方法。5.實驗數(shù)據(jù)處理記錄-淀粉酶發(fā)酵過程中發(fā)酵時間、DO、菌體量、通風(fēng)量、攪拌轉(zhuǎn)速和酶活力的變化曲線。論述-淀粉酶發(fā)酵活力與發(fā)酵條件之間的動態(tài)關(guān)系。表1 -淀粉酶發(fā)酵過程中數(shù)據(jù)記錄與處理時間/hDO%通氣量/(L/min)攪拌轉(zhuǎn)速/(r/min)菌體量/(g/mL)酶活力/(u/mL)從0h起每4h測定一次，至40h思考題（1）-淀粉酶發(fā)酵過程中控制的關(guān)鍵點有哪些？（2）-淀粉酶活性測定原理是什么，應(yīng)注意什么問題

9、？液體通氣攪拌發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵系列實驗1 前言 近幾年來，采用谷氨酸生物素缺陷型菌種來生產(chǎn)谷氨酸已經(jīng)不能達(dá)到人需要的那種效果，所以很多味精公司、生物研究所等都在致力于開發(fā)新的耗糖少，產(chǎn)酸多，產(chǎn)酸穩(wěn)定的菌種。為此，很多研究者做了很多實驗，有些是有些成就的。發(fā)酵新工藝采用的是溫度敏感型菌種，溫度敏感型谷氨酸菌多為基因突變型菌株，突變位置是發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有關(guān)系的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的基因上。由于高溫使突變菌種的酶失去活性從而導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化，使細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變成有利于谷氨酸滲透的樣式。從而使得終產(chǎn)物谷氨酸能夠不斷排除細(xì)胞體外。這樣就使細(xì)胞內(nèi)谷氨酸產(chǎn)物不能積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，使得谷氨酸在細(xì)胞內(nèi)不斷合成

10、，在培養(yǎng)基中大量積累谷氨酸。從生物素用量的演變歷程來看，許多工廠已經(jīng)由傳統(tǒng)的生物素“亞適量”工藝發(fā)展為新型的生物素“超亞皿適量”工藝，生物素“亞適量”工藝中的生物素濃度僅為5g /L以下，而生物素“超亞適量”工藝中的生物素濃度為510g/ L ，其生物素用量明顯增大。理論上，對于生物索缺陷型菌株，增大用量可提高菌體濃度，在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵控制下，當(dāng)菌體內(nèi)生物素被消耗至“貧乏”水平，菌體可大量合成谷氨酸，從而達(dá)到提高代謝產(chǎn)物濃度的目的。還有一些學(xué)者在培養(yǎng)基中做文章，改變培養(yǎng)基中的磷酸鹽含量，來觀察谷氨酸的生產(chǎn)情況，都得到了不錯的效果。谷氨酸發(fā)酵的前景很廣闊，需要我們更用心的探討研究。2 材料和方法2.

11、1 實驗菌種和試劑 谷氨酸棒狀桿菌TG866、0.9%生理鹽水、50%葡萄糖、20%尿素、2mol/L鹽酸、2mol/L氫氧化鈉2.2 實驗儀器 分光光度計、不銹鋼機械攪拌自動發(fā)酵罐（BIOTECH-7JS）、葡萄糖-谷氨酸分析儀（SBA-40C）、培養(yǎng)搖床、生化培養(yǎng)箱、高速臺式離心機、滅菌鍋、燒杯、量筒、三角瓶、玻璃棒、試管、漩渦振蕩器、比色管2.3 7L發(fā)酵罐2.3.1 發(fā)酵罐的主要部件及作用 罐體：主要用來培養(yǎng)發(fā)酵各種菌體，密封性要好（防止菌體被污染）罐體當(dāng)中有攪拌漿，用于發(fā)酵過程當(dāng)中不停的攪拌；底部通氣的Sparger，用來通入菌體生長所需要的空氣或氧氣；罐體的頂盤上有控制傳感器，最常

12、用的有pH電極和DO電極，用來監(jiān)測發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH和DO的變化控制器，用來顯示和控制發(fā)酵條件等等。2.3.2 發(fā)酵罐的附加裝置 攪拌機（無級變速）；無菌呼吸氣孔（或無菌正壓器）；進、出料口 ，無菌采樣口；冷水進、出口；溫度計；空氣壓縮機；自動化電子顯示儀2.3.3 發(fā)酵罐的使用方法操作步驟1)、電極和溶氧電極；2)、滅菌。根據(jù)需要將培養(yǎng)基配入罐體，按要求封好后將罐體放入大滅菌鍋滅菌（115，30min）；3)、冷卻后，將其置于發(fā)酵臺上，安裝完好；打開冷卻水，打開氣泵電源，連接通氣管道開始通氣，調(diào)節(jié)進氣旋鈕使通氣量適當(dāng)；打開發(fā)酵罐電源，設(shè)置溫度、pH、攪拌速度等， 240r/min下開機轉(zhuǎn)動

13、30min，設(shè)定溶氧電極為100；4）、溫度穩(wěn)定，各項參數(shù)都正確后，將預(yù)搖好的種子接入，開始發(fā)酵計時，并開始記錄各種參數(shù)；5）、發(fā)酵完畢后清洗罐體和電極，將電極插入有4M氯化鉀的三角瓶中待用。2.4 培養(yǎng)基2.4.1 活化斜面培養(yǎng)基 葡萄糖（1g）、蛋白胨（1g）、牛肉膏（1g）、酵母膏（0.5g）、NaCl(0.25g)、瓊脂（1.5g）、pH 7.0-7.2 、322.4.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖（6.5g）、酵母膏（10g）、尿素8（分消）、K2HPO4（0.35g）、MgSO4（0.2g）、pH 7.0-7.2、322.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖（24g）、酵母膏（1.2g）、K2HPO

14、4（1.05g）、KH2PO4（0.3g）、尿素8（分消）、MgSO4（0.24g）、pH 7.2-7.52.5 實驗方法2.5.1 菌種的活化 取斜面保藏菌種通過劃線法接種于10支活化斜面大試管中，32下恒溫培養(yǎng)20h-24h。2.5.2 種子培養(yǎng) 將1支生長良好的大好試管的活化斜面的種子用1ml生理鹽水洗下，吸取1ml菌液轉(zhuǎn)入裝有60ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，9層紗布封口，置于搖床中240rpm，32下培養(yǎng)12h-14h至對數(shù)生長后期。2.5.3 搖床發(fā)酵培養(yǎng)法 按10%接種量將種子液3ml接入裝有27ml發(fā)酵培養(yǎng)基的10個500ml三角瓶中，9層紗布封口，置于搖床中240rpm

15、，32下培養(yǎng)發(fā)酵36h-40h，每兩小時檢測一次OD值、殘?zhí)呛?、谷氨酸產(chǎn)量，做好記錄。2.5.4 菌種的生長測定（吸光度法） 用可調(diào)微量移液器吸取0.5ml的菌液置于離心管中，8000r/min下離心2min，去上清液0.1ml并稀釋至10ml，用生物傳感儀（用前需用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)定）檢測殘?zhí)呛亢凸劝彼岙a(chǎn)量；離心管中剩下的菌體加少許蒸餾水用漩渦振蕩器振蕩使菌體振碎并混合均勻，倒入比色管中稀釋至10ml，用分光光度計測定在620nm下的吸光度。2.5.5 發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)方法 按10%的接種量將已經(jīng)準(zhǔn)備好的菌液接入10L的發(fā)酵罐中，自動控制調(diào)節(jié)pH值、溫度、攪拌速度、溶解氧、補料等，在32-36下發(fā)酵36h-40h，并每隔兩個小時用同樣的方法檢測發(fā)酵罐中菌液的OD值、殘?zhí)呛亢凸劝彼岬漠a(chǎn)量等。2.6 發(fā)酵過程的控制 在正常的發(fā)酵生產(chǎn)中，我們一般控制的要素為發(fā)酵轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵產(chǎn)酸、發(fā)酵周期、發(fā)酵理論酸和發(fā)酵液質(zhì)量等關(guān)鍵指標(biāo)，而在控制發(fā)酵轉(zhuǎn)化率的過程中，往往會因為控制的偏差或控制手段不力，更甚者因控制方法不當(dāng)，造成轉(zhuǎn)化率提高困難或反其道而行之，同時在指標(biāo)的提高方面難度更大。 針對生產(chǎn)中菌體量變化可適當(dāng)以變應(yīng)變控制，減少損失。在菌體量增加的情況下，可以適當(dāng)增加投糖量。具體的方法是：在檢測中如果