免疫透射比濁法

1、免疫透射比濁法 一、原理當(dāng)光線通過一個渾濁介質(zhì)溶液時，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早于1959年Schultre和Schuick等報道應(yīng)用于血漿蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物，導(dǎo)致濁度的改變，再進(jìn)行透射比濁測定，一般采用抗體對抗原定量的透射比濁法，稱為免疫透射比濁法。其原理是，利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過測定復(fù)合物形成量的多少對抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。在介質(zhì)溶液中，抗原與特異性抗體在一定條 件下才能形成復(fù)合物，一定的條件包括：對抗體的要求，作為體液或組織中蛋白質(zhì)種類很 多，若要快速 特異檢

2、測，要求有單價特異抗體才能與抗原形成復(fù)合物。某一種蛋白質(zhì)， 有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物進(jìn)行定量，若抗體不純混雜有另一種或兩種少量的抗體，這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜除，結(jié)果偏高；抗原抗體比例適當(dāng)，因免疫復(fù)合物形成有三個階段，第一階段是復(fù)合物形成抗原抗體復(fù)合物；第二階段是初步形成抗原抗體復(fù)合物，此階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)；第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀。只有在抗原與抗體等價時即無過?？贵w，此時，復(fù)合物的結(jié)合與解離處于平衡狀態(tài)，具混濁程度達(dá)高峰。在抗體過量時，隨抗原量的增加而復(fù)合物形成也增加，其測定只能在反應(yīng) 曲線的左側(cè)進(jìn)行（見圖18-4 ） ；3一般要求溶液

3、中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成，如 聚二 乙醇6000等。溶液pH為6.5? 8.0之間為宜。載脂蛋白有形成兩性螺旋片（ amphipathic helix ）的特性，對脂質(zhì)（特別是磷脂）有高度親和力，與脂質(zhì)結(jié)合后有時會掩蓋抗原位點或構(gòu)象改變，可以部分或完全喪失對抗血清的特異反應(yīng)。為此，載脂蛋白檢測過程中有必要先暴露抗原位點，所用試劑有表面活性劑，尿 素，鹽酸月瓜和吐溫等解離蛋白劑，或用四甲基月尿 脫脂或有機溶劑脫脂等暴露抗原決定簇等方法，血清脂蛋白顆粒中的載脂蛋白，能在短時間內(nèi)形成抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行定量；抗原不能過量，因為抗原過量，抗 原抗體復(fù)合物形成不但不增加，反而會減少，光散

4、射或光吸收減少，檢測結(jié)果反而偏低。枕體轎If圖18-4抗原抗體反應(yīng)曲線在免疫比濁過程中，由于抗原抗體結(jié)合的三過程，從而導(dǎo)致光密度與濃度之間不呈線性關(guān)系，一般是、血清ApoA 1( Bioo )透射比濁測定法脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒，分散于溶液介質(zhì)中，在一定波長下測定其混濁程度，進(jìn)行ApoA 1( Bp。)的定量測定。(一)手工操作1 ?原理血清ApoA 1( Bioo) +抗人ApoA 1( Bioo)一抗原抗體復(fù)合物一測定光密度2 ?試劑(伊利J康)(1 ) Apo緩沖液(R I),含4%PEG6000和表面活性劑(2)羊抗人ApoAI( Bioo)抗體液

5、(R H):監(jiān)用前取抗血清 200 gl,力口 0.9%NaCI液700 g l,混勻，待用，置冰箱一周內(nèi)有效。3次方程曲線關(guān)系。若將抗原與抗體兩個變量之間的變動特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜?，需要?jīng)過3次方程擬合成近似直線化的曲線方程，冉進(jìn)行運算，免疫比濁中，采用終點法或速率法，用5個或7個不同梯度進(jìn)行定標(biāo)，經(jīng)3次曲線方程求出一條能反映真實情況的濃度與光密度的關(guān)系曲線方程,才能作為定量的工作曲線ApoA I( B100)參考血清(R山)芮府區(qū)(抗體過參考血清待測血清ApoA I抗體液抗體液ApoB 100混勻各管,37標(biāo)準(zhǔn)管5 gl1.0mlC 保溫 10min ,測定管5gl1.0ml空白管1.0ml

6、標(biāo)準(zhǔn)管5gl1.0ml測定管5gl1.0ml波長340min ,于半自動分析儀上先吸入空白管液，再吸入標(biāo)準(zhǔn)管,空白管1.0ml儀器 根據(jù)光密度及3.操作（1 ）按ApoA I抗血清液或 ApoBioo抗血清100g l,加相應(yīng)的Apo緩沖液0.9ml的比例混合成單一試劑（Apo抗體液）。最好臨用前配制當(dāng)天用量（2 ）各試劑用量如下表ApoAApoB loo參考值得出一換算系數(shù)，再吸入測定管，儀器內(nèi)根據(jù)光密度及系數(shù)進(jìn)行運算，打印結(jié)果。（3）定標(biāo)方法，根據(jù)免疫比濁法原理，應(yīng)取多點（3? 9點），按y=a+bx+cx 2+dx3的3次方程回歸曲線進(jìn)行定標(biāo)，制作參考工作曲線。D 校正工作曲線的繪制:

7、配制抗血清稀釋工作液：按 R I試劑0.9ml ,力口 R H試劑100 ”的比例（Apo抗體液）混勻，待用。制備5點校正液：取R山（參考血清），用 0.9%生理鹽水倍比稀釋成5個濃度，第5管為原參考血消濃度，其他4管分別為第5管的1/2、1/4、1/8、1/16 （或濃度為0即0.9%NaCl ）。表18-20標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的各管（點）濃度號管（0）（ g）l號管(1/8)( g)號管(1/4)( g)號管(1/2 )( g)號管(1/1 )( g)Apo抗體液（ml）1.01.01.01.01.0混勻各管，置37 C水浴保溫10min ,按程序上機作工作曲線。于37 C水浴保溫10min ,

8、標(biāo)本測定：吸待測血清（測定管）5 P l加上述稀釋抗血清工作液 1.0ml ,上機讀數(shù)，打印結(jié)果 如測定值超過工作曲線上限值，儀器會打印顯示“過高”，此時，將待測標(biāo)本稀釋 1倍再測。每批號的抗血清應(yīng)作一次多點定標(biāo)，即測定標(biāo)本的抗血清應(yīng)與定標(biāo)的抗血清是同一批號抗血清。(二)生化分析儀測定1 ?原理脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒分散于溶液介質(zhì)中，在一定波長下測定其混濁程度，進(jìn)行 ApoA 1 ( Bp。)的定量測定。ApoA I ( B100) +抗人ApoA I ( B100)抗原抗體復(fù)合物測定吸光光密度2 ?雙試劑單(雙)波長法(1 )試劑(溫州伊利康)r I:

9、Apo緩沖液，含4% PEG6000和表面活性。R n：羊抗人ApoA ( B100)稀釋抗血清R山：Apo定值血清(2)各試劑及標(biāo)本用量如下表項目血清ApoA IApoB 100Apo緩沖液(R I)300 ? 350 gl300 ? 350 glApoA I抗血清液(R n)80 ? 100 glApoB 100抗血清液(R n)80- 100 gl18-21參數(shù)上機定標(biāo)，如圖18-5所示(3)定標(biāo)：以5點Apo梯度濃度，采用免疫定標(biāo)法按表CL-7200儀器為例)圖18-5 ApoA I五點免疫定標(biāo)曲線圖(以(4)上機(終點法或兩點法)37VApo煨沖玻340 FLH)37VAp 抗 JL

10、 清？ ft(R0)(A1)5 31 kic ;34(A.111C2>(5)說明：Apo測定的光密度從340? 700nm范圍都可采用，多用 340nm ;國內(nèi)已有的Apo試劑盒均無需處 理；血清標(biāo)本也無需處理，均可直接檢測；本法適用于多種類型的全自動生化分析儀檢測，自動扣除空白，快速準(zhǔn)確；效價不同的抗血清，其用量應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。(5)計算 A=A2-A1,以么A值采用免疫定標(biāo)自動運算。3.單一試劑單波長法(1)試劑同雙試劑法(2)標(biāo)本及試劑用量：按ApoA I抗血清液或 ApoB抗血清液(R II )100 P加相應(yīng)的Apo緩沖液(R I )0.3m l的比例混合成單一試劑(Apo抗體

11、液)。最好臨用前配制當(dāng)天用量,此抗體液置2? 8c保存一周有效。(3) 定標(biāo)：按五點梯度稀釋定值血清(見表18-21 ),以終點法或兩點法進(jìn)行免疫定標(biāo)。(4) 按以下步驟操作：3/V&7V* (AI) (A2)Apo 沆倬沌 300 - 350pl5 10S340nm(5)以么A=A2-A1值按免疫定標(biāo)自動運算(6)說明：該法一般用半自動生化分析儀；通過設(shè)延遲時間以扣除空白；RI、R I試劑以臨用時混合為好，未用完的混合試劑應(yīng)置于2? 8 'C冰箱保存，只允許使用一周；血清標(biāo)本無需再處理4. ApoA I、A I、B、CI、C山和E的全自動生化分析儀檢測的有關(guān)數(shù)據(jù)。(1 )上機參數(shù)(以CL-7200型為例)如表18-21所示。表 18-21自動生化分析儀檢測Apo啟美參數(shù)，應(yīng)類型ApoA I終點法AIBC IC山E“品量3 gl3 gl3 gl8 gl3 gl5 gl則量波長600nm (第一)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)700nm