大腸桿菌的檢測MPN計數(shù)法

1、食品微生物檢驗技術(shù)課程綜述大腸桿菌的檢測（MP"數(shù)法）院系：食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院班級：食科114姓名：張花學(xué)號： 114031431組長：張軍玲成員：張花趙晶有B 朱娟娟 大腸桿菌Petrifilm 測試片計數(shù)法 摘要食品檢測是反映食品加工、貯藏、運輸、等環(huán)節(jié)的衛(wèi)生與安全 狀況的重要手段，而大腸菌群檢測則是食品檢測的重要指標(biāo)均之一。 根據(jù)定義大腸菌群是在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧 和堿性厭氧的革蘭氏陰性芽胞桿菌。其主要檢測意義在于反映食品衛(wèi) 生狀況并推測其在腸道致病菌的可能性。Petrifilm 大腸菌群測試片 是由美國3M生產(chǎn)的一種預(yù)先制備好的 VRB平板培養(yǎng)基系統(tǒng)，并

2、添加 了 TTC作為菌落指示劑便于菌落判讀，而上層薄膜可以起到對大腸菌 群發(fā)酵產(chǎn)生的氣體截留的作用。該方法目前已被多數(shù)權(quán)威機構(gòu)認(rèn)可， 并在國內(nèi)很多實驗室開展運用。關(guān)鍵詞 大腸桿菌Petrifilm 測試法1/5下載文檔可編輯1設(shè)備和材料1.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ± 1C。1.2 冰箱25C。1.3 恒溫水浴箱:44.5 ±0. 2CO1.4 天平：感量0.1g。1.5 均質(zhì)器1.6 振蕩器。1.7 無菌吸管:lmL（具0.01 mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量 移液器及吸頭。1.8 無菌錐形瓶：容量500mL1.9 玻璃珠：直徑約5mm1.10 pH計或pH比

3、色管或精密pH試紙1.11 試管架。2.培養(yǎng)基和試劑2.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白月東（LST ）肉湯。2.2 EC肉湯。2.3 蛋白月東水。2.4 緩沖葡萄糖蛋白月東水（MP-V戲驗用）。2.5 磷酸鹽緩沖液。2.6 無菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉溶于1000ml蒸儲水中，121c高 壓滅菌15min。2.71 mol/L氫氧化鈉（NaOH :稱取40g氫氧化鈉溶于1000ml蒸儲2/5下載文檔可編輯水中2.81 mol/L鹽酸（HCI）:移取濃鹽酸90ml,用蒸儲水稀釋至1000ml3檢驗程序賽樣25 E C或25 EL）樣品+ 225血邪釋液均質(zhì)10倍系列稀釋選擇適宜2個3個連續(xù)稀釋度的樣

4、晶勺液，接種PeEfilmM測試36 P±1 P:H h±2h 或48 h±2h計數(shù)Petnillmm13試片上的藍(lán)色帶氣泡幽報告第果4.樣品稀釋4.1 固體和半固體樣品：以無菌操作將檢樣25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)或其他稀釋液的滅菌錐形瓶內(nèi)（瓶內(nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀 釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8 000-10 000 r/min的速度處理1 2min,做成1:10的樣品均勻稀釋液）。4.2 液體樣品：以無菌吸管吸取樣品25ml置盛有225mL磷酸鹽緩 沖液的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠

5、）中，充分振搖，制 成1: 10的樣品勻液。4.3 樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時分別用1mol/L3/5下載文檔可編輯 氫氧化鈉（NaOH成1mol/L鹽酸（HCI ）調(diào)節(jié)。4.4 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,沿管壁緩緩注入含有 9mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋 液。4.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上條操作依次做10倍遞增稀 釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。從制備樣品勻液至樣 品接種完畢，全程不得超過15min。5檢驗5.1接種和培養(yǎng)選取23個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種兩張 測試片。將測試片置于平

6、坦實驗臺面上，揭開上層膜，用吸管吸取樣 品勻液1ml垂直地價在測試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡 產(chǎn)生和上層膜直接落下，將壓板放置在上層膜中央處，輕輕地壓下， 是樣品勻液覆蓋與圓形的培養(yǎng)膜表面，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜 置至少1min意識培養(yǎng)基凝固。將測試片的透明面朝上放于 36c的培 養(yǎng)箱內(nèi)，地跌層數(shù)不超過20片，肉、家禽和水產(chǎn)品，培養(yǎng)時間為 24 ±2h;其他食品培養(yǎng)時間為48±2h。5.1判讀可肉眼觀察計數(shù)，或用菌落計數(shù)器、放大鏡、 Petrifilm 自動判 讀儀計數(shù)。藍(lán)色有氣泡的菌落確認(rèn)為大腸桿菌，不論藍(lán)色的深淺，部 分藍(lán)色的帶氣泡菌落也判定為大腸桿菌。

7、圓形培養(yǎng)膜邊緣及邊緣以外 的菌落不計數(shù)。當(dāng)測試片出現(xiàn)大量氣泡、不明顯的小菌落，培養(yǎng)區(qū)成4/5下載文檔可編輯 藍(lán)色時，需要進(jìn)一步稀釋樣品勻液，重新檢驗。6大腸桿菌測試片技術(shù)的報告選擇菌落數(shù)在15150之間的稀釋度，兩張測試片菌落平均乘以 稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數(shù)，以CFU/g（CFU/ml） 表不。如果所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)都小于15,計數(shù)最低稀釋度測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如果所有稀釋度測試片上均無菌落生長，以“小于1乘以最低稀釋倍數(shù)”報告；如果所有稀釋 度的菌落數(shù)都大于150,計數(shù)最高稀釋度測試片上的平均菌落數(shù)乘以 稀釋倍數(shù)報告。技術(shù)菌落數(shù)大于150個的測試片，可計數(shù)一個或兩個 具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個方格內(nèi)的菌落數(shù)以后乘以 20,即為測試片上估算的菌落數(shù)（圓形生長面積為20c m2）。參考文獻(xiàn)U13中華人民共和國