微生物限度檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、1目的規(guī)范微生物限度檢驗(yàn)操作，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。2依據(jù)中國(guó)藥典2010版。3范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物限度檢驗(yàn)。4責(zé)任中心化驗(yàn)室負(fù)責(zé)人：對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。中心化驗(yàn)室檢驗(yàn)人員：嚴(yán)格按照本規(guī)程執(zhí)行檢驗(yàn)操作。5程序5.1 執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：中國(guó)藥典2010版。5.2 抽樣：照取樣標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。6細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過(guò)濾法。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定。6.1 設(shè)備、儀器及用具6.1.1 設(shè)備微生物限度檢測(cè)室室、凈化工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱(30-350C)、生化培養(yǎng)箱(23-2800) 電熱恒溫水浴鍋、烘箱、電冰箱、滅菌柜、紫外燈等。6.1.

2、2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、薄膜過(guò)濾器等。6.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌銀子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、薄膜過(guò)濾膜等。6.2 試液6.2.1 消毒液A. 0.1%新潔爾滅溶液：供手消毒、擦拭操作臺(tái)面用第2頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03B. 75%醇溶液6.2.2 稀釋液、試劑及配制A . PH7.猶菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液：取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化 鈉4.3g、蛋白陳1.0g,加純化水1000ml,微溫溶解，濾清，分裝

3、，1210c滅菌15分鐘。B .聚山梨酯80C .吐溫80D.單硬脂酸甘油酯6.3 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基6.4 操作方法6.4.1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備6.4.1.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、試管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀釋劑等移至傳遞窗內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入 操作問(wèn)。6.4.1.2 開啟微生物檢測(cè)室紫外燈和空調(diào)凈化系統(tǒng)，并使其工作不低于30min。6.4.1.3 操作人員進(jìn)入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。進(jìn)入二更，用0.1%新潔爾滅溶液洗手，穿戴潔凈無(wú)菌服、口罩、手套。6.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉

4、球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)銀或剪將供試品啟封。6.4.2 供試液的制備供試液的制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不宜超過(guò) 450C,時(shí)間不得超過(guò)30分鐘。除另有 規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下：6.4.2.1 液體供試品取供試品10ml,力口 pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml,混勻，作為1:10的供試 液。油劑可加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80#供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的 供試品原液作為供試液。6.4.2.2 固體、半固體或粘稠性供試品取供試品10g,加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml,用適宜的方法，混勻，作為1:10的供試液。必要

5、時(shí)加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80,并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品第3頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03分散均勻。6.4.2.3 乳膏劑取供試品5g （或5ml）,加至含溶化的（溫度不超過(guò)45C）的吐溫80、3g單硬脂酸甘 油酯、10g聚山梨酯80無(wú)菌混合物的燒杯中，用無(wú)菌玻璃棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入 45c的 PH7.擾菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液至100ml,邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為 1:20供 試液。6.4.2.4 栓齊1J取供試品10g,加適量稀釋液，置45c水浴保溫10分鐘，使溶，加入無(wú)菌聚山梨酯80 5-8ml,振搖使之乳化，再加稀釋液（稀釋液和聚山梨酯 80的總量

6、為100ml）,搖勻，作為 1:10的供試液。6.4.2.5 腸溶制劑取供試品10g,加PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml, 45c水浴中，振搖，使溶解，作 為1:10的供試液。6.4.3 供試液的稀釋取1支1ml滅菌吸管吸取1:10均勻供試液1ml,加入裝有9mlPH7.擾菌氯化鈉-蛋白陳 緩沖液的試管中混勻，即為1:100供試液。（此時(shí)操作一般為：左手執(zhí)試管并將塞打開、 傾斜，右手執(zhí)10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇燈焰峰正上方操作，以免燈焰將供試液中菌 細(xì)胞殺滅）以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1:1000、1:10000等適宜稀釋級(jí)。每遞增1稀釋劑，必須另?yè)Q一支吸管。稀釋時(shí)，吸

7、管插入第1級(jí)稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm,反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng) 先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，吸管移至 第2級(jí)稀釋管的內(nèi)壁近液面處（勿接觸液面）緩慢地放出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無(wú)黏附或 殘留液體）。6.4.4 檢查法6.4.4.1 平皿法6.4.4.1.1 在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管，吸取每級(jí)稀釋級(jí)供試液各 1ml置每個(gè)滅菌平皿中，每一稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少注23個(gè)平皿（一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注平皿時(shí)，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無(wú)殘留液 體，防止反流至吸管尖端部。第4頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SO

8、P-QC-004-036.4.4.1.2 陰性對(duì)照 用1支1ml吸管吸取試驗(yàn)用稀釋液（PH7.擾菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液）各1ml,分別注入4個(gè)平皿中。其中兩個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對(duì)照：另兩個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù) 陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。6.4.4.1.3 傾注培養(yǎng)基將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基（細(xì)菌計(jì)數(shù)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）熔化，置45。C水浴中，備用。將45 C左右的瓊脂傾注上述各個(gè)平皿約15ml,以順 時(shí)針或反時(shí)針?lè)较蚩焖俎D(zhuǎn)動(dòng)平皿 （勿使培養(yǎng)基溢出）使供試液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。 6.4.4.1.4 培養(yǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于 30-35 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。霉菌、酵母菌計(jì)

9、數(shù)平板倒置于 23-28C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至7天。逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)， 6.4.4.1.5 菌落計(jì)數(shù)將平板置觀察臺(tái)上用標(biāo)記筆點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察，計(jì)數(shù)。必要 時(shí)借助于放大鏡和顯微鏡觀察。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算 各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平 均數(shù)不小于15,則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。一般營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉豚葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基

10、上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌 落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。6.4.4.1.6 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的平板計(jì)數(shù)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍 數(shù)的值報(bào)告1g、1ml或10 c m2供試品中所含的菌數(shù)。如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)， 或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)

11、告菌數(shù)。6.4.4.2 薄膜過(guò)濾法6.4.4.2.1 采用薄膜過(guò)濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45 pm直彳約為50mm選擇濾膜材質(zhì)第5頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方 法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗 液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，具濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最 大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后， 若需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超過(guò)1000ml,以避

12、免濾膜上的微生物受損傷。6.4.4.2.2 取相當(dāng)于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。若供試品每1g或1ml所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml,過(guò)濾。用PH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼 于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅那瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉豚葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每種 培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上是不得有空隙或氣泡，否則影響微生物的生長(zhǎng)。6.4.4.2.3 陰性對(duì)照 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml照上述薄膜過(guò)濾法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。6.4.4.2.4 培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件

13、和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過(guò)100cfu。6.4.4.2.5 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌落 生長(zhǎng)，以1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)來(lái)1g或1ml供試品），或1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告 菌數(shù)。6.4.4.3 培養(yǎng)基稀釋法取低稀釋級(jí)供試液（原液或1:10供試液或其他供試液）2份，每份各1ml,分別注入 平皿中（每皿0.5ml、0.2ml或0.2ml）,每1個(gè)平皿傾注培養(yǎng)基約15ml,混勻，凝固后， 倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每份供試液所加注平板點(diǎn)計(jì)的菌落之和，即為每1ml菌落數(shù)，公的2組數(shù)據(jù)。以兩份低稀釋級(jí)供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。6.4.4

14、.4 結(jié)果報(bào)告6.4.4.4.1 菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告。6.4.4.4.2 菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。6.4.4.5 復(fù)試供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)其中一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合格，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03第6頁(yè)共19頁(yè)重新取2倍包裝量供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩份，以三次檢驗(yàn)結(jié)果的均值報(bào)告。若3次結(jié) 果的平均值超過(guò)該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定：否則，判供試品符合規(guī)定?？刂凭鷻z查控制菌檢查是用于檢查某些特定微生物（控制菌或其他致病菌），按一次檢出結(jié)果 為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行供試品

15、的控制菌檢查。7大腸埃希菌7.1 設(shè)備、儀器及用具7.1.1 設(shè)備微生物限度檢測(cè)室室、凈化工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱（30-35C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、電冰箱、滅菌柜、紫外燈等。7.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過(guò)濾器等。7.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌銀子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、薄膜過(guò)濾膜等。7.2 試液指示液PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液、PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液、靛基質(zhì)試液、革蘭 染色液、碘液、95%醇。7.3 培

16、養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、4-甲基傘形酮葡萄糖甘酸培養(yǎng)基（MUG、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 培養(yǎng)基（EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等。7.4 操作方法7.4.1 增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL） 2瓶，每瓶各100ml, 1瓶加入供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、 1ml、10cm2）, 1瓶加入10ml的稀釋液作陰性對(duì)照。30-35七培養(yǎng)18-24h ,必要時(shí)可延至48h。 陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取上述培養(yǎng)物0.2ml ,接種至5mlMUG養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的MU端養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為 MU第7頁(yè)共

17、19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03性；不呈現(xiàn)熒光，為MU掰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫現(xiàn)紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG0性和靛基質(zhì)陰性。如MU63性（有熒光）、靛基質(zhì)陽(yáng)性（玫瑰紅色），判供試品檢出大腸埃希菌；如 MUG 陰性（無(wú)熒光）、靛基質(zhì)陰性（無(wú)色），判供試品未檢出大腸埃希菌。7.4.2 分離培養(yǎng)7.4.2.1 如MUG日性、靛基質(zhì)陰性或MUG!性、靛基質(zhì)陽(yáng)性時(shí)，將上述供試品 BL增菌培 養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取 1-2環(huán)培養(yǎng)液劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB或麥康凱瓊脂 平板上，培養(yǎng)18-24h,觀察EMEff

18、板或麥康凱瓊脂平板有無(wú)可疑大腸埃希菌菌落生長(zhǎng)。若 平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列特征，可判供試品未檢出大腸埃希菌。大腸埃希菌菌落形態(tài)特征菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無(wú)明顯暗色 中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常后金屬光澤。麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表 面光滑，濕潤(rùn)。7.4.2.2 若曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB或麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落與表中所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，應(yīng)挑取可疑菌落進(jìn)行分離、純化、革蘭染色、鏡檢及IMViC試驗(yàn)。7.4.3 純培養(yǎng)如生長(zhǎng)菌落與上表所列特征相符合或

19、疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表 面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選23個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18-24h, 作以下檢查。如平板上無(wú)單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌 團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于 EMB脂平板，培養(yǎng)18-24h,再挑 選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。7.4.4 革蘭染色、鏡檢7.4.4.1 以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過(guò)火焰23次（載玻片不燙手）固定。滴加 結(jié)晶紫染液，染色1min,水洗,滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾

20、紙吸干余水。滴加95叱醇,脫 色2030s,水洗。滴加沙黃染液，復(fù)染1min,待干后，鏡檢。7.4.4.2 染色結(jié)果 革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色，大腸埃希菌為革蘭陰性短第8頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03桿菌,或球桿菌狀，亦有桿菌狀。7.4.4.3 注意事項(xiàng)7.4.4.3.1 玻片必須潔凈，涂片菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細(xì)胞成堆或連成片。染色反應(yīng)難于判斷，菌細(xì)胞形態(tài)難于觀察。7.4.4.3.2 培養(yǎng)物的菌齡以16-24h為宜。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的革蘭陽(yáng)性菌易染成紅色。7.4.4.3.3 脫色是關(guān)鍵，脫色時(shí)間不足，菌細(xì)胞易染成陽(yáng)性，脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易染成陰性。7.5

21、結(jié)果判斷7.5.1 當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，供試品 MUG日性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，報(bào)告檢出大腸埃希菌。MU制性、靛基質(zhì)陰性，報(bào)告供試品未檢出大腸埃希菌。7.5.2 MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性、革蘭陰性桿菌，報(bào)告供試品檢出大腸埃希菌；MUG0性、靛基質(zhì)陽(yáng)性、革蘭陰性桿菌，報(bào)告供試品檢出大腸埃希菌。7.5.3 供試品培養(yǎng)物檢查不符合7.6.2二項(xiàng)中的任一項(xiàng)，報(bào)告供試品未檢出大腸埃希菌。7.5.4 當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)不能作出檢驗(yàn)報(bào)告。8大腸菌群8.1 設(shè)備、儀器及用具8.1.1 設(shè)備微生物限度檢測(cè)室室、凈化工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱（30-350C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、電冰箱、滅菌柜、紫外燈等。8.1.2 儀器及器

22、皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過(guò)濾器等。8.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌銀子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、薄膜過(guò)濾膜等。8.2 試液、指示液PH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液、PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液Q Q 成關(guān)苴 8.3乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB或麥康凱瓊叫故關(guān)苴生 月日1口亦有與寸第9頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-038.4操作方法8.4.1 增菌培養(yǎng)取含10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培

23、養(yǎng)基管3支，分別加入1:10的供試液1ml （含供試品0.1g 或0.1ml）、1:100的供試液1ml （含供試品0.01g或0.01ml ）、1:1000的供試液1ml （含供 試品0.001g或0.001ml）,另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液1ml作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)1824小時(shí)。加供試品的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管若無(wú)菌生長(zhǎng)或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未 檢出大腸菌群；若乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)進(jìn)一步分離培養(yǎng)。8.4.2 分離培養(yǎng)將上述產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中的培養(yǎng)物，分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康 凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落

24、與下表所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰 性無(wú)芽抱桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征 相符或疑似，且為革蘭陰性無(wú)芽抱桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。菌落形態(tài)曙紅亞鉀藍(lán)瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊， 表面光滑，濕潤(rùn)。麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕 潤(rùn)。8.4.3 確證試驗(yàn)從上述分離平板上挑選45個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時(shí)，若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。8.5.4 結(jié)果判斷 根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按下表報(bào)告1g或1ml供試品中的大腸菌

25、群數(shù)。各供試品量的檢出結(jié)果可能的大腸菌群數(shù) N（個(gè)/g或ml）0.1g 或 0.1ml0.01g 或 0.01ml0.001g 或 0.001ml+1000+-100v Nv 1000+-10 N 100-v 10注：“+”代表檢出大腸菌群；“-”代表未檢出大腸菌群9沙門菌第10頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-039.1 設(shè)備、儀器及用具9.1.1 設(shè)備微生物限度檢測(cè)室室、凈化工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱（30-35C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、電冰箱、滅菌柜、紫外燈等。9.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋

26、玻片、薄膜過(guò)濾器等。9.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌銀子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、薄膜過(guò)濾膜等。9.2 試液、指示液PH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液、PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液9.3 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基等。9.4 操作方法9.4.1 增菌培養(yǎng)取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2瓶，每瓶各100m1,1瓶加入供試品10g或10ml）、，1瓶加入10ml 的稀釋液作陰性對(duì)照。30-350C培養(yǎng)18-24h。陰

27、性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。9.4.2 分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物1ml,接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時(shí)后，分 別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲 藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng) 18-24小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至40-48小時(shí)）。若平板上無(wú)菌 落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列特征，判供試品未檢出沙門菌。菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無(wú)色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無(wú)黑色沙門、志賀菌屬瓊脂無(wú)色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落麥康凱瓊脂無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心

28、后時(shí)為暗色第11頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-039.4.3 初步鑒別試驗(yàn)若平板上生長(zhǎng)的菌落與上表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選2-3個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18-24小時(shí)，如斜面未見紅色、底層未見黃色，斜面黃色、底層無(wú)黑色或斜面及底層均為紅色，判供試品 未檢出沙門菌。否則應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。10銅綠假單胞菌10.1 設(shè)備、儀器及用具10.1.1 設(shè)備微生物限度檢測(cè)室室、凈化工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱（30-350C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、電冰箱、滅菌柜、紫外燈等。10.1

29、.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過(guò)濾器等。10.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌銀子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、薄膜過(guò)濾膜等。10.2 試液、指示液PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液、PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液、1%!鹽酸二甲基對(duì) 苯二胺試液、三氯甲烷、1mol/L鹽酸試液、革蘭染色液、碘液、95叱醇。 10.3 培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基、澳化十六烷基三甲俊瓊脂培養(yǎng)基、PD晾脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等。10.4 操作方法10.4.1 增菌

30、培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL） 2瓶，每瓶各100ml, 1瓶加入供試液10ml（相當(dāng)于供試品 1g、1ml、10cm2）, 1瓶加入10ml的稀釋液作陰性對(duì)照。30-350C培養(yǎng)18-24h,必要時(shí)可 延至48h。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。10.4.2 分離培養(yǎng)第12頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03取上述培養(yǎng)物，劃線接種于澳化十六烷基三甲俊瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng) 18-24小 時(shí)。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無(wú)定形、邊緣不齊，表 面光滑濕潤(rùn)，呈灰白色，周邊略呈擴(kuò)散現(xiàn)象，在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周圍常有 水溶性藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散，使培養(yǎng)基顯藍(lán)綠色，但

31、亦有不產(chǎn)色素的菌株。如平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠 假單胞菌。10.4.3 純培養(yǎng)如平板生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2-3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18-24小時(shí)。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡 檢。10.4.4 革蘭染色鏡檢10.4.4.1 革蘭染色以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物 少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過(guò)火焰23次（載玻片不燙手）固定。滴加結(jié)晶 紫染液，染色1min,水洗,滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾紙吸干余水。滴加95叱醇，脫色 2030

32、s,水洗。滴加沙黃染液，復(fù)染1min,待干后，鏡檢。10.4.4.2 鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無(wú)芽抱桿菌，單個(gè)，成對(duì)或成短鏈排列。10.4.5 氧化酶試驗(yàn)取潔凈濾紙片置于平皿中，用無(wú)菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的 1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試 驗(yàn)陽(yáng)性，若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無(wú)芽抱桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均判供試品未檢出銅綠 假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。10.4.6 綠膿菌素試驗(yàn)取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于PD晾脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，加三氯甲烷3-5ml 至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并

33、充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol /Lit酸試液約1ml,振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)第13頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03性，否則為陰性。同時(shí)用未接種的 PD陳脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng) 呈陰性。10.5 若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，判供試品檢 出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性， 應(yīng)綣續(xù)進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。11 金黃色葡萄球菌11.1 設(shè)備、儀器及用具11.1.1 設(shè)備微生物限度檢測(cè)室室、凈

34、化工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱（30-350C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、電冰箱、滅菌柜、紫外燈等。11.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過(guò)濾器等。11.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌銀子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、薄膜過(guò)濾膜等。11.2 試液、指示液PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液、PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液、革蘭染色液、碘液、95叱醇。11.3 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培11.4 操作方

35、法11.4.1 增菌培養(yǎng)取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2瓶，每瓶各100m1,1瓶加入供試液10m1（相當(dāng)于供試品1g、1ml、 10cm）, 1瓶加入10ml的稀釋液作陰性對(duì)照。30-350C培養(yǎng)18-24h,必要時(shí)可延至48h。 陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。11.4.2 分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03第14頁(yè)共19頁(yè)板上，培養(yǎng)24-72小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于下表所列特征，判供試 品未檢出金黃色葡萄球菌。菌落形態(tài)甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑 0.7-1mm卵黃

36、氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳啄圈，菌落直徑1-2mm11.4.3 純培養(yǎng)若平板上生長(zhǎng)的菌落與表5所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選 2-3個(gè)菌落，分別接 種與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18-24小時(shí)。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、 鏡檢。11.4.4 革蘭染色鏡檢11.4.4.1 革蘭染色以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物 少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過(guò)火焰23次（載玻片不燙手）固定。滴加結(jié)晶 紫染液，染色1min,水洗,滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾紙吸干余水。滴加95叱醇，脫色 2030s,水洗。滴加

37、沙黃染液，復(fù)染1min,待干后，鏡檢。11.4.4.2 鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性球菌、無(wú)芽抱，一般不產(chǎn)生莢膜。排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈，單個(gè)，成對(duì)或成短鏈排列。11.4.5 若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出金黃色 葡萄球菌。12梭菌12.1 設(shè)備、儀器及用具12.1.1 設(shè)備微生物限度檢測(cè)室室、凈化工作臺(tái)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、電冰箱、滅菌柜、紫 外燈、厭氧培養(yǎng)箱等。12.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過(guò)濾器等。12.1.3 用具第15頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-

38、SOP-QC-004-03大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌銀子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、薄膜過(guò)濾膜等。12.2 試液、指示液PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液、PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液、3%t氧化氫試液、革 蘭染色液、碘液、95%S醇。12.3 培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、梭菌增菌培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（含慶大霉素20mg/L 和不含慶大霉素）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等。12.4 操作方法12.4.1 增菌培養(yǎng)取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml） 2份，其中1份置

39、80c保溫10分鐘后迅速冷卻。 上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下培養(yǎng) 48 小時(shí)。12.4.2 增菌培養(yǎng)取上述每一培養(yǎng)物0.2ml ,分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板 上，在厭氧條件下培養(yǎng)48-72小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出梭菌；若平板 上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選2-3個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過(guò)氧化酶試驗(yàn)。12.4.3 革蘭染色鏡檢取疑似菌落涂片，作革蘭染色、鏡檢，觀察染色及菌體特征。培養(yǎng)后形成的芽抱， 初呈“火柴頭”狀卵圓形，繼而膨大呈球形，在菌體末端如鼓槌狀。染色鏡檢有卵圓形至 球形的芽抱，大于菌體，著生于菌體中央、次端

40、或頂端。12.4.4 過(guò)氧化酶試驗(yàn)加一滴3%氧化氫溶液至瓊脂表面的單個(gè)分散的菌落，或轉(zhuǎn)移至載玻片上的菌落上。 有氣泡產(chǎn)生，為過(guò)氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，梭菌成陰性結(jié)果。12.5 結(jié)果判斷若上述可疑菌落為革蘭陽(yáng)性梭菌，有或無(wú)卵圓形或球形的芽抱，過(guò)氧化酶試驗(yàn)陰性， 判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。13 白色念珠菌文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03第16頁(yè)共19頁(yè)13.1 設(shè)備、儀器及用具13.1.1 設(shè)備微生物限度檢測(cè)室室、凈化工作臺(tái)、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、電冰箱、滅菌柜、紫外燈、生化培養(yǎng)箱（30-350C）等。13.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試

41、管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過(guò)濾器等。13.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌銀子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、薄膜過(guò)濾膜等。13.2 試液、指示液PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液、PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液、革蘭染色液、碘液、95叱醇。13.3 培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、念珠菌顯色培養(yǎng)基、1名聚山梨酯80-玉米粉瓊脂培養(yǎng)基等。13.4 操作方法13.4.1 增菌培養(yǎng)取供試液10m 1（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm）直接或處理后接種至適量（不少于100ml） 的沙氏葡

42、萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4872小時(shí)。13.4.2 增菌培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑 有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色 念珠菌。如平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng) 2448小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。若平板上無(wú)綠第17頁(yè)共19頁(yè)文件編碼：DK/CD-SOP-QC-004-03色或翠綠色

43、的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。13.4.3 確認(rèn)試驗(yàn)若平板上生長(zhǎng)的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于19缸溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時(shí)。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗(yàn)。芽管試驗(yàn) 挑取1%溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻 片上，蓋上蓋玻片，置濕潤(rùn)的平皿內(nèi)，置 3537C、13小時(shí)，置顯微鏡下觀察，可見 到由抱子長(zhǎng)出短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性菌，顯微鏡未見厚膜抱子、假菌絲、芽管，判供試品未 檢出白色念珠菌。結(jié)果判定供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)從同 一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以 3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時(shí)，須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌，方可判供試品的 霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種