研究生基本實驗技能培訓 ppt課件

1、研討生科研實驗教學基地建立研討生科研實驗教學基地建立根本實驗技藝培訓根本實驗技藝培訓首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院根底醫(yī)學研討中心根底醫(yī)學研討中心 梁燕梁燕85231624, liangyan1990shou主要內(nèi)容1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作本卷須知2.PCRPCR體系和循環(huán)條件PCR操作步驟操作本卷須知3.瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳原理電泳方法步驟操作本卷須知1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作本卷須知既要將既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分別，與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分別，又要堅持又要堅持DNA分子的完好。分子的完好。 儀器預備：儀器

2、預備： 臺式離心機、恒溫水浴鍋、紫外分光光臺式離心機、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、移液器、離心管滅菌、吸頭度計、移液器、離心管滅菌、吸頭滅菌、鑷子滅菌、離心管架滅菌、鑷子滅菌、離心管架試劑預備：試劑預備： 試劑盒、無水乙醇等試劑盒、無水乙醇等試劑盒內(nèi)容試劑盒內(nèi)容操作步驟重點操作步驟重點向52ml的緩沖液GD中參與68ml無水乙醇，并標志；向50ml的緩沖液PW中參與200ml無水乙醇，并標志；取200ul全血，參與20ul的蛋白酶K溶液，混勻；參與200ul緩沖液GB，充分顛倒混勻，56放置10分鐘，期間顛倒混勻數(shù)次，溶液應變清亮。參與200ul無水乙醇，充分顛倒混勻，此時能夠會出現(xiàn)絮狀沉淀。

3、將吸附柱CB3放入搜集管中預備好，將上述溶液移到吸附柱CB3中，12000rpm離心30秒，倒掉搜集管中的廢液，將吸附柱放回搜集管；假設步驟5的溶液不能一次加完，可以再次反復步驟6；向吸附柱中加500ul的緩沖液GD， 12000rpm離心30秒，倒掉搜集管中的廢液，將吸附柱放回搜集管；操作步驟重點操作步驟重點7. 向吸附柱中參與700ul漂洗液PW， 12000rpm離心30秒，倒掉搜集管中的廢液，將吸附柱放回搜集管；向吸附柱中參與500ul漂洗液PW， 12000rpm離心30秒，倒掉搜集管中的廢液，將吸附柱放回搜集管；將吸附柱和搜集管再次離心， 12000rpm離心2分鐘，將吸附柱至于室

4、溫放置數(shù)分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200ul洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5分鐘， 12000rpm離心2分鐘，將溶液搜集到離心管中；測OD值，計算DNA濃度和純度；或電泳估計DNA濃度。計算公式：OD260/OD280=1.7-1.9DNA濃度(ug/ul)=OD26050稀釋倍數(shù)/1000OD260=0.1稀釋倍數(shù)=250DNA濃度=0.150 250/1000=1.25 ug/ul操作本卷須知操作本卷須知防止樣品反復凍融防止樣品反復凍融56水浴搖勻可消除水浴搖勻可消除GB中的沉淀中的沉淀運用臺式離心機，室溫離心運用臺式離心機，室溫離心2.PCRPC

5、R體系和循環(huán)條件PCR操作步驟操作本卷須知儀器預備：儀器預備： PCRPCR儀，微型離心機、移液器、離心管儀，微型離心機、移液器、離心管滅菌、吸頭滅菌、鑷子滅滅菌、吸頭滅菌、鑷子滅菌、離心管架菌、離心管架試劑預備：試劑預備： ddH2O, PCR BufferddH2O, PCR Buffer，dNTPdNTP，引物，引物，PCRPCR聚合酶，聚合酶，DNADNA模板模板BclI PCRTotal volume25ul*2ddH2O16.5ul33ul10Buffer 2.5ul5uldNTP (25mM)2ul4ulPrimer F (10mM)1ul2ulPrimer R (10mM)1u

6、l2ulEx Taq (1U/ul)1ul2ulSum24ul48ul48/2=24ulTemplate DNA（0.1ug/ul)1ul1ul60 ，30s72 ，30s95，30s95，30s 預變性預變性72 ，30s 后延伸后延伸30cycles 計算好所需擴增的計算好所需擴增的PCR體系；體系； 翻開翻開PCR儀預熱，設置儀預熱，設置PCR循環(huán)條件；循環(huán)條件； 預備試劑，融化，離心，置于冰上，備用；預備試劑，融化，離心，置于冰上，備用； 按順序加樣，混勻，離心，分裝；按順序加樣，混勻，離心，分裝； 參與模板參與模板DNA，混勻，離心；，混勻，離心； 放入放入PCR儀，儀，Start。

7、防止試劑反復凍融防止試劑反復凍融計算總量，順序加樣計算總量，順序加樣改換吸頭，防止污染改換吸頭，防止污染3.瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳原理電泳方法步驟操作本卷須知DNADNA分子帶負電荷，在直流電場中由負極移向正極；分子帶負電荷，在直流電場中由負極移向正極；其挪動速度與線性其挪動速度與線性DNADNA片段長度成反比。片段長度成反比。 配置配置1%1%的膠：稱的膠：稱1g1g瓊脂糖于適當大小三角瓶中，倒入瓊脂糖于適當大小三角瓶中，倒入100ml100ml的的1 1* *TAETAE，微波爐加熱至完全融化；，微波爐加熱至完全融化； 待凝膠溫度降至待凝膠溫度降至50-6050-60度時，參與度時，參與1

8、ul1ul的的EBEB10mg/ml)10mg/ml)，搖勻，將膠倒入放好梳子的電泳板中，自然冷卻搖勻，將膠倒入放好梳子的電泳板中，自然冷卻30-6030-60分鐘；分鐘； 悄然拔掉梳子，將膠放入電泳槽中，倒入悄然拔掉梳子，將膠放入電泳槽中，倒入1 1* *TAETAE，沒過，沒過加樣孔；加樣孔； 按照按照1ul1ul上樣上樣Buffer+5ulBuffer+5ul的的DNADNA混合后，點樣；每排留混合后，點樣；每排留一個孔加一個孔加DNA markerDNA marker； 100V100V電泳電泳3030分鐘，凝膠成像儀照相。分鐘，凝膠成像儀照相。帶手套操作帶手套操作EB凝膠冷卻時間至少凝膠冷卻時間至少30分鐘分鐘凝膠完全融化凝膠完全融化M II-3 II-2 II-1 I-2 I-1 0運用運用BclI/RFLP BclI/RFLP 多態(tài)位點進展基因連鎖分析多態(tài)位點進展基因連鎖分析374211163小小 結(jié)結(jié)1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作本卷須知2.PCRPC