hVEGF165在兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)

1、hVEGF165在兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá) 作者：王賓 沈來根朱越鋒 李魯濱 郭治宇 劉振杰【摘要】 目的 培養(yǎng)和鑒定兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,基因轉(zhuǎn)染后觀察hVEGF165在其中的表達(dá)。 方法 體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,以流式細(xì)胞儀檢測其表面抗原(CD29、CD44、CD45、HLA-DR)的表達(dá)。通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染hVEGF165后,采用RT-PCR、Western blot法檢測hVEGF165在細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果 通過流式細(xì)胞儀檢測表明培養(yǎng)的細(xì)胞為兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞, RT-PCR法、Western blot法檢測結(jié)果均表明hVEGF165基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后能在其中表達(dá)。 結(jié)

2、論 成功培養(yǎng)兔體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞, 基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞能有效表達(dá)hVEGF165。 【關(guān)鍵詞】 目的 培養(yǎng)和鑒定兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,基因轉(zhuǎn)染后觀察hVEGF165在其中的表達(dá)。 方法 體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,以流式細(xì)胞儀檢測其表面抗原(CD29、CD44、CD45、HLA-DR)的表達(dá)。通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染hVEGF165后,采用RT-PCR、Western blot法檢測hVEGF165在細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果 通過流式細(xì)胞儀檢測表明培養(yǎng)的細(xì)胞為兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞, RT-PCR法、Western blot法檢測結(jié)果均表明hVEGF165基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后能在其中表達(dá)。 結(jié)論 成功培

3、養(yǎng)兔體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞, 基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞能有效表達(dá)hVEGF165?！続bstract】 Objective To cultivate and accredit rabbit mesenchymal stem cells ,and to detect the expression of hVEGF165 after gene transfection. Methods Rabbit mesenchymal stem cells was accredited expression of antigen CD29、CD44、CD45、HLA-DR after cultivated in vitr

4、o. The constructed plasmids containing right sequence of hVEGF165 were transfected into rabbit mesenchymal stem cells by adenovirus.The expression of hVEGF165 was tested by RT-PCR and western-blot. Results The expression of antigen of cells indicated the cells were rabbit mesenchymal stem cells. The

5、 results of RT-PCR and western-blot showed that the transfected cells could express hVEGF165. Conclusion The rabbit mesenchymal stem cells can successfully express hVEGF165 after gene transfection.【Key words】 mesenchymal stem cells vascular endothelial growth factor ( VEGF) gene transfection, expres

6、sion 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，可分化成多種間質(zhì)細(xì)胞，如成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，也可分化成神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和脈管系統(tǒng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,成為近年來基因組織工程研究的熱點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 是一種高特異性的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原, 能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖, 形成新血管。本研究通過體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將VEGF基因?qū)爰?xì)胞, 觀察其在細(xì)胞中的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上可將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與VEGF結(jié)合植入缺血區(qū), 通過MSCs與VEGF的雙重作用, 來促進(jìn)局部血管增生,治

7、療慢性缺血性疾病。1 材料與方法1.1 材料 (1)細(xì)胞和腺病毒:兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自行培養(yǎng)和鑒定,含hVEGF165的非擴(kuò)增型腺病毒和含GFP的非擴(kuò)增型腺病毒購自上海生物基因科技發(fā)展有限公司。(2)主要試劑：DMEM培養(yǎng)液和淋巴細(xì)胞分離液購于上海生物有限公司；胰酶購自杭州公司; TRIZOL購自Sigma公司;mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）購于Promega公司；蛋白裂解液購自Satancruz公司;羊抗人hVEGF165單克隆抗體購于Sigma公司;兔抗山羊二抗購于北京公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自聯(lián)科生物公司;RPhycoerythrin（R-PE）標(biāo)記的鼠抗人HLA-DR的單克隆抗體購于

8、BDBioscience公司,可跟兔交叉反應(yīng);鼠抗兔CD44、CD45單克隆抗體購于Serotec公司，鼠抗人CD29單克隆抗體購于Chemicon公司,可跟兔CD29交叉反應(yīng)。(3)RT-PCR引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GeneBank中登錄的目的基因序列,以引物設(shè)計(jì)軟件Primer Express2.0輔助自行設(shè)計(jì)引物, 上游引物5-TCT GCT GTC TTG GGT GCA TTG-3 下游引物5-ATG GCA GTA GCT GCG CTG ATA G-3,目的片斷為150bp,引物由上海公司合成。1.2 方法 (1)MSCs分離與培養(yǎng)：無菌操作從兔脛骨抽取骨髓3ml，與等體積DMEM

9、培養(yǎng)液（含16胎牛血清）混合后，鋪于6ml的淋巴細(xì)胞分離液之上，離心（2500r/min）25min，取中層單個(gè)核細(xì)胞，置于含DMEM液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在溫度37，含5CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后首次換液，以后每5d換液一次。經(jīng)不斷增殖培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)達(dá)107用于鑒定或轉(zhuǎn)染。(2)MSCs的鑒定：取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，自第3代至第6代，采用流式細(xì)胞儀對MSCs表面抗原CD29、CD44、CD45、HLA-DR的表達(dá)進(jìn)行檢測。抗體分別是R-PE標(biāo)記的鼠抗人B細(xì)胞HLA-DR的單克隆抗體、鼠抗兔T細(xì)胞CD44、CD45單克隆抗體、鼠抗人CD29單克隆抗體。后三種一抗均與Rhodamine標(biāo)記

10、的山羊抗鼠二抗結(jié)合后流式細(xì)胞儀檢測。(3)VEGF轉(zhuǎn)染MSCs：MSCs培養(yǎng)至107后，向培養(yǎng)瓶中加入含hVEGF165的非擴(kuò)增型腺病毒，共同培養(yǎng)48h后以胰酶消化制成單細(xì)胞懸液供移植用。同時(shí)取部分細(xì)胞在相同條件下加入含GFP的非擴(kuò)增型腺病毒，48h后在熒光顯微鏡下測定其轉(zhuǎn)染率。(4)總RNA 的提取及RT-PCR 擴(kuò)增: 轉(zhuǎn)染后得到的表達(dá)hVEGF165的MSCs,同時(shí)設(shè)hVEGF165質(zhì)粒為陽性對照,轉(zhuǎn)GFP的MSCs為陰性對照,用TRIZOL常規(guī)提取總RNA ,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 進(jìn)行PCR 反應(yīng)。采用高保真Taq NA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為95預(yù)變性5min,94變性30s

11、,56退火30s,72延伸30s,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán), 最后72延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,鑒定目的片段的表達(dá)。(5)Western-blot鑒定目的蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染后得到的表達(dá)hVEGF165的MSCs,同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)GFP的MSCs為對照。常規(guī)方法提取細(xì)胞全蛋白,取50g蛋白,與2SampleBuffer11混勻后煮沸10min,10%SDS2聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳,然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore,孔徑0.45m,USA),用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2 h,加羊抗人VEGF抗體(1500)4反應(yīng)過夜,然后與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG(15000) 室溫反應(yīng)2h

12、,每步反應(yīng)結(jié)束均用含0.05% Tween-20的TBS洗滌3次,每次10min,最后用ECL液顯色,X片曝光。2 結(jié)果2.1 原代MSCs 24h后即出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，以后細(xì)胞呈克隆樣生長。經(jīng)傳代后細(xì)胞生長加快，呈現(xiàn)梭形形態(tài)（圖1）。2.2 MSCs的鑒定 各抗原表達(dá)如下(表1,圖2)表1 MSCs表面抗原CD29、CD44、CD45、HLA-DR表達(dá)略2.3 VEGF轉(zhuǎn)染MSCs 轉(zhuǎn)染hVEGF165及GFP后未見細(xì)胞死亡，48h后在熒光顯微鏡下可見強(qiáng)熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染率近100%（圖3）。 2.4 RT-PCR檢測結(jié)果 hVEGF165質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染hVEGF165的MSCs的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可

13、見目的基因條帶(圖4),而轉(zhuǎn)染GFP的MSCs擴(kuò)增未見條帶。 2.5 Western blot結(jié)果 轉(zhuǎn)染hVEGF165的MSCs提取的蛋白,分別在23kD處有一條明顯陽性雜交帶, 而轉(zhuǎn)染GFP的MSCs提取蛋白未見陽性條帶(圖5),這表明轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白。 圖3 48h后熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染攜帶GFP的非擴(kuò)增型腺病毒的干細(xì)胞；略 圖4 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖(略) 圖5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞提取蛋白Western blot結(jié)果(略) 3 討論干細(xì)胞移植，在基礎(chǔ)領(lǐng)域和臨床研究中均取得了一系列成果，其中多以造血干細(xì)胞為研究對象。而MSCs在體外可以通過貼壁培養(yǎng)加以分離，分裂增殖能力強(qiáng)。由于

14、存在骨髓中，采集方便，對機(jī)體損傷小?？梢韵蚨喾N結(jié)締組織細(xì)胞分化，并易于被外源基因轉(zhuǎn)染且穩(wěn)定表達(dá)，因此被認(rèn)為是組織工程、細(xì)胞及基因治療理想的靶細(xì)胞。MSCs具有特征性的表面標(biāo)志。特點(diǎn)是不表達(dá)CD34（造血干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞呈陽性）、CD45（白細(xì)胞呈陽性）、HLA-DR（抗原呈遞細(xì)胞及成纖維細(xì)胞呈陽性）；而表達(dá)CD29、CD44、CD105、CD166等MSCs特異性表面抗原標(biāo)記。 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示所培養(yǎng)細(xì)胞的表面抗原CD29、CD44有陽性表達(dá)，而CD45、 HLA-DR是陰性表達(dá)。說明所培養(yǎng)的細(xì)胞不是骨髓中的另1大類細(xì)胞-造血干細(xì)胞，而是骨髓的間充質(zhì)細(xì)胞。VEGF是一種特異性的與血管生長

15、有關(guān)的生長因子，在缺血等病理?xiàng)l件下VEGF及其受體表達(dá)明顯上調(diào)，參與血管再生機(jī)制及側(cè)支循環(huán)的形成。其主要生物學(xué)效應(yīng)是與內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合, 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生分裂和增殖,尤其VEGF165的促血管作用最明顯。目前研究多采用VEGF基因或VEGF構(gòu)建的質(zhì)粒/缺陷腺病毒直接注射的方法，但存在表達(dá)時(shí)間短，局部水腫的問題。而采用VEGF轉(zhuǎn)染MSCs，再進(jìn)行細(xì)胞移植，有可能使MSCs持續(xù)表達(dá)VEGF，增加VEGF的表達(dá)。 今后擬將MSCs與VEGF相結(jié)合,在局部組織缺血時(shí)通過自分泌和旁分泌途徑, 提供足量的促進(jìn)血管生長的生長因子, 以促進(jìn)其自身及內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化及血管的形成, 為基因生物工程

16、治療缺血性疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】 1 Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J Mol Med,1999,77 (7):527543.2 虞榮喜. 造血干細(xì)胞移植治療惡性淋巴瘤的進(jìn)展. 浙江臨床醫(yī)學(xué)，2004，6（9）：737.3 Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et a1Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchyma

17、l stem cells(MSCs) and stromal cellsJ Cel Physiol，1998，176：57664 Brogi E,Schaheman G,Wu TG,et al.Hypoxin-induced paracrine regulation by vescular endothelial growth factor expression.J Clin Invest,1996，97:469476.5 DENG Zhi-hong, HUANG Wei-guo,JIN Yan.Expression of VEGF and Flk-1 in normal and chronic in