NF－κB活化及WT1MDR1的表達(dá)在急性非淋巴細(xì)胞白血病中的臨床意義

1、NFB活化及WT1、MDR1的表達(dá)在急性非淋巴細(xì)胞白血病中的臨床意義【摘要】 本研究通過(guò)觀察初治與難治急性非淋巴細(xì)胞白血病中NFB活性及WT1、MDR1的表達(dá)水平，探討三者在急性非淋巴細(xì)胞白血病療效中的作用與相互關(guān)系，為尋找新的改善難治急性非淋巴細(xì)胞白血病療效的方法提供理論依據(jù)。急性非淋巴性白血病患者45例，其中初治組20例（A組），難治組25例（分為B、C兩組）。以15例單純?nèi)辫F性貧血患者作為對(duì)照組。采用凝膠電泳遷移分析（EMSA）法檢測(cè)各組病人NFB的活化水平，用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）法檢測(cè)各組病人WT1及MDR1的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組未檢測(cè)到NFB活化及WT1和 MD

2、R1表達(dá)；在初治組中NFB的活化水平、WT1和 MDR1表達(dá)水平均明顯低于難治組，而在難治B、C兩組中三者無(wú)明顯區(qū)別；各組病人細(xì)胞中NFB活化水平與WT1及MDR1的表達(dá)水平呈正相關(guān)。結(jié)論：NFB的活化，WT1、MDR1的高表達(dá)可能是急性非淋巴細(xì)胞白血病難治的原因之一，急性非淋巴細(xì)胞白血病中NFB的活化水平與WT1、MDR1的表達(dá)呈正相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 NFB；WT1；MDR1；急性非淋巴細(xì)胞白血病Clinical Significance of NFB Continual Activity and Expression of WT1 and MDR1 in Acute Nonlymphocy

3、tic Leukemia Abstract The study was aimed to explore the NFB continual activity and the expression of WT1 and MDR1 in acute nonlymphocytic leukemia(ANLL) patients, and to investigate if the three factors affect the curative effect of ANLL together as to provide some theoretical basis for finding new

4、 measures to improve the curative effect of refractory ANLL. The bone marrow samples of 45 ANLL patients was collected. 45 patients including 20 primary ANLL patients (A group) and 25 refractory ANLL patients. Refractory ANLL patients were divided into 2 subgroups (B, C groups). The primary patients

5、 who was no effect after more than two courses of treatment were taken as group B, and the patients with more than two relapses were taken as group C. At the same time , 15 patients with simple iron deficiency anemia were collected as negative control. The NFB continual activity was measured by usin

6、g electrophoretic mobility shift assay（EMSA） and the expressions of WT1, MDR1 were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR). The results showed that the activity of NFB and the expressions of WT1, MDR1 were not detected in 15 samples of simply iron deficiency anemia subjec

7、ts. The NFB continual activity ,the expression levels of WT1 and MDR1 in the refractory group were significantly higher than that in primary group（P<0.001）. But the NFB continual activity, the expression of WT1 gene and MDR1 gene were not significantly different between group B and group C (P

8、>0.05). By assaying the relativity between the them the NFB continual activity and the expression of WT1 or MDR1 had positive correlation in ANLL patients. It is concluded that the NFB continual activity, the overexpression of WT1 and MDR1 may be one of the reasons causing poor curative effec

9、t in acute nonlymphocytic leukemia. The NFB continual activity and the expression of WT1, MDR1, all show positive correlation in ANLL patients. Key words NFB；WT1；MDR1； acute nonlymphocytic leukemia 近些年NFB在許多領(lǐng)域受到關(guān)注。研究提示，NFB的異常表達(dá)與白血病有一定的相關(guān)性，并認(rèn)為NFB激活是促成白血病細(xì)胞存活的一個(gè)重要因素1。在WT1、 MDR1基因啟動(dòng)子內(nèi)均含有NFB結(jié)合位點(diǎn)，因而WT1、M

10、DR1基因有可能成為NFB的下游靶基因。本研究觀察急性非淋巴細(xì)胞白血病中NFB的活化水平及WT1、MDR1的表達(dá)水平； 研究NFB的活化與WT1和MDR1在急性非淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)水平是否相平行，旨在探索NFB與WT1及NFB與MDR1之間的關(guān)系，以明確難治急性非淋巴細(xì)胞白血病療效欠佳是否因?yàn)镹FB活化與WT1及MDR1高表達(dá)所致，從而為尋找新的改善難治急性非淋巴細(xì)胞白血病患者療效的方法提供理論依據(jù)。 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 J Exp Hematol 2007; 15(2)NFB活化及WT1、MDR1的表達(dá)在急性非淋巴細(xì)胞白血病中的臨床意義材料和方法 研究對(duì)象 急性非淋巴性白血病患者45例，

11、其中初治組20例，難治組25例。對(duì)照組15例，均為單純?nèi)辫F性貧血患者。所有骨髓標(biāo)本均來(lái)源2004年6-12月湘雅醫(yī)院門(mén)診和住院的患者。 診斷及納入標(biāo)準(zhǔn) 初次確診均根據(jù)臨床表現(xiàn)、外周血涂片、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、細(xì)胞組織化學(xué)染色等綜合指標(biāo)，并參照FAB診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診。經(jīng)1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)療程化療后部分或完全緩解的初治病人納入初治組（A組）；2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)療程化療無(wú)效的初治者，納入難治B組；2次復(fù)發(fā)者納入難治C組。單純?nèi)辫F性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)張之南主編的血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)2。難治的判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)鄧家棟主編的臨床血液學(xué)3。 試劑 EMSA試劑 BCA蛋白定量試劑盒為碧云天公司出品，EMSA試劑盒為pierce公司產(chǎn)

12、品，lot number:20148。 RTPCR相關(guān)試劑 焦碳酸二乙脂（DEPC）、人淋巴細(xì)胞分離液（比重1.007±0.02）均為北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TRIzoL、 RevertAidTM First Strand cDNA Systhesis Kit、GeneRulerTM 100 bp DNA ladder為Fermentas公司原裝；TaqDNA聚合酶為 Promega公司原裝；瓊脂糖產(chǎn)自西班牙，分裝；無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇由湘雅藥劑科提供，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離 無(wú)菌操作取骨髓8 ml，肝素（50 U/ml）抗凝，用等體積PBS液稀釋混勻，

13、緩慢加入等體積人淋巴細(xì)胞分離液，2 000rpm, 離心15分鐘，取界面層骨髓單個(gè)核細(xì)胞（MNC），用PBS液洗滌2次，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)拒染率大于99。于同一標(biāo)本中，取約2×107個(gè)細(xì)胞，-70凍存，用于提取核蛋白；另取約3×106個(gè)細(xì)胞，加TRIzoL試劑1 ml，充分混勻之后，-20凍存，用于提取RNA。 NFB活化檢測(cè) 應(yīng)用EMSA方法進(jìn)行NFB活化檢測(cè)4，主要步驟包括：核蛋白抽提和濃度測(cè)定；雙鏈寡核甘酸探針制備：設(shè)計(jì)NFB特異結(jié)合探針， sense：5AGT TGAGGGGACTTTCCCAGGC3；antisonse：3TCA ACTCCCCTGAAAGGG

14、TCCG5；生物素進(jìn)行5端標(biāo)記（上海博亞）；DNA結(jié)合蛋白的凝膠電泳遷移測(cè)定（gel shift assay）。DNA/蛋白結(jié)合反應(yīng)：依次加入核蛋白5 g,加水至20 l,室溫下放置20分鐘,加12p探針2 l,室溫下放置30分鐘；上樣,電泳（電壓120 V）， 1小時(shí),轉(zhuǎn)膜（100 V） 45秒，紫外交聯(lián)10秒；生物素自顯影；在圖像分析處理系統(tǒng)上分析蛋白結(jié)合性（灰度面積值）。 WT1，MDR1表達(dá)水平檢測(cè) 用RTPCR方法進(jìn)行WT1，MDR1表達(dá)水平檢測(cè)。主要步驟包括：細(xì)胞總RNA的提??；PCR引物設(shè)計(jì)5-7：分別設(shè)計(jì)WT1、MDR1、actin引物序列。WT1：上游引物：5GGCATCTG

15、AGACCAGT GAGAA3， 下游引物：5GACACTCAGACTTGAA AGCAGT3， 擴(kuò)增產(chǎn)物片段481 bp；MDR1：上游引物：5 CCCATCATTGCAATAGCAGG3 ， 下游引物：5GTTCAAACTTCTGCTCCTCA3 ，擴(kuò)增產(chǎn)物片段157 bp；actin：上游引物：5CGCTGCGCT GGTCGTCGACA3， 下游引物: 5GTCACGCAC GATTTCCCGCT3，擴(kuò)增產(chǎn)物片段619 bp；cDNA的合成；PCR擴(kuò)增：條件如下，WT1：94預(yù)變性5分鐘，94變性1分鐘，51退火60秒，72延伸90秒，35個(gè)循環(huán)，72延伸10分鐘。MDR1：94預(yù)變性

16、5分鐘，94變性30秒，55退火60秒，72延伸70秒，27個(gè)循環(huán)，72延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物分析：PCR產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳條帶，Tanon GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描并讀取光密度值，將WT1或MDR1與actin的光密度比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)量。各標(biāo)本重復(fù)2次，取平均值。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson分析法。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以P<0.05為差異有顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié) 果 急性非淋巴細(xì)胞白血病中N

17、FB的活化水平及WT1、MDR1基因的表達(dá)水平 NFB在急性非淋巴細(xì)胞白血病中的活化水平 用EMSA法檢測(cè)各標(biāo)本內(nèi)NFB的活化水平，其中較為典型標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，電泳速度最快的為濃黑的標(biāo)記探針自由帶,標(biāo)記探針與核蛋白結(jié)合后,出現(xiàn)深淺不一的DNA/蛋白質(zhì)(NFB)結(jié)合帶。結(jié)合帶著色越深、灰色面積越大,則NFB的活性越高。特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合帶(NFB帶)消失,表明該探針與核蛋白的結(jié)合是特異的。在對(duì)照組未見(jiàn)DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合帶；難治組與初治組比較，前者DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合帶的著色及灰色面積，明顯比后者深且寬（圖1,表1）。 急性非淋巴細(xì)胞白血病WT1,MDR1基因表達(dá) 檢測(cè)結(jié)果顯示

18、：在對(duì)照組未檢測(cè)到WT1,MDR1;初治組及難治組的WT1,MDR1表達(dá)水平明顯增高，且在難治組明顯高于初治組。而難治B、C兩組間無(wú)明顯差別（表2）。各組病例中較為典型標(biāo)本電泳見(jiàn)圖2，3。由圖2、3可見(jiàn)兩者也無(wú)明顯不同。 討 論 NFB作為眾多基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子,通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用,在轉(zhuǎn)錄水平上形成復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),產(chǎn)生抗凋亡、促增殖、促轉(zhuǎn)移的作用。它是由Rel蛋白家族中的成員以同源或異源二聚體形式組成的一組轉(zhuǎn)錄因子，一般非激活狀態(tài)下NFB與IkB結(jié)合存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到外界因素刺激后，IkB磷酸化并迅速降解，NFB被釋放、激活。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),多種致癌因素和臨床上應(yīng)用的多種細(xì)

19、胞因子和化療藥物，可以激活NFB,激活的NFB進(jìn)入胞核內(nèi)與相應(yīng)的kB位點(diǎn)相結(jié)合，激活特異靶基因的轉(zhuǎn)錄。 WT1基因最早發(fā)現(xiàn)與Wilms瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。它具有抑制腫瘤和激活基因轉(zhuǎn)錄的雙重功能，在白血病和各種實(shí)體瘤中，它主要發(fā)揮致癌基因作用8。人的WT1啟動(dòng)子內(nèi)含有NFB結(jié)合位點(diǎn)，因而WT1有可能成為NFB的下游靶基因之一。激活的NFB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)可以與WT1啟動(dòng)子內(nèi)的NFB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而調(diào)控WT1的轉(zhuǎn)錄1。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：在對(duì)照組中未檢測(cè)到NFB 和WT1；初治組及難治組患者NFB活化，WT1表達(dá)明顯升高；難治組中兩者顯著高于初治組，說(shuō)明NFB 和WT1與急性非淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病及療效有關(guān)

20、，提示NFB活化水平及WT1的表達(dá)水平愈高，急性非淋巴細(xì)胞白血病的預(yù)后愈差 。而且NFB的活化可能導(dǎo)致了WT1轉(zhuǎn)錄水平增高，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到各組病人NFB的活化水平與WT1的表達(dá)呈正相關(guān)也可解釋這一點(diǎn)，這說(shuō)明在急性非淋巴細(xì)胞白血病中NFB 的活化水平與WT1的表達(dá)水平是相平行的。 難治性急性白血病療效差多因化療耐藥或殘留白血病所致。腫瘤耐藥存在很多機(jī)制，凋亡受阻是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一，而NFB在腫瘤中的抗凋亡作用已被大量試驗(yàn)所證實(shí)9?；熕幬镌跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，激活了NFB。Bentires等10證實(shí)，多藥耐藥基因(MDR1)啟動(dòng)區(qū)域的第1外顯子包含1個(gè)純化的NFB結(jié)合序列，所以

21、激活狀態(tài)的NFB與MDR1中的NFB結(jié)合序列結(jié)合促進(jìn)MDR1轉(zhuǎn)錄。而MDR1編碼pgp表達(dá)，可以通過(guò)自身膜蛋白泵作用外排多種化療藥物，減少腫瘤藥物的吸收而導(dǎo)致耐藥11。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，15例對(duì)照組病人均未檢測(cè)到NFB及MDR1。20例初治患者中僅2例MDR1表達(dá)陽(yáng)性，13例NFB活化，且活化水平明顯高于對(duì)照組。初治患者中MDR1的表達(dá)說(shuō)明，MDR1過(guò)度表達(dá)并不完全依賴(lài)于化療藥物的長(zhǎng)期誘導(dǎo)，可能與白血病的遺傳異質(zhì)性有關(guān)，提示ANLL存在內(nèi)在耐藥，這一部分病人往往化療效果較差。難治組中NFB的活化水平與MDR1表達(dá)水平明顯增高，究其原因可能是：難治組患者本身致癌因素作用較初治組強(qiáng)，加之化療藥物的作用

22、，大量NFB被激活；激活狀態(tài)的NFB可與MDR1啟動(dòng)區(qū)域NFB的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控MDR1的轉(zhuǎn)錄，使MDR1的表達(dá)增高；化療藥物本身誘發(fā)了多藥耐藥，致使MDR1表達(dá)增高。激活狀態(tài)的NFB可使白血病細(xì)胞凋亡受阻，而MDR1高表達(dá)導(dǎo)致難治急性非淋巴細(xì)胞白血病耐藥。本研究中難治組患者一部分是經(jīng)2次標(biāo)準(zhǔn)療程化療未緩解的初治者，另一部分是緩解后2次復(fù)發(fā)者。兩者中NFB的活化水平與MDR1的表達(dá)水平無(wú)明顯區(qū)別，提示原發(fā)耐藥與繼發(fā)耐藥患者中NFB活化水平及MDR1表達(dá)水平無(wú)明顯差異。 本研究觀察到NFB的活性水平與WT1及MDR1表達(dá)水平在急性非淋巴細(xì)胞白血病中呈正相關(guān)，但NFB的活化是否直接促進(jìn)了WT1及

23、MDR1的高表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。但有這種可能，即在急性非淋巴細(xì)胞白血病中NFB的活化促進(jìn)了WT1和MDR1的表達(dá)，從而對(duì)白血病細(xì)胞起了一定的抗凋亡、促增殖作用，并且致腫瘤細(xì)胞耐藥，而使白血病的難治。因此，NFB活化水平增高很可能是導(dǎo)致急性非淋巴細(xì)胞白血病難治的一個(gè)主要原因，故推想應(yīng)用NFB抑制劑可能會(huì)減少WT1及MDR1的表達(dá)，從而促進(jìn)白血病細(xì)胞的分化，并增敏化療藥物的抗腫瘤作用，提高化療療效。眾多實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證，應(yīng)用抗氧化劑如乙酰半胱氨酸(NAC),或?qū)FB的反義核苷酸、含B順式結(jié)合序列的引誘物(decoy)導(dǎo)入白血病干細(xì)胞,均可抑制NFB的活化,增進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療、化療的敏感性,促進(jìn)瘤細(xì)胞

24、的凋亡12。這提示臨床治療中可以考慮在化療的同時(shí)加用NFB抑制劑?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1段衛(wèi)明，陳子興.WT1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路與白血病.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2002;10：366-3702張之南主編.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn).第二版.北京:科學(xué)出版社，1998:10-153鄧家棟主編.臨床血液學(xué).上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2001:9884EISabban ME, Nasr R, Dbaibo G, et al. Arsenicinterferontrigge red apoptosis in HTLVtransformed cells is associated with tax down regu

25、lation and reversal of NFB activation. Blood, 2000; 96:2849-28555Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood, 1994; 84: 3071-30796OBrien M, Kruh GD, Tew KD. The influence of coordinate overexpression of glutathione phase detoxification gene products on drug