人源肝癌單鏈抗體scFv基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)

1、人源肝癌單鏈抗體（scFv）基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)【摘要】 目的: 構(gòu)建人源肝癌單鏈抗體（scFv）基因真核表達(dá)載體pSectag2/scFv并在中國倉鼠卵巢（CHO)細(xì)胞中獲得表達(dá)。方法: 利用噬菌體細(xì)胞內(nèi)重組技術(shù)篩選得到了肝癌特異性scFv, 用PCR技術(shù)及核酸內(nèi)切酶技術(shù)將其克隆入真核表達(dá)載體pSectag2, 構(gòu)建重組載體pSectag2/scFv, 測序鑒定后, 電轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞, 利用SDSPAGE和Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果: 將750 bp人源肝癌scFv插入真核表達(dá)載體pSectag2, 經(jīng)DNA測序鑒定正確, 成功構(gòu)建了pSectag2/scF

2、v。將Sectag2/scFv轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后獲得目的蛋白表達(dá)。SDSPAGE和Western blot檢測表明目的蛋白Mr約為34 000。結(jié)論: 成功地構(gòu)建抗scFv真核表達(dá)載體pSectag2/scFv, 并在CHO細(xì)胞中獲得表達(dá), 為人源肝癌scFv的進(jìn)一步的應(yīng)用研究提供依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】 肝癌 單鏈抗體 CHO細(xì)胞 基因表達(dá) 由于種種原因單克隆抗體(mAb)在進(jìn)入臨床中受到了很大的限制1。原因之一是因為動物源性抗體在人體應(yīng)用時容易誘發(fā)HAMA, 產(chǎn)生不良反應(yīng)2。近年來, 逐漸發(fā)展的抗體庫技術(shù)為制備高親和性的人源抗體提供了有力工具。該技術(shù)無需免疫即可制備全人源性抗體, 可有效避HAMA

3、3。噬菌體抗體將表型與其基因型之間精確聯(lián)結(jié), 單鏈抗體（scFv）可以在預(yù)先并不知道細(xì)胞表面受體特征的情況下與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合而獲得, scFv蛋白具有分子小、 穿透力強(qiáng)等優(yōu)點4。本實驗室曾利用噬菌體抗體庫技術(shù), 構(gòu)建了全人源肝癌scFv噬菌體庫, 并篩選到了1株肝癌特異性scFv5, 實現(xiàn)scFv的功能性表達(dá), 進(jìn)一步鑒定scFv蛋白的功能。我們利用篩選到的基因進(jìn)行蛋白的真核表達(dá)。1 材料和方法1.1 材料人源肝癌scFv由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科實驗室提取獲得并保存; 質(zhì)粒pSectag2/Hygro B、 E.coli感受態(tài)菌株DH5和CHO細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)生化教研室饋贈; 連

4、接酶及限制性核酸內(nèi)切酶Hind 、Not均購自TaKaRa公司; 膠回收試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品; 質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自博大泰克公司; HiTrapNiNTA鰲合層析介質(zhì)為美國Invitrogen公司產(chǎn)品; 6His mAb、HRP羊抗鼠IgG購自大連寶生物公司; DMEM培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品; Eppendorf電轉(zhuǎn)染電融合儀4308為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。1.2 方法1.2.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計擴(kuò)增scFv基因的引物, 上游引物5CGAAGCTTTCCTCTGAGCTGACTCAGGACCCCTC3, 含有Hind 酶切位點, 下游引物

5、5ATATAGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCGT3, 含有Not 酶切位點, 引物由北京奧科公司合成。用設(shè)計的引物PCR擴(kuò)增全長目的基因: PCR 反應(yīng)條件設(shè)定為: 起始94 5 min變性; 然后94 30 s, 65 30 s, 72 30 s, 30 循環(huán); 最后72延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后, 凝膠純化試劑盒純化回收(具體參見Promega小提試劑盒說明書)。將回收的PCR產(chǎn)物與載體pSectag2用Hind 、 Not 酶行雙酶切, 酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳后試劑盒回收, 回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶16連接過夜, 將目的基因克隆入載體pSectag2中。將構(gòu)

6、建的載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5, 以AMP篩選出陽性克隆,經(jīng)PCR和Hind 、 Not 酶切分析鑒定后送北京奧科生物公司進(jìn)行序列測定, 測序正確的重組載體命名為pSectag2/scFv。1.2.2 pSectag2/scFv擴(kuò)增提取將重組載體pSectag2/scFv菌液擴(kuò)增, 37、 200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h獲得成熟菌液50 mL, 根據(jù)博大泰克中提試劑盒提取重組載體,參見博大泰克中提試劑盒說明書進(jìn)行。1.2.3 pSectag2/scFv電轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞提取的重組載體pSectag2/scFv經(jīng)分光光度計檢測定量后, 利用電轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。將處于對數(shù)生長期的CHO細(xì)胞

7、用胰蛋白酶消化后取4×106細(xì)胞、電壓600 V、穿孔時間400 s, 具體操作步驟參見Eppendorf電轉(zhuǎn)染點融和儀4308說明書, 轉(zhuǎn)染后以10倍培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞, 轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿內(nèi), 培養(yǎng)24 h換新培養(yǎng)液, 收集培養(yǎng)上清, 70保存?zhèn)溆谩?.2.4 目的蛋白的純化和鑒定收集72 h轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清, 上清過0.45 m濾膜, 用Ni2+NTA鰲合層析介質(zhì)室溫結(jié)合1 h, 用洗滌緩沖液洗滌5次后, 用含200 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫獲得純化蛋白。蛋白樣品經(jīng)行SDSPAGE分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜, 以5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h, 依次加入鼠抗 6His mA

8、b（11 000稀釋, 4過夜）、 HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（15 000稀釋, 室溫1 h）, 用化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗室條件下X光片感光顯影。2 結(jié)果2.1 載體pSectag2/scFv的構(gòu)建分別用5端和3引物成功擴(kuò)增出scFv的目的基因（圖1）, 分別對pSectag2、 scFv基因行Hind 、 Not雙酶切, 瓊脂糖電泳回收, 回收基因連接成目的載體pSectag2/scFv, 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5獲得陽性克隆, 經(jīng)PCR和Hind 、Not 雙酶切鑒定（圖1）篩出部分克隆。將篩選的單克隆送北京奧克公司測序鑒定（測序結(jié)果97858為目的序列）, 成功構(gòu)建包含了scFv基因的

9、重組載體pSectag2/scFv。2.2 重組載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞獲得目的蛋白表達(dá)50 mL菌液用博大泰克中提試劑盒提取重組載體, 分光光度計檢測后, 重組載體電轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞, 每24 h換培養(yǎng)液1次。收集72 h細(xì)胞培養(yǎng)上清過Ni2+NTA 柱獲得1 mg純化蛋白。純化上清蛋白行SDSPAGE（圖2）和Western blot（圖3）顯示上清內(nèi)含有融合6His Mr約34 000的蛋白。3 討論 肝癌特異性抗體具有特異識別肝癌細(xì)胞, 可以攜帶抗腫瘤藥物及放射顯影藥物起到治療及診斷作用。以往雜交瘤技術(shù)制備的mAb多為鼠源性, 能造成嚴(yán)重的過敏反應(yīng), 而且在人體內(nèi)重復(fù)應(yīng)用時可產(chǎn)生人抗鼠抗體（H

10、AMA）反應(yīng)6。鼠源性mAb在人體內(nèi)常不能有效激活補體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng), 并對清除抗體的器官產(chǎn)生損害, 因此其應(yīng)用受到較大限制。噬菌體抗體庫技術(shù)不需要進(jìn)行細(xì)胞融合建立雜交瘤, 較好地解決了人體雜交瘤系統(tǒng)低效的問題。該技術(shù)無需免疫即可制備全人源抗體, 可有效避免鼠源性抗體在人體應(yīng)用時誘發(fā)HAMA反應(yīng)。同時生物工程系統(tǒng)的發(fā)展使蛋白表達(dá)技術(shù)日臻成熟, 利于抗體蛋白的大規(guī)模制備。scFv屬小分子抗體, 具有完全抗原結(jié)合位點的最小抗體片段, 在腫瘤的診斷及治療中逐漸顯示出其優(yōu)勢7。其可以與毒素、 前體藥物轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞因子等效應(yīng)分子構(gòu)建成多種雙功能抗體分子, 也是構(gòu)建雙特異抗體的理想元件。目前國外

11、的一些抗腫瘤scFv已進(jìn)入體內(nèi)試驗階段。 我實驗室利用噬菌體抗體庫技術(shù), 從200多位肝癌患者外周血提取總RNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA, 構(gòu)建了人源肝癌scFv庫, 庫容量達(dá)到8×1011, 經(jīng)過多次篩選, 得到了一株肝癌特異性scFv, 初步經(jīng)過噬菌體抗體ELISA檢測, 結(jié)果顯示與SMMC7721有較強(qiáng)的特異性結(jié)合能力5。DNA測序結(jié)果顯示: 將重鏈、 輕鏈可變區(qū)基因序列分別與KABAT數(shù)據(jù)庫比較。結(jié)果重鏈可變區(qū)基因與人IgH鏈的同源最高達(dá)98% , 輕鏈可變區(qū)基因與人V鏈的同源性最高達(dá)96%。 我們所用抗體基因由本實驗室自行獲得, 是目前國內(nèi)外報道庫容量最大的抗體庫之一, 這樣就保證

12、了能夠篩選出特異性更高、 結(jié)合能力更強(qiáng)的肝癌scFv。有希望成為對肝癌診斷及治療的新抗體。由于原核細(xì)胞內(nèi)缺乏真核生物蛋白質(zhì)的加工與修飾系統(tǒng)8, 不能表達(dá)出蛋白的完整真實特性。為了實現(xiàn)scFv的功能性表達(dá), 進(jìn)一步鑒定scFv的功能, 本實驗中進(jìn)行了scFv基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá), 在CHO細(xì)胞中獲得了蛋白表達(dá)。【參考文獻(xiàn)】 1Krauss J, Arndt MA, Martin AC, et al. Specificity grafting of human antibody frameworks selected from a phage display library: gener

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