利用基因芯片技術(shù)檢測BRAF基因在胰腺癌組織中的表達(dá)

1、利用基因芯片技術(shù)檢測BRAF基因在胰腺癌組織中的表達(dá) 作者：湯永輝，石欣，衛(wèi)文俊，程張軍，高乃榮 摘要目的:研究BRAF基因在正常胰腺與胰腺癌組織中表達(dá)的情況。方法: 收集正常胰腺組織3例以及胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本6例，后者均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)；用TRizol法對組織進(jìn)行總RNA抽提，采用無RNA酶的DNA酶等方法進(jìn)行純化；通過紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳以及Labonchip對總RNA進(jìn)行質(zhì)控；利用寡核苷酸芯片技術(shù)檢測正常胰腺和胰腺癌組織中BRAF基因的表達(dá)，并且應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)技術(shù)加以驗(yàn)證。結(jié)果: 總RNA的OD260nm/OD280nm之值在1.82.0之間；瓊脂糖凝膠電

2、泳18s和28s電泳條帶清晰，且28s和18s亮度之比2；Labonchip檢測顯示18s和28s雙峰比例及位置均正常，無降解雜峰出現(xiàn)。芯片雜交掃描圖像信號清晰，具有較低的整體背景和較高的信噪比；Ratio分析表明，BRAF基因在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)（Cy3/Cy52.0）。 RTPCR驗(yàn)證了胰腺癌組織中BRAF mRNA表達(dá)上調(diào)。結(jié)論: BRAF基因在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。 關(guān)鍵詞胰腺癌；BRAF基因；寡核苷酸芯片；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) BRAF基因別名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(vraf murine sarcoma viral o

3、ncogene homolog B1)，Ikawa等1發(fā)現(xiàn)該基因能誘導(dǎo)禽原代細(xì)胞增殖和NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，確定其為一種癌基因，在許多腫瘤中存在BRAF基因的突變，并與細(xì)胞癌變密切相關(guān)1-3。該基因與各種腫瘤的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)，但目前尚沒有該基因在胰腺癌組織中表達(dá)水平的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用寡核苷酸芯片技術(shù)檢測正常胰腺和胰腺癌組織中BRAF基因的表達(dá)情況，并用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase reaction, RTPCR)進(jìn)行驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。 1 材料與方法 1.1 臨床組織標(biāo)本與病人簽訂知情同意書后，收集東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院2004年61

4、2月胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本6例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，其中男性3例, 女性3例，年齡5671歲，平均65.2歲。臨床分期采用1987年國際抗癌協(xié)會（UICC）的TNM分期：期1例，期1例，期2例，期2例。正常胰腺組織3例，取自外傷性胰腺損傷需切除部分胰腺者。手術(shù)切除后立即切成小塊，置于-80保存。 1.2 試劑與儀器末端帶氨基標(biāo)記的寡核苷酸探針 （上海博亞公司）， UV755B型紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器公司），Trizol （Sangon公司）， SuperScrip反轉(zhuǎn)錄酶 (Cat.No.18064014，Invitrogen公司），QIAGEN RNeasy Kit 、 QIA

5、quick PCR purification Kit 、QIAquick Nucleotide Removal Kit （QIAGEN公司），RNA酶抑制劑 (Cat.No.D2311A)、DNase （Takara公司），限制性內(nèi)切酶TspRI（New England Biolabs），Taq DNA 聚合酶 (Promega 公司), Cy3dCTP (Cat.No.PA53021)、Cy5dCTP (Cat.No.PA55021)（Amersham Phamacia Biotech 公司），Agilent2100分析儀、Agilent2100掃描儀（美國Agilent公司產(chǎn)品）等。 1.

6、3 寡核苷酸芯片的制作基因表達(dá)譜寡核苷酸芯片由上海生物芯片公司提供，按照探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，由上海博亞公司合成末端帶氨基標(biāo)記的寡核苷酸探針BRAF基因（基因代碼），NM_004333（GenBank號），Hs162967（Unigene號），2 513（序列長度），5CGA GTG ATG ATT GGG AGA TTC CTG ATG GGC AGA TTA CAG TGG GAC AAA GAA TTG GAT CT3（探針序列）。采用同型雙功能偶聯(lián)劑（APSPDC）包被玻璃基片，用OmniGrid100點(diǎn)樣儀進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后置于42過夜，在55用 2×SSC/0.2%

7、 SDS/0.1% BSA洗片2030 min，再用純水洗1 min，1500 r・min-1離心5 min干片，室溫放置30 min，干燥器中避光保存?zhèn)溆谩?1.4 總RNA抽提和熒光探針的制備用TRizol法對組織進(jìn)行總RNA抽提，加入無RNA 酶的DNA酶處理，以提高樣品純度，并按QIAGEN RNeasy Kit操作方法進(jìn)一步純化總RNA。利用紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳、Labonchip對總RNA進(jìn)行質(zhì)控，精確判斷RNA樣品的完整性；而對于未能達(dá)到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的樣品，應(yīng)進(jìn)行重新抽提和純化。50 g總RNA通過反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記獲得30 pmol的熒光探針，即可滿足芯片雜

8、交的需要。 1.5 芯片雜交實(shí)驗(yàn)組（胰腺癌cDNA探針）采用Cy3熒光標(biāo)記，對照組（正常胰腺組織cDNA探針）采用Cy5熒光標(biāo)記。分別將Cy3和Cy5熒光標(biāo)記的探針約30 pmol溶解于20l雜交液（5×SSC/0.2% SDS），然后置于PCR儀中，在95條件下變性2 min后于70條件下預(yù)雜交20 min，再將兩種熒光標(biāo)記的探針混合后滴加于芯片上，置于42雜交箱中避光雜交1618 h。雜交結(jié)束后，分別用洗液（2×SSC/0.1% SDS）、洗液（1×SSC/0.1% SDS）、洗液 (0.5×SSC)各洗滌10 min，去離子水室溫洗滌2 min，1

9、500 r・min-1離心5 min干片，最后掃描并避光干燥保存。 1.6 圖像掃描與數(shù)據(jù)分析用Agilent掃描儀進(jìn)行掃描，使用Imagene3.0軟件對圖像進(jìn)行分析，經(jīng)過自動和人工定位與排列確定雜交點(diǎn)的范圍，過濾背景噪音，提取得到基因表達(dá)的熒光信號強(qiáng)度值，利用內(nèi)參照基因?qū)y3和Cy5的原始提取信號進(jìn)行均衡和修正，即數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算兩種熒光Cy3與Cy5的比值。基因表達(dá)差異判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）Cy3/Cy5之值2或0.5，即基因的表達(dá)差異在兩倍以上；（2）Cy3或Cy5信號值之一必須大于800。 1.7 RTPCR總RNA經(jīng)過DNA酶處理后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA (Roc

10、he 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)，并將其在-20保存。BRAF引物序列為上游引物：5GTG AGG GCT CCA GCT TGT ATC AC3（exon 13），下游引物：5AAA CCA GCC CGA TTC AAG GAG GG3（exon 18）。擴(kuò)增產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶TspRI在65條件下培育6h，野生型BRAF基因exon 15沒有發(fā)生突變，不能被TspRI酶切，而突變型BRAF基因則被酶切產(chǎn)生621 bp大小的目標(biāo)產(chǎn)物4。3 磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)基因被用作管家基因，以衡量加樣的一致性。GAPDH的上游引物為5 CTC ATG ACC ACA GTC CAT GCC ATC 3

11、，下游引物為 5CTG CTT CAC CAC CTT CTT GAT GTC 3，目標(biāo)產(chǎn)物大小為585 bp。引物由Amplimmun AG公司合成。 1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以x-±s表示，采用MannWhitney U檢驗(yàn)比較兩組間差異。 2 結(jié) 果 2.1 正常胰腺和胰腺癌組織總RNA抽提及質(zhì)量鑒定結(jié)果總RNA的OD260nm/OD280nm之值在1.82.0之間；瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)18s和28s電泳條帶清晰，且28s和18s亮度之比2；進(jìn)一步用Labonchip檢測分析顯示，18s和28s雙峰比例及位置均正常，無降解雜峰出現(xiàn)（圖1），以上結(jié)果均說明總RNA純度高、無降解、

12、質(zhì)量好。 2.2 正常胰腺和胰腺癌組織芯片雜交結(jié)果正常胰腺組織和胰腺癌組織經(jīng)芯片掃描后發(fā)現(xiàn)，BRAF基因的熒光強(qiáng)度比值（Cy3/Cy5）在6例胰腺癌標(biāo)本中有5例（83.3）均大于2，平均Ratio值為3.241±0.53，而正常胰腺組織平均比值為1.011±0.03，與正常組織相比，BRAF基因在胰腺癌中表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。 2.3 正常胰腺和胰腺癌組織BRAF mRNA表達(dá)水平本研究應(yīng)用RTPCR技術(shù)檢測BRAF mRNA的表達(dá)，正常胰腺組織的BRAF基因表達(dá)較弱，胰腺癌組織中BRAF 基因表達(dá)信號強(qiáng)。作為內(nèi)參照基因，正常胰腺和胰腺癌組織中GAPD

13、H基因的表達(dá)基本一致(圖2)。M. PCR Marker（自上而下依次為1000、800、600、400、 200和100bp）；N. PCR陰性對照；+. 陽性對照；以上PCR擴(kuò)增重復(fù)3遍，結(jié)果經(jīng)過計(jì)算機(jī)掃描(ImagePro Plus, Version 3.0.01)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行半定量分析。正常胰腺組織BRAF mRNA為0.11±0.05，胰腺癌組織為1.01±0.41，上調(diào)9.18倍(P<0.01)。 3 討 論本研究中我們主要應(yīng)用寡核苷酸芯片技術(shù)，檢測3例正常胰腺和6例胰腺癌組織中BRAF mRNA水平，發(fā)現(xiàn)與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中BR

14、AF mRNA水平均上調(diào),并且應(yīng)用RTPCR技術(shù)進(jìn)一步加以驗(yàn)證。BRAF基因是RAF家族的成員之一，該家族還包括ARAF和RAF1(CRAF)基因，其位于7q34，長約190 kb，編碼含783個氨基酸的蛋白，為一種絲/蘇氨酸特異性激酶(serine/threoninespecific kinases)，是RASRAFMEKERKMAPK信號通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長、分化和凋亡等。BRAF基因突變主要是exon15上的激活區(qū)發(fā)生由T到A突變（BRAF V600E），突變后導(dǎo)致BRAF蛋白激活，進(jìn)一步活化MEK/ERK，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展。在胞漿,ERK(ex

15、tracellular signal regulated kinase)發(fā)生磷酸化并激活p90RSKs，繼而使凋亡誘導(dǎo)因子BRD失活或激活CREB（cAMP response elementbinding protein），影響細(xì)胞凋亡；在胞核中，激活的ERK能夠影響多種與腫瘤相關(guān)的基因表達(dá)，如Cyclin D（細(xì)胞周期蛋白 D）表達(dá)增加、原凋亡蛋白Bim家族表達(dá)下降、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)上調(diào)等等。目前，相關(guān)BRAF蛋白激活后對黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)的研究已基本清楚，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲、改變整合素的表達(dá)、降低E鈣黏素表達(dá)以及增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）分泌5；采用RNA干擾(RNAi)技

16、術(shù)使BRAF V600E突變沉默，能夠有效降低MAPK活性，抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)凋亡6；體內(nèi)和體外試驗(yàn)也均證實(shí)，人黑色素瘤細(xì)胞株對特異性MEK激酶抑制劑普遍敏感7。隨著對BRAF基因的不斷研究，其對胰腺癌等腫瘤的作用機(jī)制進(jìn)一步明確，從而為胰腺癌等腫瘤的早期診斷和干預(yù)提供了可能，并為靶向治療提供重要的理論基礎(chǔ)3。 參考文獻(xiàn) 1IKAWA S, FUKUI M, UEYAMA Y, et al. Braf, a new member of the raf family, is activated by DNA rearrangementJ. Mol Cell Biol, 1988, 8: 26512

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