松花粉對(duì)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞p16及p21基因表達(dá)的影響

1、松花粉對(duì)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞p16及p21基因表達(dá)的影響【摘要】 目的研究松花粉對(duì)衰老細(xì)胞(2BS)內(nèi)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p16INK4a及p21WAF1基因mRNA表達(dá)的影響。方法2BS細(xì)胞從28代開(kāi)始培養(yǎng)，隨機(jī)分成年輕對(duì)照組（30代）、衰老模型組（56代）、松花粉中劑量（120mg/dl）組（56代）、松花粉高劑量(240mg/dl)組（56代）。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，檢測(cè)G1期比例；半定量RTPCR法測(cè)定p16INK4a、p21WAF1mRNA的表達(dá)。結(jié)果衰老模型組細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則；松花粉處理組細(xì)胞，體積回縮，形態(tài)趨于規(guī)則。G1期細(xì)胞比例松花粉中劑量組(72.

2、73%±1.76%)和高劑量組(64.15%±0.87%)較衰老模型組(81.33%±3.43%)顯著下降(P<0.05)。細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p16INK4amRNA的表達(dá)量在松花粉中劑量組(0.3483±0.0078)和高劑量組(0.3222±0.0055)較衰老模型組(0.3974±0.0078)表達(dá)灰階明顯下調(diào)。p21WAF1mRNA的表達(dá)量在松花粉中劑量組(0.7692±0.1749)和高劑量組(0.4451±0.0363)較衰老模型組(1.1767±0.2782)。結(jié)論松花粉具

3、有改善細(xì)胞衰老的作用，其分子機(jī)制可能與下調(diào)衰老細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p16INK4a及p21WAF11mRNA的表達(dá)從而改善衰老細(xì)胞G1期阻滯有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 松花粉;細(xì)胞衰老;細(xì)胞周期;p16;p21Abstract：ObjectiveTo observe the effects of pine pollen on the changes of p16INK4a and p21WAF1 in 2BS cells.MethodThe 2BS cells were cultured from 28 population doubling(PD) and divided equally i

4、nto the young control group, old control group, middledose pine pollen group(120mg/dl) and highdose pine pollen group(240mg/dl)randomly.Regulate the phases of cell cycle by flow cytometry，and then the expression of p16INK4a，p21WAF1 mRNA were determined by semiquantitative RTPCR.ResultThe amount of c

5、ells in G1 phase was depressed in middledose pine pollen group (72.73%±1.76%) and highdose pine pollen group (64.15%±0.87%) than in old control group (81.33%±3.43%)noticeablely (P<0.05).The expression of p16INK4amRNA in middledose pine pollen group(0.3483±0.0078) and highd

6、ose pine pollen group (0.3222±0.0055) was significantly decreased than in old control group(0.3974±0.0078,P<0.05)；The level of p21WAF1mRNA in middledose pine pollen group(0.7692±0.1749) and highdose pine pollen group (0.4451±0.0363) was significantly lower than in old cont

7、rol group(1.1767±0.2782,P<0.05).ConclusionPine pollen has the antiaging effect on aging 2BS cells, this effect may be reacted via decreasing the expression of p16INK4a and p21WAF1mRNA levels in aging cells, and then down regulating the amount of cells blocking in G1 phase of cell cycle.K

8、ey words：pine pollen；cell aging；cell cycle；P16；P21 細(xì)胞復(fù)制性衰老是目前普遍接受的細(xì)胞衰老理論，其最顯著的特征即細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯。在細(xì)胞衰老過(guò)程中細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制因子（CDKI）發(fā)生表達(dá)量的改變。其中p16INK4a及p21WAF1是細(xì)胞衰老誘導(dǎo)途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵產(chǎn)物，被稱(chēng)為衰老相關(guān)基因1。其表達(dá)量與衰老的表型及衰老進(jìn)程密切相關(guān)，作為檢測(cè)細(xì)胞衰老的分子指標(biāo)應(yīng)用于衰老相關(guān)檢測(cè)。松花粉是天然的營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)，已有的研究發(fā)現(xiàn)，松花粉對(duì)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞有促進(jìn)增殖2，并提高端粒酶活性3的作用。本實(shí)驗(yàn)探討松花粉對(duì)衰老2BS細(xì)胞中細(xì)胞周期及細(xì)胞周期蛋

9、白激酶抑制劑p16INK4a及p21WAF1mRNA表達(dá)量的影響。為研究松花粉抗細(xì)胞衰老的分子機(jī)制及衰老通路選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理 2BS細(xì)胞由北京生物制品研究所建株，28代引入。培養(yǎng)于15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，37,5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。細(xì)胞壽限為6070代。至30代時(shí)隨機(jī)取8瓶作為年輕對(duì)照組，至56代時(shí)隨機(jī)取24瓶分成衰老模型組、松花粉中劑量組、松花粉高劑量組3組每組8瓶，分別以單純完全培養(yǎng)基、120mg/dl含花粉血清培養(yǎng)基、240mg/dl的含花粉血清培養(yǎng)基培養(yǎng)8天3，收集細(xì)胞。配制松花粉血清液，使其終濃度分別為1

10、20mg/dl與240mg/dl。1.1.2 儀器與試劑 FACScan流式細(xì)胞儀(Beckman coulter);PCR儀（ABI9700）；凝膠成像儀（BioRad）。類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS）購(gòu)自民海生物，MEM培養(yǎng)基（含非必需氨基酸、谷胺酰胺）為invitrogen產(chǎn)品。流式細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（上海杰美）；cDNA試劑盒（invitrogen，superscriptIII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞周期測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)至8090融匯時(shí)，徹底收集細(xì)胞入15ml離心管，1500rpm,5min離心,去上清得細(xì)胞沉淀。再按細(xì)胞周期流式檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。EXPO32ADC軟

11、件進(jìn)行檢測(cè)（美國(guó)Beckman Clouter），Multicycle for windows DNA（美國(guó)Beckman,Clouter）軟件行細(xì)胞周期分析。1.2.2 RTPCR法檢測(cè)p16INK4a及p21WAF1mRNA的表達(dá) p16INK4a、p21WAF1特異基因及actin內(nèi)參基因的引物均由上海生工合成。actin PCR引物4：上游5GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3,下游5CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3,擴(kuò)增片段為500bp；p16INK4a PCR引物4：上游5ATGATGATGGGCAGCGCC3,下游5CGAGGTTTCTCAGAGCCT3擴(kuò)

12、增片段為346bp;p21WAF1PCR引物5:上游5CATTTGGTGGACCCAAAGAC3,下游5CCTCCCTTCCCCAAAGTTTA3,擴(kuò)增片段為304bp。 RNA提取與測(cè)定：采用Invitrogen公司Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值并計(jì)算RNA濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其片段完整性。 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)總體積為20l，其中總RNA為5l，隨機(jī)引物(oligo(dT)1l、MMLV200u、RNase Inhibitor 40u、10mmol/L dNTPs 1l、0.1mmol/L DTT 2l、5×RT buffer 4l。65變性5

13、min后，37溫育50min后，70、15min后終止反應(yīng)。 PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為20l,分別含cDNA模板2.0l、TaqE 0.4l、dNTP 0.25mmol/L、引物1.0l、10×PCR Buffer 2.0l。反應(yīng)條件：94 5min,94 30s,5662 30s,72 40s,35個(gè)循環(huán);最后72延伸10min。其中Actin退火溫度為62；p16INK4a退火溫度為56；p21WAF1退火溫度為56。 取6l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2l上樣緩沖液在1%瓊脂糖凝膠電泳上做產(chǎn)物檢測(cè)分析,80V,30min電泳，EB染色，以GELDOC2000型紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，對(duì)特異基

14、因條帶進(jìn)行灰度掃描，并對(duì)各特異基因/actin的比值進(jìn)行分析。1.3 統(tǒng)計(jì)處理 測(cè)定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較方差齊性時(shí)行單因素方差分析,LSD方法進(jìn)行多組間兩兩比較；方差不齊時(shí),采用非參數(shù)分析進(jìn)行多組間比較，Dunnetts T3方法進(jìn)行多組間兩兩比較，以P0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 細(xì)胞周期 由表1可見(jiàn)，56代較30代2BS細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增加(P<0.001),而120mg/dl與240mg/dl含花粉血清培養(yǎng)基處理組細(xì)胞均較衰老模型組G0/G1期細(xì)胞比例減少(P<0.05)。 表

15、1 松花粉對(duì)2BS細(xì)胞細(xì)胞周期的影響（略）與56代對(duì)照組比較，*P0.05，*P0.01，*P0.001；非參數(shù)方法（KruskalWallis方法）2.2 RTPCR結(jié)果2.2.1 總RNA完整性分析 總RNA電泳結(jié)果示，4組細(xì)胞中提取的總RNA其28S,18S條帶完整，OD260/OD280比值為1.72.0,證明所提取的總RNA片段完整，無(wú)蛋白質(zhì)污染，可用于RTPCR反應(yīng)。圖1 總RNA電泳圖。（略）1.年輕對(duì)照組；2.衰老模型組；3.120mg/dl含松花粉血清組；4.240mg/dl含花粉血清組。2.2.2 p16INK4a及p21WAF1基因mRNA水平p16INK4a和p21WA

16、F1基因RTPCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行灰度掃描分析。結(jié)果顯示(圖3)，120mg/dl(0.3483±0.0078）與240mg/dl（0.3222±0.0055）含花粉血清組較衰老模型組（0.3974±0.0078）中p16INK4amRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)（P<0.05）。p21WAF1mRNA表達(dá)量在120mg/dl（0.7692±0.1749）與240mg/dl（0.4451±0.0363）含花粉血清組較衰老模型組（1.1767±0.2782）也顯著下調(diào)（P<0.05）。圖2 p16

17、,p21基因PCR電泳圖（略）1.年輕對(duì)照組；2.衰老模型組；3.120mg/dl含松花粉血清組；4.240mg/dl含花粉血清組。圖3 p16,p21半定量RTPCR表達(dá)量比較（略）3 討論 細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)中的基本過(guò)程，細(xì)胞在周期時(shí)相的變遷中進(jìn)入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)是十分有序的，沿著G1期S期G2期M期的順序進(jìn)行，細(xì)胞周期具有G1/S與G2/M兩個(gè)調(diào)控點(diǎn)，其中G1/S點(diǎn)是啟動(dòng)細(xì)胞周期循環(huán)的關(guān)鍵。細(xì)胞衰老最顯著的特征是細(xì)胞在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)仍維持代謝活性，但因阻滯于G1期，失去了對(duì)有絲分裂原的反應(yīng)和合成DNA的能力，不能進(jìn)入S期。 本研究采用自然衰老2BS細(xì)胞模

18、型，觀察松花粉的抗衰老作用，結(jié)果顯示松花粉干預(yù)能明顯改善衰老細(xì)胞出現(xiàn)的G1期細(xì)胞阻滯，提示松花粉在體外具有一定的抗細(xì)胞復(fù)制性衰老的作用。因此本研究進(jìn)一步觀察了細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p16，p21在此過(guò)程中的可能作用。 在衰老細(xì)胞中，其細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶（CDK）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制因子(CDKI)發(fā)生量與活性的變化。依據(jù)激活的CDKI的不同，可將衰老通路分為以下三條6，包括p16INK4a/RB,p19ARF/p53/p21WAF1,和PTEN/p27通路。已有大量研究表明在人胚肺成纖維細(xì)胞的衰老過(guò)程中，p16INK4a/RB和p21WAF1通路發(fā)揮著重要作用。

19、當(dāng)這些途徑所涉及的關(guān)鍵因子發(fā)生突變，細(xì)胞將延緩衰老或繞過(guò)衰老程序繼續(xù)增殖。 P16是CDK46/D的特異性抑制劑，通過(guò)抑制CDK46/D激酶的活性，使RB蛋白保持非磷酸化，減少了轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放，使細(xì)胞內(nèi)不能表達(dá)E2F依賴(lài)的G1晚期蛋白，使細(xì)胞DNA增殖不能通過(guò)G1/S調(diào)控點(diǎn)，阻滯在G1期。P16蛋白在正常生長(zhǎng)細(xì)胞中表達(dá)水平較低7，但是在細(xì)胞多次復(fù)制接近衰老時(shí)其表達(dá)水平逐漸增高89，2004年Janakiraman K等學(xué)者提出P16能作為測(cè)定細(xì)胞衰老的分子標(biāo)記以區(qū)別于單從時(shí)間上對(duì)衰老的界定10。國(guó)內(nèi)Jiangming等以p16正反義載體分別轉(zhuǎn)染年輕的人成纖維細(xì)胞（2BS）11，結(jié)果示p1

20、6INK4a的積累是衰老的誘因，而不是衰老的結(jié)果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)12，負(fù)調(diào)控機(jī)制減弱是細(xì)胞復(fù)制性衰老時(shí)p16INK4a基因高表達(dá)的重要原因。 本研究觀察松花粉抗細(xì)胞衰老過(guò)程中p16表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)在松花粉干預(yù)處理后衰老細(xì)胞的p16INK4amRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯的下調(diào)。提示松花粉有可能通過(guò)抑制p16INK4a的表達(dá)，解除對(duì)Rb活性的抑制，促進(jìn)E2F蛋白的釋放，激活E2F依賴(lài)的G1晚期調(diào)控蛋白，促進(jìn)細(xì)胞DNA增殖，改善G1期阻滯。但是松花粉對(duì)p16INK4a的抑制作用是否與激活其負(fù)調(diào)控元件有關(guān)還有待于進(jìn)一步的研究。 P21WAF1（又名p21CIP1,p21SDI1）則是細(xì)胞周期依賴(lài)激酶（CDK

21、）的非特異性抑制劑。其一方面具有抑制Rb磷酸化,阻遏E2F釋放,使細(xì)胞周期停留在G1/S點(diǎn)不能進(jìn)入S期的作用；另一方面,可與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen,PCNA)結(jié)合,使依賴(lài)PCNA的DNA復(fù)制受阻,致使細(xì)胞增殖停滯在G1期13。在衰老細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)p21WAF1的mRNA比年輕細(xì)胞增加1020倍14。 本研究觀察松花粉抗細(xì)胞衰老過(guò)程中p21WAF1表達(dá)的變化情況，發(fā)現(xiàn)松花粉干預(yù)后衰老細(xì)胞內(nèi)p21WAF1mRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示松花粉有可能通過(guò)抑制p21WAF1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期進(jìn)展，而延緩細(xì)胞的衰老。但是松花粉具

22、體是通過(guò)p21WAF1下游的PCNA途徑、Rb途徑何者起作用以及是否兩條途徑同時(shí)起抗衰老作用還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)松花粉通過(guò)何種機(jī)制抑制P21表達(dá)也還有待研究。以往的研究表明，p21WAF1隨細(xì)胞傳代表達(dá)逐漸升高，當(dāng)p21WAF1升高至一定水平，p16INK4a表達(dá)開(kāi)始升高，而此時(shí)p21WAF1表達(dá)水平下降，高水平的p16INK4a啟動(dòng)、維持并推動(dòng)細(xì)胞衰老15。本實(shí)驗(yàn)中，衰老模型組、120mg/dl與240mg/dl的含花粉血清培養(yǎng)基處理組中，p16INK4amRNA的表達(dá)量均較p21WAF1mRNA表達(dá)量要低，可能與已知的p21WAF1先于p16INK4a表達(dá)有關(guān)。p21WAF1和p16IN

23、K4a的增加是相繼的，p21WAF1表達(dá)增加出現(xiàn)在大多數(shù)細(xì)胞喪失增殖潛力時(shí)，而p16INK4a表達(dá)增加出現(xiàn)在所有細(xì)胞喪失增殖潛力時(shí)的衰老終末期。p21WAF1能在細(xì)胞復(fù)制衰老的晚期激活p16INK4a16。p21啟動(dòng)細(xì)胞衰老機(jī)制而p16INK4a維持細(xì)胞衰老的進(jìn)程。 總之，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞周期G1期阻滯角度探討了松花粉的抗衰老作用，并進(jìn)而分析了兩個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子p16INK4a與p21WAF1 mRNA表達(dá)量的變化情況，提示松花粉可抑制p16及p21的表達(dá)，并可能通過(guò)釋放其下游的Rb與PCNA蛋白，推進(jìn)細(xì)胞DNA增殖進(jìn)程，改善衰老細(xì)胞G1期阻滯情況，從而達(dá)到抗衰老作用。【參考文獻(xiàn)】 1 鄭

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