發(fā)酵工程電子版

1、發(fā)酵工藝原理（發(fā)酵工程）講 義適用 生物工程 、生物技術(shù)、 制藥工程及生物科學(xué)專(zhuān)業(yè)用王莘2012.8.20第一章 緒論發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用：生物生物學(xué)一、發(fā)酵定義：從工業(yè)微生物角度的發(fā)酵：利用培養(yǎng)微生物來(lái)獲得產(chǎn)物的有氧或厭氧的任何過(guò)程，現(xiàn)在有擴(kuò)大到培養(yǎng)生物細(xì)胞（含有動(dòng)物、植物和微生物）獲得產(chǎn)物的所有過(guò)程。從發(fā)酵工業(yè)角度的發(fā)酵：借助微生物在有氧和無(wú)氧條件下的生命活動(dòng)來(lái)制備微生物體本身，或共同直接代謝產(chǎn)物或次級(jí)代謝產(chǎn)物的過(guò)程統(tǒng)稱為發(fā)酵。傳統(tǒng)發(fā)酵：醬油、醋、酒、長(zhǎng)毛豆腐。新興發(fā)酵：有機(jī)酸、酶制劑、抗生素。發(fā)酵工業(yè)的劃分：食品工業(yè)（釀造工業(yè)）和非食品工業(yè)（發(fā)酵工業(yè)）發(fā)酵工業(yè)：利用生物的生命活動(dòng)生產(chǎn)的酶對(duì)無(wú)機(jī)或

2、有機(jī)原料進(jìn)行酶加工獲得產(chǎn)品的工業(yè)。二、發(fā)酵工業(yè)具備的條件： 要有某種適宜的微生物。 要保證或控制微生物進(jìn)行代謝的各種條件（培養(yǎng)基組成，溫度，溶氧濃度 ，酸堿度等）。 要有進(jìn)行微生物發(fā)酵的設(shè)備。 要有將菌體或代謝產(chǎn)物提取出來(lái)精制成產(chǎn)品的方法和設(shè)備。三、發(fā)酵工業(yè)的改革1天然發(fā)酵階段特點(diǎn)：1）家庭作坊式生產(chǎn)；2）容易感染細(xì)菌 ； 3）厭氧發(fā)酵；4）非純種培養(yǎng)； 5）憑經(jīng)驗(yàn)傳授技術(shù)； 6）產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。2純培養(yǎng)技術(shù)的建立階段純培養(yǎng)階段特點(diǎn)：（1）多為好氧產(chǎn)品；（2）、均為表面培養(yǎng)；（3）、產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單；（4）、設(shè)備要求不高；（5）、生產(chǎn)規(guī)模不大。3通氣攪拌發(fā)酵技術(shù)的建立階段第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，1

3、929年英國(guó)人費(fèi)萊明發(fā)現(xiàn)青霉素，迅速形成工業(yè)大規(guī)摸生產(chǎn)。1940年英國(guó)人費(fèi)洛里精制分離青霉素醫(yī)治戰(zhàn)傷藥物。發(fā)酵工業(yè)新篇章：發(fā)酵現(xiàn)象釀造食品工業(yè)非食品工業(yè)青霉素抗菌素發(fā)酵工業(yè)氨基酸,核酸發(fā)酵（代謝控制發(fā)酵）基因工程菌動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)藻類(lèi)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。發(fā)酵工程產(chǎn)業(yè)化發(fā)展：發(fā)酵工程技術(shù)給人類(lèi)社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展帶來(lái)了巨大的潛力，涉及到解決人類(lèi)所面臨的食品與營(yíng)養(yǎng)、健康與環(huán)境、資源與能源等重大問(wèn)題 。細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 微生物、動(dòng)植物細(xì)胞、藻類(lèi)細(xì)胞等4代謝控制發(fā)酵技術(shù)5開(kāi)拓發(fā)酵原料時(shí)期6基因工程階段四、發(fā)酵工業(yè)的范圍： 現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)涉及領(lǐng)域按微生物發(fā)酵產(chǎn)品的性

4、質(zhì)分為以下幾個(gè)方面。1 微生物菌體發(fā)酵2微生物酶發(fā)酵：3 微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵4微生物的生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵：生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)反應(yīng)相比優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。5微生物特殊機(jī)制的利用（1）利用微生物消除環(huán)境污染環(huán)境惡化（2）利用微生物發(fā)酵保持生態(tài)平衡（3）微生物濕法冶金：（4）利用基因工程菌株開(kāi)拓發(fā)酵工程新領(lǐng)域五、發(fā)酵工業(yè)的特點(diǎn)1.發(fā)酵原料的選擇2.微生物菌種得選育及擴(kuò)大培養(yǎng)3.發(fā)酵設(shè)備選擇以及工藝條件控制發(fā)酵工藝控制關(guān)鍵：發(fā)酵全過(guò)程的無(wú)菌狀態(tài)的保持，防雜菌污染，設(shè)備沖洗，培養(yǎng)基滅菌，空氣過(guò)濾。4. 發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取5.發(fā)酵廢物的回收和利用 第2章 發(fā)酵培養(yǎng)基第一節(jié) 培養(yǎng)基的類(lèi)型及功能 培養(yǎng)基：

5、是人們提供微生物生長(zhǎng)繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。（人工配制的含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供微生物生長(zhǎng)的介質(zhì)。）發(fā)酵培養(yǎng)基作用：滿足菌體生長(zhǎng)+促進(jìn)產(chǎn)物形成。一、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及來(lái)源1、能源 2、碳源 3、氮源 4、有機(jī)鹽 5、特殊生長(zhǎng)因子 二、培養(yǎng)基的類(lèi)型和用途1、按物質(zhì)來(lái)源分：自然培養(yǎng)基（化學(xué)成分不清楚，異養(yǎng)微生物完全培養(yǎng)基）、合成培養(yǎng)基（化學(xué)成分和數(shù)量已知配制，實(shí)驗(yàn)室用生長(zhǎng)慢）、半合成培養(yǎng)基（天然碳、氮、生長(zhǎng)因子和化學(xué)藥品，多數(shù)微生物使用）合成培養(yǎng)基：由已知組成成分的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組合的培養(yǎng)基叫合成培養(yǎng)基。復(fù)合培養(yǎng)基（天然+半合成）：由一些組成成分不完全明確的天

6、然有機(jī)物與一些無(wú)機(jī)鹽組合的培養(yǎng)基。2、按物理性狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 :適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應(yīng)用于有子實(shí)體的真菌類(lèi)，如香菇、白木耳等的生產(chǎn) 。半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%0.8% ,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營(yíng)養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。 3、按生產(chǎn)工藝用途分：從發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用考慮）孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基，工業(yè)中常用種子和發(fā)酵培養(yǎng)基用生產(chǎn)。（1）孢子培養(yǎng)基：供制備孢子用的。孢子：某一生長(zhǎng)階段中，在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形，卵圓形或圓柱形的

7、休眠體叫孢子。（2）種子培養(yǎng)基：供孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)繁殖用的。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：是供菌體生長(zhǎng)繁殖和合成大量代謝產(chǎn)物用的。三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇： 培養(yǎng)基供菌生長(zhǎng)、繁殖、代謝、合成產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基成分和配比的適合與否影響菌的生長(zhǎng)代謝，對(duì)產(chǎn)物的工藝質(zhì)量和產(chǎn)量影響大。1、選擇和培植發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)考慮的基本原則：（1）、必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分。（2）、有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率。（3）、有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。（4）、有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期。（5）、盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的

8、分離純化。（6）、原料價(jià)格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。（7）、所用原料盡可能減少對(duì)發(fā)酵過(guò)程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率，降低能耗。（8）、有利于產(chǎn)品的分離純化，并盡可能減少產(chǎn)生“三廢”的物質(zhì)。2、工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)基選擇步驟：（1）、了解菌種來(lái)源、生活習(xí)慣，理化特性和營(yíng)養(yǎng)要求。（2）、了解生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件、生物合成代謝途徑、代謝產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、工藝、產(chǎn)品質(zhì)量要求。（3）、選化學(xué)合成培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)每小發(fā)酵罐培養(yǎng)，氮、碳產(chǎn)物代謝能力情況的摸索，選擇適宜的pH值。（4）、確定培養(yǎng)基配比確定金屬（非）離子的影響無(wú)機(jī)要素營(yíng)養(yǎng)要求，按高低、適中進(jìn)行確定做復(fù)合培養(yǎng)基試驗(yàn)做發(fā)酵條件與培養(yǎng)基關(guān)系試驗(yàn)

9、用碳酸鈣調(diào)pH值中間補(bǔ)料法控制碳、氮、養(yǎng)料、前體類(lèi)物質(zhì)代謝引導(dǎo)發(fā)酵向合成產(chǎn)物的途徑發(fā)展。四、配制工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的一般要求：1、營(yíng)養(yǎng)物組成較豐富，濃度適當(dāng)，能滿足菌絲體菌種發(fā)芽和生長(zhǎng)繁殖成大量具有生理功能的需要（產(chǎn)物合成潛力提高）2、在一定條件下，各種原材料彼此不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，理化性相對(duì)穩(wěn)定。3、粘度適中，滲透壓適當(dāng)。4、原材料品種及濃度對(duì)代謝產(chǎn)物生物合成過(guò)程要有利于主產(chǎn)物的生物合成，高產(chǎn)率維持時(shí)間長(zhǎng)，副產(chǎn)物合成率要降至最低。5、不影響發(fā)酵過(guò)程的通氣和攪拌，便于產(chǎn)物的分離純化。6、原材料盡量選質(zhì)優(yōu)價(jià)廉、成本低。 第二節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來(lái)源 培養(yǎng)基原料：C（50%）、N、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、水、

10、生長(zhǎng)因子、前體。一、碳源：（微生物自身細(xì)胞物質(zhì)、糖類(lèi)、脂、蛋白質(zhì)等和能源構(gòu)成菌體的主要元素及各代謝產(chǎn)物的主要原料。）定義：凡是用于構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均稱碳源。功能：提供能量的重要元素。碳源：糖（碳水化合物）、脂肪、有機(jī)酸、醇、碳?xì)浠衔铮N類(lèi)）1、碳水化合物（糖類(lèi)）（1）單糖：葡萄糖（實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基）所有的微生物都能利用葡萄糖；但是會(huì)引起葡萄糖效應(yīng)；工業(yè)上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達(dá)到一定的質(zhì)量指標(biāo)；糖蜜：糖蜜是制糖生產(chǎn)時(shí)的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。 糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達(dá)50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。糖蜜使用的注意點(diǎn)：除糖份外，含有較多的

11、雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進(jìn)行預(yù)處理。（2）雙糖：乳糖、麥芽糖、蔗糖（3）多糖：糊精、淀粉及其水解液，工業(yè)化過(guò)程常用淀粉水解物酶法水解為發(fā)酵糖。 （4）淀粉、糊精：使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類(lèi)缺點(diǎn)：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時(shí)加入一定的-淀粉酶成分比較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源廣泛、價(jià)格低，可以解除葡萄糖效應(yīng)2、脂肪：霉菌和放線菌利用油脂作碳源，其具有消沫和補(bǔ)充碳源的雙重作用。3、無(wú)機(jī)酸、醇：在單細(xì)胞蛋白、氨基酸、維生素、抗生素發(fā)酵中作碳源和補(bǔ)充碳源。4、碳?xì)浠衔铮ㄍ闊N）：微生物表面糖脂吸收系統(tǒng)乳化后利用碳

12、。二、氮源（細(xì)菌、酵母菌氮含量大，霉菌含蛋量低，NH2基存在不提供能量）：指構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中的氮素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。1、主要功能：構(gòu)成微生物細(xì)胞和含氮的代謝產(chǎn)物，補(bǔ)充碳源，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸及抗生素等重要代謝物成分。2、有機(jī)氮源（有碳有氮）：含有蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、游離氨基酸、糖類(lèi)、脂肪、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子。微生物對(duì)這類(lèi)氮源的利用具有選擇性。土霉素生產(chǎn)中玉米漿和氨基酸的利用率增加；選擇有機(jī)氮時(shí)要注意品種、產(chǎn)地、加工方法對(duì)質(zhì)量的影響。3、有機(jī)氮源：氨基酸、蛋白質(zhì)水解物及尿素。4、無(wú)機(jī)氮源（無(wú)碳有氮）：銨鹽、硝酸鹽及氨氣、氯化銨。5、實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等蛋白水

13、解物。6、工業(yè)化生產(chǎn)常用氮源：硫酸銨、尿素、氨水、黃豆粉、花生粉、魚(yú)粉、棉籽粉、玉米漿、酒精水及屠宰場(chǎng)廢水等。氮源使用的一些相關(guān)問(wèn)題：有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源應(yīng)當(dāng)混合使用；早期：容易利用易同化的氮源無(wú)機(jī)氮源；中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)；有些產(chǎn)物會(huì)受氮源的誘導(dǎo)和阻遏例： 蛋白酶的生產(chǎn)有機(jī)氮源選取時(shí)也要考慮微生物的同化能力；開(kāi)發(fā)效果好、有針對(duì)性的有機(jī)氮源仍然是令人感興的課題；三、無(wú)機(jī)鹽和微量元素1、定義：是微生物代謝所需的重要物質(zhì)。2、功能：構(gòu)成菌體成分，作為酶的輔基或激活劑，調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)氧化還原電位、pH值及維持滲透壓。無(wú)機(jī)元素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響： 濃度降低促進(jìn)生長(zhǎng)；濃度提高抑制生長(zhǎng)3、

14、無(wú)機(jī)鹽：磷酸、硫酸鹽、氯化物、鈉、鉀、鈣、鎂、鐵。4、微量元素：一般參與酶的組成或使酶活化。微量元素缺乏，導(dǎo)致細(xì)胞生理活性下降，甚至停止生長(zhǎng)。 P：構(gòu)成菌體核酸、核蛋白及磷脂成分，組成高能磷酸化合物及許多酶的活性基，參與氧化磷酸化反應(yīng)必須元素。Fe：是細(xì)胞色素及其氧化酶的激活劑。Zn（脫氫酶）、Mg（糖化酶）、Co（B2輔酶 ）：是某些酶的輔酶或激活劑。Na：維持細(xì)胞滲透壓。K：影響細(xì)胞膜透性。Ca：調(diào)節(jié)細(xì)胞透性作用。使用注意事項(xiàng)：1、對(duì)于其它渠道有可能帶入的過(guò)多的某種無(wú)機(jī)離子和微量元素在發(fā)酵過(guò)程中必須加以考慮例：鐵離子 青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20g/ml 發(fā)酵罐必須進(jìn)行表面處理使用

15、時(shí)注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)-淀粉酶，P對(duì)酶活的影響 pH 酶活不加 4.25 120分鐘加 K2HPO4 5.45 30分鐘加 KH2PO4 4.62 75分鐘四、生長(zhǎng)因子、消沫劑、前體和產(chǎn)物促進(jìn)劑1、生長(zhǎng)因子：微生物生長(zhǎng)必需而少量的，自身不能合成或少量合成，以滿足機(jī)體生長(zhǎng)需要的有機(jī)化合物，如維生素。功能：構(gòu)成輔酶的組成部分，促進(jìn)生命活動(dòng)進(jìn)行。如維生素B族是各種酶的活性基的組成部分，沒(méi)有維生素B，E就不能活動(dòng)。有機(jī)氮源是這些生長(zhǎng)因子的重要來(lái)源，多數(shù)有機(jī)氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長(zhǎng)不可缺少的生長(zhǎng)因子。 2、消沫劑：工業(yè)化生產(chǎn)中消除發(fā)酵中產(chǎn)生

16、的泡沫，防止逃液和染菌，保證生產(chǎn)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。常用的消沫劑：植物油、動(dòng)物油、高分子化合物。3、前體：在產(chǎn)物的生物合成過(guò)程中，被菌體直接用于產(chǎn)物合成而自身結(jié)構(gòu)無(wú)顯著改變的物質(zhì)稱為前體。前體可自身合成（纈氨酸、半胱氨酸青霉素合成時(shí)用）；外源性前體（苯乙酸青霉素G）青霉素：分子量356 苯乙酸:分子量136 作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份 用法：前體使用時(shí)普遍采用流加的方法 前體一般都有毒性，濃度過(guò)大對(duì)菌體的生長(zhǎng)不利苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07% 前體相對(duì)價(jià)格較高，添加過(guò)多，容易引起揮發(fā)和氧化，流加也有利于提高前體的轉(zhuǎn)化率4、產(chǎn)物促進(jìn)劑 所謂產(chǎn)物促進(jìn)劑是指那些非細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物，又非前體

17、，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。 促進(jìn)劑提高產(chǎn)量的機(jī)制尚不清楚。 有些促進(jìn)劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進(jìn)劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進(jìn)酶的分泌與生產(chǎn)；五、水：是培養(yǎng)基的主要組成成分，是構(gòu)成菌體細(xì)胞的主要成分，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳導(dǎo)介質(zhì)。功能：水是良好的溶劑，菌體所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都是溶解于水中被吸收的。滲透、分泌、排泄等作用都是以水為媒介的，并且水直接參與代謝作用中的許多反應(yīng)。對(duì)于發(fā)酵工廠來(lái)說(shuō)，恒定的水源是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诓煌粗写嬖诘母鞣N因素對(duì)微生物發(fā)酵代謝影響甚大。 水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。 對(duì)于釀造行業(yè)，水

18、的重要性不言而喻。對(duì)于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。六、 影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，生產(chǎn)水平波動(dòng)大，菌體代謝異常等現(xiàn)象。1、原材料質(zhì)量的影響2、水質(zhì)的影響3、滅菌的影響4、其他影響因素 第三節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和優(yōu)化一、培養(yǎng)基成分選擇的原則 菌種的同化能力、代謝的阻遏和誘導(dǎo)1000.22.0、合適的C、N比、pH的要求 二、培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的；合理的實(shí)驗(yàn)方法：多因子實(shí)驗(yàn)；多因子實(shí)驗(yàn)：均勻設(shè)計(jì)、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析等；在篩選培養(yǎng)基中使用的原材料種類(lèi)和濃度配比時(shí)，經(jīng)常采用的方法：?jiǎn)我蜃釉囼?yàn)法、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)。1、單因

19、子試驗(yàn)法：適用培養(yǎng)基組成和單一營(yíng)養(yǎng)成分的選擇（費(fèi)時(shí)，準(zhǔn)確性低）2、均勻試驗(yàn)法：試驗(yàn)點(diǎn)均勻分散特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組數(shù)與因素的水平數(shù)相同，試驗(yàn)結(jié)果分析采用計(jì)算機(jī)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸系統(tǒng)處理，求得一回歸方程定量預(yù)測(cè)最優(yōu)的條件和結(jié)果，最佳培養(yǎng)基組成和濃度由菌種的生長(zhǎng)情況、C/N代謝規(guī)律、pH值變化、產(chǎn)物合成速率決定。3、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì): 是研究多因素多水平的又一種設(shè)計(jì)方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是分式析因設(shè)計(jì)的主要方法。是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。三、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的步驟 根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)基成分確定

20、時(shí)一些必須考慮； 的問(wèn)題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分； 通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分； 當(dāng)培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問(wèn)題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)常采用一些合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。 例1：類(lèi)胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化原培養(yǎng)基: 初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進(jìn)一步：乙酸鈉的濃度2%比較好結(jié)果：碳源：乙酸鈉 0. 2%；氮源：氯化銨 0.2%； 酵母膏0.03%；無(wú)機(jī)鹽: 復(fù)合無(wú)機(jī)鹽0.05%例2：正交設(shè)計(jì)確定優(yōu)化的配方 例3： 發(fā)酵培養(yǎng)基改進(jìn)后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果

21、；搖瓶水平到反應(yīng)器水平的優(yōu)化配方；搖瓶、反應(yīng)器培養(yǎng)基研究的兩個(gè)層次；搖瓶培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的第一步；反應(yīng)器最終的優(yōu)化的基礎(chǔ)配方 第三章 工業(yè)發(fā)酵的染菌及滅菌第一節(jié) 發(fā)酵染菌的危害發(fā)酵染菌能給生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重危害，防止雜菌污染是任何發(fā)酵工廠的一項(xiàng)重要工作內(nèi)容。尤其是無(wú)菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。 所謂“雜菌”， 是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)，都有可能遭受雜菌的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)。一，染菌對(duì)不同品種發(fā)酵的影響青霉素；疫苗；檸檬酸；谷氨酸；肌苷、肌苷酸；酶制劑二，不同種類(lèi)的雜菌對(duì)發(fā)酵的影響青霉素發(fā)酵

22、：污染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大；鏈霉素發(fā)酵：污染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大；四環(huán)素發(fā)酵：污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大；檸檬酸發(fā)酵：最怕污染青霉菌；肌苷、肌苷酸發(fā)酵：污染芽孢桿菌的危害最大；谷氨酸發(fā)酵：最怕污染噬菌體；高溫淀粉酶發(fā)酵：污染芽孢桿菌和噬菌體的危害較大；三，不同染菌時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響種子培養(yǎng)期染菌、發(fā)酵前期染菌、發(fā)酵中期染菌及發(fā)酵后期染菌。四，不同染菌途徑對(duì)發(fā)酵的影響種子帶菌：種子帶菌可使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性；空氣帶菌：空氣帶菌也使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性，導(dǎo)致染菌范圍擴(kuò)大至所有發(fā)酵罐；培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底：一般為孤立事件，不具有延續(xù)性；設(shè)備滲漏：這種

23、途徑造成染菌的危害性較大；五，染菌對(duì)產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響對(duì)過(guò)濾的影響：發(fā)酵液的粘度加大；菌體大多自溶；由于發(fā)酵不徹底，基質(zhì)的殘留濃度增加；造成的后果：過(guò)濾時(shí)間拉長(zhǎng)，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞生產(chǎn)平衡；大幅度降低過(guò)濾收率；對(duì)提取的影響有機(jī)溶劑萃取工藝：染菌的發(fā)酵液含有更多的水溶性蛋白質(zhì)，易發(fā)生乳化，使水相和溶劑相難以分開(kāi)。離子交換工藝：雜菌易粘附在離子交換樹(shù)脂表面或被離子交換樹(shù)脂吸附，大大降低離子交換樹(shù)脂的交換量。對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響對(duì)內(nèi)在質(zhì)量的影響：染菌的發(fā)酵液含有較多的蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。對(duì)產(chǎn)品的純度有較大影響。對(duì)產(chǎn)品外觀的影響：一些染菌的發(fā)酵液經(jīng)處理過(guò)濾后得到澄清的發(fā)酵液，放置后會(huì)出現(xiàn)混濁，影

24、響產(chǎn)品的外觀。六，染菌對(duì)三廢處理的影響使過(guò)濾后的廢菌體無(wú)法利用；發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費(fèi)用和時(shí)間第二節(jié) 發(fā)酵過(guò)程中染菌的檢查判斷一、染菌的檢查與判斷 目前生產(chǎn)上常用的雜菌檢查方法有：顯微鏡檢查：染色 ； 鏡檢平板劃線檢查：到平板空培養(yǎng)待測(cè)樣品劃線培養(yǎng)觀察。酚紅肉湯培養(yǎng)檢查：無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基空培養(yǎng) 接入樣品 培養(yǎng)觀察1、顯微鏡檢查（鏡檢）：革蘭氏染色法2、平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法3、肉湯培養(yǎng)檢查法判斷發(fā)酵是否染菌應(yīng)以無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果為根據(jù)無(wú)菌試驗(yàn)的目的：1，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及附屬設(shè)備滅菌是否徹底；2，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中是否有雜菌從外界侵入；3，了解整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中是否存

25、在染菌的隱患和死角；二，各種檢查方法的比較顯微鏡檢查方法簡(jiǎn)便、快速，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)雜菌，但由于鏡檢取樣少，視野的觀察面也小，因此不易檢出早期雜菌。平板劃線法和肉湯培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)是需經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)(一般要過(guò)夜)才能判斷結(jié)果，且操作較繁瑣，但它要比顯微鏡能檢出更少的雜菌，而且結(jié)果也更為準(zhǔn)確；三，雜菌檢查中的問(wèn)題檢查結(jié)果應(yīng)以平板劃線和肉湯培養(yǎng)結(jié)果為主要根據(jù)；平板劃線和肉湯培養(yǎng)應(yīng)做三個(gè)平行樣；要定期取樣；酚紅肉湯和平板劃線培養(yǎng)樣品應(yīng)保存至放罐后12小時(shí)，確定為無(wú)菌時(shí)方可棄去；取樣時(shí)防止外界雜菌混入的措施；表4-1四，發(fā)酵異常現(xiàn)象判斷是否染菌 除了以上的方法外，在實(shí)際生產(chǎn)中還可以根據(jù)以下參數(shù)的異常變化來(lái)判斷

26、是否染菌溶解氧、pH值、尾氣中CO2含量1、發(fā)酵異?，F(xiàn)象判斷是否染菌：溶解氧、pH、二氧化碳含量及菌體酶活力。溶氧濃度（谷氨酸發(fā)酵時(shí)）谷氨酸發(fā)酵時(shí)止常利J異常的溶解氧曲線正常發(fā)酵溶解氧曲線；異常發(fā)酵溶解氧曲線；··一異常發(fā)酵光密度曲線發(fā)酵初期：菌體適應(yīng)期溶氧濃度不變耗氧量 染好氧雜菌溶解氧接近于0發(fā)酵中期：菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期溶氧濃度耗氧量 染厭氧雜菌溶解氧耗氧量發(fā)酵后期：菌體衰老期溶氧濃度耗氧量 2）二氧化碳的含量雜菌染菌糖耗二氧化碳含量；噬菌體染菌糖耗二氧化碳含量耗氣性發(fā)酵排氣中二氧化碳含量與糖代謝有關(guān)。第三節(jié) 發(fā)酵染菌和染菌原因分析一、發(fā)酵染菌率發(fā)酵染菌率：定義：指一年內(nèi)發(fā)

27、酵染菌的批數(shù)與總投料發(fā)酵批數(shù)之比。 總?cè)揪剩ㄒ荒陜?nèi)） = 發(fā)酵染菌批數(shù) / 總投料批數(shù) ×100%發(fā)酵染菌率以發(fā)酵罐染菌批（次）為基準(zhǔn)，染菌罐批（次）應(yīng)包括染菌重消后的重復(fù)染菌的罐批（次）在內(nèi)。設(shè)備染菌率：統(tǒng)計(jì)發(fā)酵罐或其他設(shè)備的染菌率，有利于查找因設(shè)備缺陷而造成的染菌原因不同品種發(fā)酵的染菌率：統(tǒng)計(jì)不同品種發(fā)酵的染菌率，有助于查找不同品種發(fā)酵染菌的原因。不同發(fā)酵階段的染菌率：將整個(gè)發(fā)酵周期分成前期、中期和后期三個(gè)階段，分別統(tǒng)計(jì)其染菌率。有助于查找染菌的原因。季節(jié)染菌率：統(tǒng)計(jì)不同季節(jié)的染菌率，可以采取相應(yīng)的措施制服染菌。操作染菌率：統(tǒng)計(jì)操作工的染菌率，分析染菌原因，考核操作工滅菌操作技

28、術(shù)水平。二、發(fā)酵染菌和染菌原因分析 避免在發(fā)酵生產(chǎn)中污染雜菌應(yīng)以預(yù)防為主?！胺乐赜谥巍?，事前防止勝于事后挽救。 如果一旦發(fā)生染菌現(xiàn)象就要盡快找出原因及時(shí)糾正、堵塞漏洞才能減少損失，并從中吸取經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，避免以后有類(lèi)似情況發(fā)生，保持生產(chǎn)的正常進(jìn)行。但在發(fā)酵生產(chǎn)中，往往因?yàn)樯a(chǎn)過(guò)程的環(huán)節(jié)很多，同時(shí)各工廠的生產(chǎn)設(shè)備、產(chǎn)品種類(lèi)和管理措施不盡相同，引起染菌的原因比較復(fù)雜，有時(shí)不能及時(shí)找出而耽誤了生產(chǎn)。151、國(guó)外一抗生素發(fā)酵染菌原因的分析 2、國(guó)內(nèi)一制藥廠發(fā)酵染菌原因的分析 國(guó)外一抗生素發(fā)酵染菌原因的分析國(guó)內(nèi)一制藥廠發(fā)酵染菌原因的分析染菌原因百分率%染菌原因百分率%染菌原因百分率%染菌原因百分率%種子帶菌

29、9.64蛇管穿孔5.89外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料帶入）8.20操作違反規(guī)程1.60接種時(shí)罐壓跌零0.19接種管穿孔0.39設(shè)備穿孔7.60種子帶菌0.60培養(yǎng)基滅菌不透0.79閥門(mén)泄漏1.45空氣系統(tǒng)帶菌26.00原因不明35.00空氣系統(tǒng)帶菌19.96罐蓋漏1.54停電罐壓跌零1.60攪拌軸密封泄漏2.09其他設(shè)備漏10.13接種11.00泡沫冒頂0.48操作問(wèn)題10.15蒸汽壓力不夠或蒸汽量不足0.60夾套穿孔12.36原因不明24.91管理問(wèn)題7.09 3，從染菌的規(guī)模幅度來(lái)分析染菌原因 大批（多個(gè)）發(fā)酵罐染同一種菌：空氣系統(tǒng)問(wèn)題 部分發(fā)酵罐(或罐組)染菌：前期可能是種子帶雜菌，或滅菌不

30、徹底，中后期則可能是中間補(bǔ)料系統(tǒng)或油管路系統(tǒng)發(fā)生問(wèn)題所造成的個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備問(wèn)題(如閥門(mén)的滲漏或罐體腐蝕磨損)，設(shè)備的腐蝕磨損所引起的染菌會(huì)出現(xiàn)每批發(fā)酵的染菌時(shí)間向前推移的現(xiàn)象個(gè)別發(fā)酵罐偶然染菌：原因比較復(fù)雜，因?yàn)楦鞣N染菌途徑都可能引起。 4，從染菌的時(shí)間來(lái)分析發(fā)酵前期：種子、無(wú)菌空氣 、培養(yǎng)基、設(shè)備滅菌不徹底、 接種操作不當(dāng)、設(shè)備或管道有死角。發(fā)酵后期：中間補(bǔ)料、操作不合理問(wèn)題、設(shè)備滲漏。5，從染菌的類(lèi)型來(lái)分析淺綠色菌落(革蘭氏陰性桿菌) ：發(fā)酵罐的冷卻管、夾套滲漏或水污染。 耐熱性芽孢桿菌：死角、培養(yǎng)基、設(shè)備滅菌不徹底。 球菌、酵母、不耐熱無(wú)芽孢桿菌：可能是從蒸汽的冷凝水或空氣中帶

31、來(lái)的、種子帶菌、設(shè)備滲漏、操作問(wèn)題。 霉菌：無(wú)菌室及滅菌不徹底或操作不嚴(yán)格問(wèn)題第四節(jié) 發(fā)酵雜菌污染途徑及防止一、種子帶菌的原因及防止1、種子帶菌原因問(wèn)題培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底，滅菌溫度達(dá)不到要求。菌種在移接過(guò)程，操作和管理不當(dāng)。菌種在培養(yǎng)過(guò)程或保藏過(guò)程中外界空氣和雜菌進(jìn)入（試管有長(zhǎng)度、緊度，應(yīng)恒溫，嚴(yán)檢）無(wú)菌室的無(wú)菌條件不符合要求。2，種子帶菌的防止種子帶雜菌是發(fā)酵前期染菌的原因之一。在每次接種后應(yīng)留取少量的種子懸浮液進(jìn)行平板、肉湯培養(yǎng)，借以說(shuō)明是否是種子中帶雜菌。種子培養(yǎng)的設(shè)備和裝置有無(wú)菌室、滅菌鍋和搖瓶機(jī)等。（1）無(wú)菌室無(wú)菌室的基本要求：無(wú)菌室面積不宜過(guò)大，一般約46米2高約26米。 為了

32、減少外界空氣的侵入，無(wú)菌室要有13個(gè)套間(緩沖過(guò)道) 無(wú)菌室內(nèi)部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無(wú)裂縫，墻角最好做成形 。室內(nèi)布置應(yīng)盡量簡(jiǎn)單，最好能安裝空氣調(diào)節(jié)裝置，通入無(wú)菌空氣并調(diào)節(jié)室內(nèi)的溫濕度。 無(wú)菌室的每個(gè)套間一般都用紫外線滅菌?；瘜W(xué)滅菌藥劑： 用作噴灑或揩擦的(以揩擦為主) ： 75%酒精;0.25%新潔而滅(季胺鹽)；0.61%漂白粉；0.5%石炭酸；0.5%過(guò)氧乙酸；1%煤酚皂(來(lái)蘇爾)；0.5%高錳酸鉀；300單位毫升土霉素；50單位毫升制霉菌素等 。用作熏蒸：甲醛(每立方米空間約用10毫升)或硫磺(每立方米空間約用2-3克)。 （2）培養(yǎng)基要求無(wú)原料性狀（顆粒、結(jié)塊等

33、）及原料無(wú)發(fā)霉變質(zhì)現(xiàn)象出現(xiàn)。（3）種子培養(yǎng)基滅菌滅菌操作時(shí)需要注意排氣管是否暢通 ；固體培養(yǎng)基可采用兩次滅菌的方法；通入蒸汽后使瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基溫度達(dá)到121ºC所需的時(shí)間與瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的體積有關(guān) 。二、設(shè)備滅菌不徹底：1、實(shí)罐滅菌未充分排除罐內(nèi)空氣，造成“假壓”，使罐頂空間局部溫度達(dá)不到要求開(kāi)排氣閥使蒸汽透過(guò)所有管線徹底滅菌。2、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時(shí)，蒸汽壓力波動(dòng)大，達(dá)不到滅菌溫度自控裝置。3、設(shè)備管道存在“死角”，引起蒸汽不能有效到達(dá)或不能充分到達(dá)預(yù)定到達(dá)的局部滅菌部位形成不徹底滅菌部位“死角”。4、設(shè)備滲漏引起染菌及防止：砂眼（腐蝕）裂縫（振動(dòng)）選優(yōu)質(zhì)材料。5、操作問(wèn)題：移料+罐壓=0，外

34、界空氣進(jìn)入+泡沫頂蓋+壓縮空氣壓力突降+發(fā)酵液倒流入空氣過(guò)濾器高度責(zé)任心+管理+高素質(zhì)。三、發(fā)酵設(shè)備、管件的滲漏與配置設(shè)備和管件的滲漏一般是指設(shè)備和管件由于腐蝕、內(nèi)應(yīng)力或其他原因形成微小漏孔所發(fā)生的滲漏現(xiàn)象。這些漏孔很小，特別是不銹鋼材料形成的漏孔更小，有時(shí)肉眼不能直接覺(jué)察，需要通過(guò)一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn)。1，設(shè)備滲漏的原因發(fā)酵液中腐蝕性物質(zhì)對(duì)設(shè)備的腐蝕；設(shè)備加工不良；彎管時(shí)，彎頭處管壁變??；焊接不良；2，盤(pán)管滲漏的防止放罐后要認(rèn)真清洗發(fā)酵罐；控制冷卻水質(zhì)量，降低其中氯離子含量；對(duì)盤(pán)管定期檢查、試漏，及時(shí)發(fā)現(xiàn)漏隙； 3，空氣分布管滲漏的防止空氣帶菌：空氣凈化設(shè)備、流程、過(guò)濾介質(zhì)選用和裝填、介質(zhì)

35、滅菌管理等。4，罐體滲漏的防止5，管件的滲漏 與發(fā)酵罐相連接的管路很多，有空氣、蒸汽、水、物料、排氣、排污等管路，管路多，相應(yīng)的管件和閥門(mén)也多。管道的連接方式、按裝方法以及選用的閥門(mén)形式對(duì)防止污染有很大的關(guān)系。所以，與發(fā)酵有關(guān)的管路不能同一般化工廠的化工管路完全一樣，而有其特殊的要求。四、發(fā)酵罐與管件的死角 所謂死角是指滅菌時(shí)因某些原因使滅菌溫度達(dá)不到或不易達(dá)到的局部地區(qū)。發(fā)酵罐及其管路如有死角存在，則死角內(nèi)潛伏的雜菌不易殺死，會(huì)造成連續(xù)染菌，影響生產(chǎn)的正常進(jìn)行。1，法蘭連接的死角 發(fā)酵工廠的有關(guān)管路要保持光滑、通暢、密封性好，以避免和減少管道染菌的機(jī)會(huì)。例如法蘭與管子焊接時(shí)受熱不勻使法蘭翹曲

36、密封面發(fā)生凹凸不平現(xiàn)象就會(huì)造成死角(圖78c)。墊片的內(nèi)圓比法蘭內(nèi)徑大或比較小以及安裝時(shí)沒(méi)有對(duì)準(zhǔn)中心也會(huì)造成死角(圖78a、b)。 2，渣滓在罐底與用環(huán)式空氣分布管所形成的死角 3，不銹鋼襯里的死角 4，接種管路的死角 采用種子罐時(shí)是利用壓力差將種子罐中培養(yǎng)好的種子輸入發(fā)酵罐內(nèi)，種子罐與發(fā)酵罐的一段連接管路的滅菌是與發(fā)酵罐的滅菌同時(shí)進(jìn)行的。如下圖所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以應(yīng)在閥1的半截上裝設(shè)旁通，焊上一個(gè)小的放氣閥，此段管路即可得到蒸汽的充分滅菌。 5，排氣管的死角 罐頂排氣管彎頭處如有堆積物，其中窩藏的雜菌不容易徹底消滅，而當(dāng)發(fā)酵時(shí)受攪拌的震動(dòng)和排氣的沖擊就會(huì)一點(diǎn)點(diǎn)地剝落下來(lái)

37、造成污染。另外排氣管的直徑太大，滅菌時(shí)蒸汽流速小也會(huì)使管中部分耐熱菌不能全部殺死。所以排氣管要與罐的尺寸有一定比例，不宜過(guò)大或過(guò)小。 6，不合理補(bǔ)料管配置造成的死角 7，壓力表安裝不合理形成的死角五、染菌后的挽救措施 種子培養(yǎng)或種子罐中發(fā)現(xiàn)污染 。發(fā)酵早期染菌可以適當(dāng)添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，重新滅菌后再接種發(fā)酵。 中后期染菌，如果雜菌的生長(zhǎng)將影響發(fā)酵的正常進(jìn)行或影響產(chǎn)物的提取時(shí)，應(yīng)該提早放罐。 有些發(fā)酵染菌后發(fā)酵液中的碳、氮源還較多，如果提早放罐，這些物質(zhì)會(huì)影響后處理提取使產(chǎn)品取不出，此時(shí)應(yīng)先設(shè)法使碳、氮源消耗，再放罐提取。有時(shí)發(fā)酵罐偶而染菌，原因一時(shí)又找不出，一般可以采取以下措施：(1)連續(xù)滅菌系統(tǒng)前

38、的料液貯罐在每年4!10月份(雜菌較旺盛生長(zhǎng)的時(shí)間)加入0.2%甲醛，加熱至80°C，存放處理4小時(shí)，以減少帶入培養(yǎng)液中的雜菌數(shù)。(2)對(duì)染菌的罐，在培養(yǎng)液滅菌前先加甲醛進(jìn)行空消處理。甲醛用量：0.120.17L/m3罐體積。(3)對(duì)染菌種子罐罐內(nèi)放水滅菌，滅菌后水量占罐體的2/3以上。細(xì)菌芽孢較耐干熱而不耐濕熱的緣故。六、制服染菌對(duì)發(fā)酵過(guò)程的要求1、對(duì)空氣凈化系統(tǒng)的要求。2、對(duì)蒸汽要求。3、對(duì)設(shè)備的要求。4、對(duì)工藝的要求。第五節(jié) 滅菌培養(yǎng)基+設(shè)備+空氣滅菌防止發(fā)酵過(guò)程染菌+保證生產(chǎn)。染菌：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗+抑制產(chǎn)生菌生長(zhǎng)+改變培養(yǎng)液性質(zhì)+產(chǎn)生破壞代謝產(chǎn)物的酶類(lèi)。 一、 滅菌的方法滅菌：

39、指用化學(xué)的或物理學(xué)的方法殺滅或除掉物料或設(shè)備中所有的有生命的有機(jī)體的技術(shù)或工藝過(guò)程。工業(yè)常用的滅菌方法：化學(xué)物質(zhì)滅菌；熱滅菌；輻射滅菌；過(guò)濾介質(zhì)除菌。（一）、消毒和滅菌的區(qū)別： 消毒：用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病原微生物。（殺死引起感染的微生物）或（用物理、化學(xué)方法除去表面的致病微生物）滅菌：用物理、化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物。（殺死一切微生物）消毒不一定滅菌（無(wú)菌態(tài)）；滅菌無(wú)菌態(tài)（可消毒）（二）、常用的滅菌方法1、干熱滅菌法干熱滅菌法 一般認(rèn)為繁殖型細(xì)胞在100 以上干熱1小時(shí)即被殺死。耐熱性細(xì)菌芽胞在120以下長(zhǎng)是時(shí)間加熱也不死亡，介140前后則殺菌效率急劇增長(zhǎng)。所

40、以，關(guān)于干熱滅菌條件，有的藥典規(guī)定為1801小時(shí)以上，有的藥典規(guī)定為16017024小時(shí)，此僅是大至的標(biāo)準(zhǔn)而已.2、濕熱滅菌1）濕熱滅菌定義：借助蒸汽釋放的熱能使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。2）優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源容易，操作無(wú)毒。穿透力強(qiáng)，滅菌徹底。具有很大的潛熱，蒸汽冷卻的水有利于滅菌。蒸汽輸送可借助于本身的壓力。經(jīng)濟(jì)快捷。3）濕熱滅菌的原理：在有水分存在的情況下，蛋白質(zhì)更易受熱而發(fā)生不可逆的凝固變性。3、輻射滅菌1）定義：利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來(lái)殺滅微生物。2）紫外線對(duì)芽孢和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞都能起作用的波長(zhǎng)范圍：250270nm

41、殺菌率高。3）放射性同位素CO60，密封包裝滅菌（產(chǎn)品成品包裝的滅菌）4、化學(xué)物質(zhì)滅菌1）定義：化學(xué)物質(zhì)用于消毒和防腐。2）作用：藥物易與細(xì)胞中的某些成分起化學(xué)反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性而殺滅微生物。3）適用范圍：藥殘難除，易于蛋白質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，不適合培養(yǎng)基滅菌，只適合于局部空間或某些器械的消毒。4）化學(xué)藥品：高錳酸鉀：氧化蛋白質(zhì)、氨基酸，濃度為0.10.25%;次氯酸鈉（漂白粉）：強(qiáng)烈氧化作用;75%酒精：細(xì)胞脫水作用，使乙醇分子進(jìn)入蛋白質(zhì)的肽鍵空間，引起蛋白質(zhì)變性或沉淀。范圍為皮膚和器具表面殺菌。新潔爾滅和杜滅芬：陽(yáng)離子表面活性劑與微生物菌體表面結(jié)合，引起菌外膜損傷和蛋白

42、變性。對(duì)芽孢無(wú)滅菌作用。范圍：器具和環(huán)境。使用濃度：0.25%（5%加水稀釋20倍）。甲醛：還原作用殺菌，與蛋白質(zhì)氨基結(jié)合使其變性。37%甲醛溶液稱為福爾馬林。范圍：無(wú)菌室和車(chē)間空間消毒。戊二醛：應(yīng)用廣泛，使用范圍為堿性條件下殺死孢子，濃度為2%。范圍：器具和儀器。過(guò)氧乙酸：強(qiáng)氧化劑，對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌、真菌（孢子）、病毒起作用；殺菌濃度0.01%；無(wú)害濃度0.2%；-40仍可殺菌，有腐蝕性。酚類(lèi)：有毒性，水溶性差，污染環(huán)境。濃度為0.10.15%，15分鐘滅大腸桿菌。抗生素：抑菌滅菌劑，有選擇性（細(xì)菌）。二 培養(yǎng)基濕熱滅菌（一）、影響培養(yǎng)基滅菌的因素1、培養(yǎng)基成分：油脂越高，糖類(lèi)越高，蛋白質(zhì)的濃度越

43、高，都會(huì)使微生物的耐熱性增高。2、pH值：pH值為6.08.0，微生物耐熱性好；pH值<6.0滅菌時(shí)間3、培養(yǎng)基中的顆粒：顆粒越大，滅菌越難，反之，越易。顆粒小于1mm 培養(yǎng)基無(wú)影響。4、泡沫：培養(yǎng)基形成泡沫對(duì)滅菌極為不利，因?yàn)榕菽械目諝庑纬筛魺釋?，使傳熱困難，熱量很難穿透去殺滅空氣中的微生物。解決辦法加消泡劑。（二）、培養(yǎng)基滅菌方式1、分批滅菌（實(shí)罐滅菌）：將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，用直接蒸汽加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后，維持一定時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度，這一工藝稱為分批滅菌或?qū)嵐逌缇?。適用于小批量生產(chǎn)，固體顆粒培養(yǎng)基，產(chǎn)泡沫多時(shí)采用。通常必須滅菌條件：110-130，5

44、-20分鐘，培養(yǎng)液滅菌采用高溫短時(shí)加熱的方式。2、連續(xù)滅菌：培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過(guò)一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過(guò)程稱為連續(xù)滅菌。 使用于大規(guī)模生產(chǎn)、小顆粒液體培養(yǎng)基，產(chǎn)少量泡沫。 利用板式換熱器進(jìn)行連續(xù)滅菌的流程圖，其流程的能量利用較合理。 三 空氣除菌（一）、空氣中的微生物：好氧性微生物的生長(zhǎng)繁殖和形成代謝產(chǎn)物都需要消耗氧氣。1、大氣空氣：塵埃+沙土+各種各樣的微生物;2、空氣中懸浮的微生物一般為：103104個(gè)/立方米;3、空氣除菌的目的為除去或殺滅空氣中的微生物;4、空氣中的微生物：細(xì)菌、細(xì)菌芽孢、酵母、霉菌、放線菌及噬菌體?？諝庠谝M(jìn)發(fā)酵罐之前必須進(jìn)行嚴(yán)格

45、處理，除去其中含有的微生物和其他有害成分;（二）、空氣除菌方法：1、加熱滅菌：可用蒸汽、電能、空氣壓縮機(jī)產(chǎn)生的熱量進(jìn)行滅菌。2、電除塵：含有灰塵和微生物的空氣通過(guò)高壓氣流電場(chǎng)，正極電場(chǎng)強(qiáng)度>1000V/cm2時(shí)，氣體產(chǎn)生電離，產(chǎn)生的離子使灰塵和微生物等成為載電體，被捕集與電極上。3、介質(zhì)過(guò)濾除菌：經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì)過(guò)濾層，將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì)層中，而達(dá)到除菌目的。1）絕對(duì)過(guò)濾：介質(zhì)的之間的空隙小于被濾除的微生物，當(dāng)空氣流過(guò)介質(zhì)層后，空氣的微生物被濾除。節(jié)約能量和時(shí)間，操作簡(jiǎn)便。微孔濾膜（孔徑小于0.5nm）；纖維介質(zhì)：纖維素膜微孔濾膜2）深層過(guò)濾：以纖維狀（玻璃纖維）+顆粒狀（

46、活性炭）介質(zhì)過(guò)濾層 用超玻璃纖維，聚乙烯醇等為介質(zhì)的過(guò)濾層3）影響介質(zhì)過(guò)濾效率的主要因素：顆粒性質(zhì)、介質(zhì)性質(zhì)（介質(zhì)填充長(zhǎng)度L、介質(zhì)填充密度和介質(zhì)纖維直徑）和氣流速度.4）空氣過(guò)濾器：A、纖維狀或顆粒介質(zhì)過(guò)濾器：特點(diǎn)：過(guò)濾層厚度L體積V壓力降P操作麻煩。介質(zhì)：棉花（上下）、玻璃纖維、活性炭（中）B、過(guò)濾紙類(lèi)過(guò)濾器：以微孔濾紙、濾板、濾棒構(gòu)成的過(guò)濾器。特點(diǎn)：阻力、壓力降低，強(qiáng)度下降;介質(zhì)：超細(xì)玻璃纖維、聚乙烯醇制成旋風(fēng)式或套管式;5）、空氣過(guò)濾除菌的工藝流程 空氣凈化工藝流程圖1空氣吸氣口；2粗過(guò)濾器；3空氣壓縮機(jī)；4一級(jí)空氣冷卻器；STh級(jí)空氣冷卻器；6分水器；7空氣貯罐；8旋風(fēng)分離器；9絲網(wǎng)除

47、沫器；10空氣加熱器8 11總空氣 過(guò)濾器；12分過(guò)濾器無(wú)菌空氣制備控制要點(diǎn)：提高空氣入口潔凈度（加粗過(guò)濾和增高吸氣口高度） 防壓縮空氣中夾帶的油水，影響無(wú)菌空氣質(zhì)量（壓縮機(jī)出口空氣要升溫至120150）第四章 生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)與保藏 第一節(jié) 種子制備的過(guò)程（菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)）種子制備一般包括兩個(gè)過(guò)程，即在固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量孢子的孢子制備過(guò)程和在液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲的種子制備過(guò)程。種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。 種子擴(kuò)培的目的：接種量的需要；菌

48、種的馴化；縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平。一、工業(yè)對(duì)微生物的要求1、能在廉價(jià)原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)并生成所需的代謝生產(chǎn)物，產(chǎn)量高。2、可以在易于控制的培養(yǎng)條件下，迅速生長(zhǎng)和發(fā)酵，且所需酶活力高。3、生長(zhǎng)速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期短。4、根據(jù)代謝控制的要求，選擇單產(chǎn)高的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株或調(diào)節(jié)突變株或野生菌株。5、選育抗噬菌體能力強(qiáng)的菌株，使其不易感染噬菌體。6、菌種純粹，其不易變異退化，以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。7、菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素（包括抗生素、激素、毒素等），以保證安全。二、工業(yè)常用的微生物三、種子制備的過(guò)程大致可分為： 實(shí)驗(yàn)室種子制備階段; 生產(chǎn)車(chē)

49、間種子制備階段 實(shí)驗(yàn)室種子的制備實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式 對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡(jiǎn)便，不易污染雜菌。 對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。 四、孢子制備孢子制備是種子制備的開(kāi)始，是發(fā)酵生產(chǎn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。（一）放線菌孢子的制備1、放線菌的孢子培養(yǎng)常采用：瓊脂斜面培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基成分要求：C：1%；N：0.5%C造成生理酸性環(huán)境孢子形成;N菌絲繁殖孢子形成干燥和限制營(yíng)養(yǎng)是直接或間接誘導(dǎo)孢子形成的原因。3、放線菌斜面培養(yǎng)：T：28；514天。4、放線菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝過(guò)程 節(jié)約菌種用量，

50、易控孢子質(zhì)量菌種母斜面（孢子）子斜面（孢子）搖瓶種子（菌絲）種子罐發(fā)酵罐 防菌種變異5、成分：麩皮、豆汁、蛋白胨、無(wú)機(jī)鹽（二）霉菌孢子的制備1、霉菌的孢子培養(yǎng)成分：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品。2、霉菌培養(yǎng)條件：T：2528，培養(yǎng)414天。（三）、細(xì)菌孢子的制備：1、細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基：多采用碳源限量而氮源豐富的配方。CN牛肉膏、蛋白胨2、培養(yǎng)條件：T多37；T少28；培養(yǎng)12天；產(chǎn)孢510天五、種子制備生產(chǎn)車(chē)間種子制備 ：實(shí)驗(yàn)室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時(shí)還需供

51、給足夠的無(wú)菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。 1、一級(jí)種子：孢子（或搖瓶菌絲）被接入到體積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級(jí)種子。2、二級(jí)種子：把一級(jí)種子轉(zhuǎn)入到體積較大種子罐內(nèi)發(fā)酵，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量菌絲，這樣的種子稱為二級(jí)種子。3、二級(jí)發(fā)酵：把一級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為二級(jí)發(fā)酵。4、三級(jí)發(fā)酵：把二級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為三級(jí)發(fā)酵。（50噸罐）5、種子罐的作用：主要是使孢子發(fā)芽，生長(zhǎng)繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。6、種子罐級(jí)數(shù)：決定菌種的性質(zhì)和菌體生長(zhǎng)速度及發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用。種子

52、罐級(jí)數(shù)取決于： 種子的性質(zhì)（生長(zhǎng)繁殖性能）； 孢子瓶中孢子的密度（密度大則級(jí)數(shù)少）； 孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度； 發(fā)酵罐中種子的最低接種量； 種子罐與發(fā)酵罐的容積比；細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵 孢子懸浮液一級(jí)種子罐（27C,40小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級(jí)種子罐（ 27C,1024小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐 放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子7、確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題：種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì)種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，

53、降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì)雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。 8、種子制備的目的：形成一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體。9、發(fā)酵目的：獲得大量發(fā)酵產(chǎn)物。六、種子擴(kuò)大培養(yǎng)1、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的：就是要為每只發(fā)酵罐的投料，提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。2、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)：不但要得到純而壯的培養(yǎng)菌，而且要獲得活力旺盛，足夠量的培養(yǎng)物。七、工業(yè)微生物的培養(yǎng)類(lèi)型1、工業(yè)微生物的培養(yǎng)方法：靜置培養(yǎng)、通氣培養(yǎng) 靜置培養(yǎng)法：將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行發(fā)酵，又稱為嫌氣性發(fā)酵。通氣培養(yǎng)法：其生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌屬多，它的生長(zhǎng)的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長(zhǎng)和發(fā)酵，又稱為好氣性發(fā)酵。2、種子擴(kuò)大培養(yǎng)階段1)液體培養(yǎng)法：試管+搖床;2)表面培養(yǎng)法：茄子瓶、克氏瓶、瓷盤(pán);3)固體培養(yǎng)法：三角瓶、培養(yǎng)皿;A、固體培養(yǎng)：曲法培養(yǎng)：淺盤(pán)固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)（固體曲霉活性高）深層固體通風(fēng)制曲：在曲房周?chē)醚h(huán)的冷卻增濕的無(wú)菌空氣來(lái)控制溫度和濕度，靈活調(diào)節(jié)適應(yīng)菌種不同的生理需要。