推薦慢病毒包裝簡介及應用

1、慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應用一、慢病毒包裝簡介及其用途慢病毒(Lentivirus)載體是以 HIV-1(人類免疫缺陷 I 型病毒)為根底開展起來的基因治療載體.區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染水平.慢病毒載體的研究開展得很快,研究的也非常深入.該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而到達持久性表達.在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、月中瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞,從而到達良好的的基因治療效果,在美國已經(jīng)開展了臨床研究,效果非常理想,因此具有廣闊的應用前景.目前慢病毒也被廣泛地應用于表達 RNAi 的研究中.由于有些類型細胞

2、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差,轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的 siRNA 半衰期短,體外合成 siRNA 對基因表達的抑制作用通常是短暫的,因而使其應用受到較大的限制.采用事先在體外構(gòu)建能夠表達 siRNA 的載體,然后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄 siRNA 的策略,不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加,而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA,在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中,甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用.在所構(gòu)建的 siRNA 表達載體中,是由 RN 咪合酶田啟動子來指導 RN 給成的,這是由于RN 咪合酶田有明確的起始和終止序列,而且合成的 RNA會帶 polyA 尾.當RN 咪合酶田遇到連續(xù) 4 個或 5 個 T

3、時,它指導的轉(zhuǎn)錄就會停止,在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 3端形成 14 個U.U6 和 H1RNAO 動子是兩種 RN 咪合酶田依賴的啟動子,其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游,適合于表達21ntRNA 和50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stemloop).在 siRNA 表達載體中,構(gòu)成 siRNA 的正義與反義鏈,可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補結(jié)合形成 siRNA;也可由載體直接表達小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNA,shRNA),載體包含位于 RNA合酶田啟動子和 45T 轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列,轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有 14個 U3突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu),在細胞內(nèi)進一步加工成 siRN

4、A.構(gòu)建載體前通常要通過合成 siRNA的方法,尋找高效的 siRNA,然后從中挑選符合載體要求的序列,將其引入 siRNA 表達載體.慢病毒載體(Lentiviralvector)較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍,慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞.慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達 shRNA 勺高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達 shRNA 實現(xiàn)在多種類型的細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默,為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能,以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供了可能性.慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所

5、需要的遺傳信息.慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝 RNAIU 重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白.為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞之后,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,整合到基因組,從而高水平的表達效應分子.二、這一系統(tǒng)的目的,主要是為了解決以下問題：1 .對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞,如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提升目的基因轉(zhuǎn)導效率,而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加,這就為 RNAi,cDNAS 隆以及報告基因的研究提

6、供了一個有利的途徑.2 .進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選；3 .為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；在細胞相關(guān)的實驗操作中,對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞,通過病毒介導的實驗能夠大大提升基因的轉(zhuǎn)導效率,以到達目的基因的高效瞬時表達.三、慢病毒載體介紹慢病毒載體Lentiviralvector,LVs是在 HIV-1 病毒根底上改造而成的病毒載體系統(tǒng),它能高效的將目的基因或 RNAD 導入動物和人的原代細胞或細胞系.慢病毒載體基因組是正鏈 RNA 其基因組進入細胞后,在細胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為 DNA 形成 DNAB 合前復合體,進入細胞核后,DNA 整合到細胞基

7、因組中.整合后的DNA 專錄 mRNA 回到細胞漿中,表達目的蛋白；或產(chǎn)生 RNAi 干擾.慢病毒載體介導的基因表達或 RNAi 干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定,原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中,并隨細胞基因組的分裂而分裂.另外,慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細胞中.以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比,比方不整合的腺病毒載體、 整合率低的腺相關(guān)病毒載體、 只整合分裂細胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,有鮮明的特色.大量文獻研究說明,慢病毒載體介導的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、巨噬細胞等.慢病毒載體不表達任何 HIV-1 蛋白,免疫原性低,在注射部

8、位無細胞免疫反應,體液免疫反響也較低,不影響病毒載體的第 2 次注射.四、慢病毒載體的構(gòu)建1 .構(gòu)建原理慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科,但其基因組結(jié)構(gòu)復雜,除 gag、pol 和 env 這 3 個和單純逆轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)基因外,還包括 4 個輔助基因,vif、vpr、nef、vpu 和 2 個調(diào)節(jié)基因 tat 和 rev.HIV21 是慢病毒中最具特征性的病毒,第一個慢病毒載體系統(tǒng)即以此病毒為根底進行構(gòu)建的.慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將 HIV21 基因組中的順式作用元件如包裝信號、長末端重復序列和編碼反式作用蛋白的序列進行別離.載體系統(tǒng)包括包裝成分和載體成分：包裝成分由 HIV21 基因組去除了包

9、裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建,能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補,含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV21 順式作用序列.同時具有異源啟動子限制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因.為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復制水平的病毒RCV的可能性,將包裝成分的 5LTR 換成巨細胞病毒CMV 危即早期啟動子,3LTR 換成 SV40polyA 位點等.將包裝成分分別構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上,即一個表達 gag和 pol、另一個表達 envo 根據(jù)這個原理,Naldini 和 Kafri 等構(gòu)建了三質(zhì)粒表達系統(tǒng).2 .三質(zhì)粒表達系統(tǒng)-三質(zhì)粒來包裝產(chǎn)生重組慢病毒：三質(zhì)粒表達系統(tǒng)包

10、括包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒.其中包裝質(zhì)粒在 CMW 動子的限制下,表達 HIV21 復制所需的全部反式激活蛋白,但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu;包膜蛋白質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒 G 蛋白VSV2G,應用 VSV2G 包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴大了載體的靶細胞嗜性范圍,而且增加了載體的穩(wěn)定性,允許通過高速離心對載體進行濃縮,提升了滴度；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中除含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列,還保存 350bp 的 gag和 RRE 并在其中插入目的基因或標志基因 綠色熒光蛋白 GFP.將載體系統(tǒng)分成三個質(zhì)粒最大的益處是使序列重疊的時機大大減少,減少載體重組過程中產(chǎn)生 RCVB 可能性.通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細胞,超速離心后病毒滴度可達 109IU/ml.3 .四質(zhì)粒表達系統(tǒng)為了減少HIV21包裝結(jié)構(gòu)的序列同源性,進一步減少重組成RCVB可能性,Dull等人將輔助基因去除.但由于 gag2pol 的轉(zhuǎn)運需要 rev,因此,在上述的三質(zhì)粒系統(tǒng)的根底上,構(gòu)建成四質(zhì)粒表達系統(tǒng),該系統(tǒng)加上含rev的質(zhì)粒減少了產(chǎn)生RCV勺可能性,而且對非分裂期細胞轉(zhuǎn)導效率無影響.五、慢病毒載體應用1 .將目的基因/RNAi 基因轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染的細胞,比方神經(jīng)元細胞、干細胞或其它原代細胞；2 .將目的基因/RNAi 基因轉(zhuǎn)入動物組織,以期獲得長期表達；3 .構(gòu)建穩(wěn)定表達目的蛋白/RNA