氣相和液相色譜柱綜合管理文件

1、一、 概述：1. 高效液相色譜柱構(gòu)造：色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。色譜柱是高效液相色譜的心臟，在高效液相色譜儀的使用中，保持色譜柱的柱效、容量和滲透粉性，延長(zhǎng)柱子的使用壽命非常重要。因此對(duì)高效液相色譜柱的維護(hù)是關(guān)鍵。高效液相色譜柱的分類：液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。· 常見(jiàn)的分配柱填料：碳十八柱（ODS/C18)、碳八柱（MOS/C8）、碳六柱（Hexyl/C6）、 碳四柱（Butyl/C4）、碳一柱（Methyl/C1）、陰離子交換柱（SAX)、 陽(yáng)離子交換柱（SCX）、苯基柱（Phenyl）

2、、氨基柱（Amino/NH2）、 氰基柱（Cyano/CN/Nitrile）等。· 常見(jiàn)的吸附柱填料：硅膠柱l 正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在310 m的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。l 反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。2. 氣相色譜柱毛細(xì)管色譜柱的組成：毛細(xì)管色譜柱由兩部分組成管身和固定相。氣相色譜柱的種類：有多種類型，從不同的角度出發(fā)，可按色譜柱的材料、形狀、柱內(nèi)徑的大小和長(zhǎng)度、固定液的化學(xué)性能等進(jìn)行分類。色譜柱使用的材料通常

3、有玻璃、石英玻璃、不銹鋼和聚四氟乙烯等，根據(jù)所使用的材質(zhì)分別稱之為玻璃柱、石英玻璃柱、不銹鋼柱和聚四氟乙烯管柱等。按照色譜柱內(nèi)徑的大小和長(zhǎng)度，又可分為填充柱和毛細(xì)管柱。前者的內(nèi)徑在24mm，長(zhǎng)度為110m左右；后者內(nèi)徑在0.20.5mm，長(zhǎng)度一般在25100m。在滿足分離度的情況下，為提高分離速度，現(xiàn)在也有人使用高柱效、薄液膜的10m短柱。根據(jù)固定液的化學(xué)性能，色譜柱可分為非極性、極性與手性色譜分離柱等。二、 色譜柱的選型與求購(gòu)：1. 色譜柱選型1.1高效液相色譜柱如果儀器用來(lái)做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長(zhǎng)柱子的壽命。·

4、非極性或極性較小的樣品可用一般的C18柱· 酸堿性的化合物建議選用填料經(jīng)封尾鈍化過(guò)的C18柱，PH范圍2-9（12）· 糖類，氨基酸，有機(jī)酸，多環(huán)芳烴，GPC有專用柱· 超快速柱子-填料粒度<2µm鍵合相色譜柱· 優(yōu)點(diǎn)· 固定相穩(wěn)定，不易流失· 應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑· 消除硅羥基的不良影響· 缺點(diǎn)· pH值不能小于2或大于8· 同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同反相HPLC柱（C18）的性能· 常規(guī)C18填料的穩(wěn)定性· 硅膠基質(zhì)填料· pH范圍：2

5、-8 · pH值大于7時(shí)鍵合相粉碎或溶解· pH值小于2時(shí)鍵合相的化學(xué)鍵斷裂· 經(jīng)常用緩沖液 固定相降解· 填料新的鍵合技術(shù) - PH范圍 2-12 - 穩(wěn)定性好，使用壽命長(zhǎng)1.2氣相色譜柱柱長(zhǎng)度選擇 ：分辨率與柱長(zhǎng)的平方根成正比。在其他條件不變的情況下,為取得加倍的分辨率需有4倍的柱長(zhǎng)。較短的柱子適于較簡(jiǎn)單的樣品,尤其是由那些在結(jié)構(gòu)、極性和揮發(fā)性上相差較大的組分組成的樣品。一般來(lái)說(shuō)：15m的短柱用于快速分離較簡(jiǎn)單的樣品，也適于掃描分析；30m的色譜柱是最常用的柱長(zhǎng)，大多數(shù)分析在此長(zhǎng)度的柱子上完成；50m、60m或更長(zhǎng)的色譜柱用于分離比較復(fù)雜的樣品。應(yīng)該

6、注意，柱長(zhǎng)增加分析時(shí)間也增加。柱內(nèi)徑的選擇：柱徑直接影響柱子的效率、保留特性和樣品容量。小口徑柱比大口徑柱有更高柱效，但柱容量更小。0.25mm：具有較高的柱效，柱容量較低。分離復(fù)雜樣品較好。0.32mm：柱效稍低于0.25mm的色譜柱，但柱容量約高60%。0.53mm：具有類似于填充柱的柱容量，可用于分流進(jìn)樣，也可用于不分流進(jìn)樣，當(dāng)柱容量是主要考慮因素時(shí)(如痕量分析)，選擇大口徑毛細(xì)管柱較為合適。液膜厚度的選擇 液膜厚度影響柱子的保留特性和柱容量。厚度增加，保留也增加。0.10.2m ：薄液膜厚度的毛細(xì)管柱比厚液膜的毛細(xì)管柱洗脫組分快，所需柱溫度低，且高溫下柱流失較小，適用高沸點(diǎn)的化合物的分

7、析。0.250.5m ：常用的液膜厚度。厚液膜：對(duì)分析低沸點(diǎn)的化合物較為有利。固定相的選擇不同的固定相對(duì)不同的分析物的影響不同，根據(jù)相似相溶原理，性質(zhì)越相近，固定相對(duì)其的流動(dòng)阻力越大，其保留時(shí)間越長(zhǎng)色譜柱就是通過(guò)這個(gè)原理將不同性質(zhì)的混合物相互分開(kāi)的您現(xiàn)在就可以看到其實(shí)氣相色譜柱的分離效果主要取決于其固定相，柱長(zhǎng)度，柱內(nèi)徑，液膜厚度這幾個(gè)因素，從原理上講，這幾個(gè)因素相同的柱子，其分離效果是完全一樣的?？紤]到這一點(diǎn)，現(xiàn)在您完全根據(jù)這個(gè)更加本質(zhì)的依據(jù)來(lái)選擇您的氣相色譜柱，而不必一定去購(gòu)買昂貴的標(biāo)準(zhǔn)指定氣相色譜柱。2. 色譜柱的選型與求購(gòu)根據(jù)檢驗(yàn)方法或者藥典標(biāo)準(zhǔn)中的需求確定色譜柱的柱長(zhǎng)、柱內(nèi)徑、填料孔

8、徑、填料類型等規(guī)格，同時(shí)根據(jù)方法中色譜條件如流動(dòng)相比例、PH值、緩沖鹽成分、流速等條件來(lái)選擇合適的品牌和型號(hào)。確定好色譜柱的規(guī)格、品牌和型號(hào)以后，填寫(xiě)求購(gòu)單報(bào)供應(yīng)部采購(gòu)。三、 色譜柱的接收與登記：1. 登記臺(tái)賬：色譜柱購(gòu)入后，首先應(yīng)檢查是否與所求購(gòu)的規(guī)格、品牌和型號(hào)一致、是否有出廠檢測(cè)并且檢測(cè)合格的證明。檢查無(wú)誤后登記色譜柱臺(tái)賬，其中HPLC柱與GC柱兩種色譜柱分開(kāi)做臺(tái)賬，以便查閱。臺(tái)賬內(nèi)容包括柱編號(hào)、品牌、序列號(hào)、型號(hào)、填料、購(gòu)買日期、使用時(shí)間、使用范圍、停用時(shí)間、停用原因。在接收時(shí)登記柱編號(hào)、品牌、序列號(hào)、型號(hào)、填料、購(gòu)買日期；柱第一次使用時(shí)（包括活化/老化柱）登記其使用時(shí)間及使用范圍。2

9、. 色譜柱編號(hào)： 色譜柱編號(hào)采用代號(hào)+流水號(hào)的形式，其中氣相色譜柱代號(hào)為GC1，高效液相色譜柱代號(hào)為L(zhǎng)C1，編規(guī)則如下：QC的第一根氣相色譜柱為GC1-001（流水號(hào)連續(xù)遞增，不得跳號(hào)）；第一根高效液相色譜柱為L(zhǎng)C1-001（流水號(hào)連續(xù)遞增，不得跳號(hào)）。四、 色譜柱的使用與維護(hù)保養(yǎng)：每根色譜柱應(yīng)設(shè)有使用記錄，每次使用前和使用后登記使用的及時(shí)信息。液相色譜柱使用登記記錄內(nèi)容包括色譜柱編號(hào)、使用范圍、色譜柱信息、使用日期、使用目的、使用儀器、使用流動(dòng)相、使用后維護(hù)記錄、柱壓、柱狀態(tài)、使用人等信息;氣相色譜柱使用登記記錄包括色譜柱編號(hào)、使用范圍、色譜柱信息、使用日期、使用目的、使用儀器、柱狀態(tài)、使用

10、人等信息。1. 高效液相色譜柱1.1安裝柱子在裝卸、更換時(shí)，動(dòng)作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng)，以免柱床產(chǎn)生空隙。 1.1.1拆開(kāi)柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。首先應(yīng)確認(rèn)柱和儀器的接頭以及管路是否匹配。為減少死體積，進(jìn)樣閥、柱子、檢測(cè)器之間的連接管路內(nèi)徑盡可能使用內(nèi)徑較小的管線，同時(shí)控制進(jìn)樣器、色譜柱和檢測(cè)器之間連接管線的長(zhǎng)度。安裝色譜柱之前，確認(rèn)流路系統(tǒng)中的溶 劑是否正常。對(duì)分析較復(fù)雜的樣品建議安裝保護(hù)柱。 1.1.2按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過(guò)連接管與進(jìn)樣閥出口相連接。連接管的兩端均有

11、空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰14-12圈，切記不要用力過(guò)大。如色譜柱通過(guò)流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰14圈，直至不漏液為止。為了使色譜柱與儀器系統(tǒng)達(dá)最佳的連接效果，應(yīng)盡量使用與色譜柱接口相匹配的螺帽和錐形接頭，如原來(lái)的接頭長(zhǎng)期匹配其他類型的色譜柱，建議在連接新色譜柱前應(yīng)檢查匹配情況，避免造成色譜柱的損壞或因色譜柱不匹配造成的漏液。1.1.3不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)時(shí)，會(huì)造成：· 色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏·

12、解決辦法：· 自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭· 或使用以下兩種較為通用的接頭ü PEEK 材料的通用接頭：只需用手?jǐn)Q緊不需要特定扳手，使用壓力為5000psi；使用溫度不得超過(guò)100。PEEK工程塑料的接頭，可用在所有類型的色譜柱上的。ü 錐箍及螺母型接頭：這種錐箍在不銹鋼管上是活動(dòng)的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。1.2使用1.2.1使用前平衡· 在進(jìn)行樣品檢測(cè)前，先用所保存色譜柱的流動(dòng)相預(yù)先沖洗。反相色譜柱：如流動(dòng)相有鹽份先用510%的甲醇水沖洗再用所使用流動(dòng)相沖洗。正相色譜柱：用所使用流動(dòng)相沖洗。對(duì)于部門現(xiàn)用的纈沙坦對(duì)映異構(gòu)體色譜柱填料為AGP

13、的色譜柱，不能沾甲醇，故每次實(shí)驗(yàn)前先用純化水不接色譜柱沖洗系統(tǒng)以1.0ml/min流速至少?zèng)_洗1h，接上色譜柱再用純化水以0.3ml/min的流速?zèng)_洗色譜柱至少1小時(shí)，最后用所使用流動(dòng)相沖洗色譜柱。建議使用前總沖洗柱體積至少10倍使色譜柱充分平衡。流動(dòng)相一定要使用色譜級(jí)別的溶劑。如使用水相的緩沖液應(yīng)當(dāng)天配制以保持新鮮避免細(xì)菌產(chǎn)生。· 流動(dòng)相使用前需用微孔濾膜過(guò)濾,消除流動(dòng)相中顆粒對(duì)色譜系和色譜柱的損壞。緩沖液與其他流動(dòng)相混合后應(yīng)重新過(guò)濾避免溶解度變化造成產(chǎn)生新的沉淀。不應(yīng)使用純水作為流動(dòng)相沖洗C18色譜柱，以免柱性能損壞（添加5%-10%的有機(jī)溶劑沖洗色譜柱）。 · 流動(dòng)相

14、需脫氣后使用，可避免因氣泡導(dǎo)致的泵和檢測(cè)器的工作不正常。如果測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相與色譜柱保存使用的流動(dòng)相有較大區(qū)別，應(yīng)該使用過(guò)度分布的形式進(jìn)行平衡。避免由于流動(dòng)相的突然變化造成柱壓增加過(guò)大或流動(dòng)相緩沖鹽結(jié)晶造成對(duì)色譜柱和儀器系統(tǒng)的損壞。正相色譜柱比反相色譜柱需要更長(zhǎng)的平衡時(shí)間。1.2.2使用注意事項(xiàng)· 使用時(shí)流速和柱壓要逐漸增加，進(jìn)樣前檢查色譜系統(tǒng)的各個(gè)接頭是否有漏液· 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩。不要高溫下過(guò)

15、長(zhǎng)時(shí)間使用硅膠鍵合相柱子· 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?#183; 如使用柱溫控制裝置時(shí)，應(yīng)注意在通人流動(dòng)相后才能升溫。· 一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。· 選擇使用適宜的流動(dòng)相，以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。· 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣

16、器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。· 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右。 · 色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi)，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。1.3.液相色譜柱的維護(hù)1.3.1樣品方面· 除去微粒及雜質(zhì)· 了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度ü 如樣品的溶劑

17、不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出 · 了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用· 溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。· 色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。· 儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。樣品過(guò)濾頭的類型：· 30mm 內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2m 和0.45m 兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。&

18、#183; 13mm 內(nèi)徑：適用于范圍廣的過(guò)濾，由0.2m 和0.45m 兩種規(guī)格,材料為纖維素。· 3mm 內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2m 和0.45m 兩種規(guī)格。處理樣品體積為7l。 1.3.2流動(dòng)相、溶劑方面1.3.2.1使用的溶劑(必須為色譜級(jí)別溶劑)· 除去微粒· 純度的要求a) 超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低（建議走空白檢驗(yàn)）b) 緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)c) 緩沖液（鹽）的濃度d) 溶劑：色譜純，并與填料相匹配e) 溶劑中的雜質(zhì)含量f) 注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑 · 流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的

19、比例· 不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長(zhǎng)菌的溶劑會(huì)阻塞溶劑過(guò)濾器以及色譜柱。· 含水流動(dòng)相最好在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。· 遵從下列建議可以提高性能，延長(zhǎng)溶劑過(guò)濾器和色譜柱的壽命：a) 使用無(wú)菌溶劑瓶避免溶劑長(zhǎng)菌。b) 用濾膜過(guò)濾溶劑去除微生物。c) 每?jī)商焐踔粮虝r(shí)間更換過(guò)濾溶劑。d) 避免溶劑瓶直接日照。e) 向溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉。· 避免使用下列對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑：a) 􀁺鹵化物堿金屬溶液和相應(yīng)的酸溶液。b) 􀁺高濃度的無(wú)機(jī)酸例如：硝酸和硫酸。c)

20、48698;能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。d) 􀁺含有過(guò)氧化物的色譜級(jí)醚必須用氧化鋁干燥劑。e) 􀁺在有機(jī)溶劑中的有機(jī)酸溶液。f) 􀁺含有強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液。g) 􀁺四氯化碳和異丙醇或THF混合液。1.3.2.2選擇合適的濾膜· 聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無(wú)任何可溶物。· 醋酸纖維濾膜：適用于水基溶劑，不適用于有機(jī)溶劑，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)的樣品。· 尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸、70%乙醇、二氯甲烷、不適用于DMF二甲基甲酰胺·

21、; 再生纖維素濾膜：具有蛋白質(zhì)吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑。注意：1）每張濾膜只能用一次。 2）水相和有機(jī)相不要搞混。1.3.2.3脫氣目的：排除溶解在流動(dòng)相中的氧氣和氮?dú)饬鲃?dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì)造成熒光猝滅。脫氣方法：氦氣脫氣、回流加熱脫氣、真空脫氣、超聲脫氣。· 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫

22、氣，效果較好，但成本高。· 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染· 抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。· 超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：LC 真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制，無(wú)需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。1.4常見(jiàn)問(wèn)題及可能存在的原因1.4.1柱壓過(guò)高Ø 色譜柱方面：· 微粒堵塞ü 樣品ü 流動(dòng)相ü 密封墊· 柱床膨脹· 不可逆吸附· 細(xì)菌生長(zhǎng)Ø

23、 儀器方面：柱壓過(guò)高問(wèn)題，不一定都是色譜柱問(wèn)題！· 系統(tǒng)反壓?jiǎn)栴}ü 阻尼器堵塞ü 進(jìn)樣器堵塞ü 管路或連接口堵塞ü 在線過(guò)濾器不干凈ü 保護(hù)柱· 壓力傳感器不準(zhǔn)確· 流速是否錯(cuò)誤?1.4.2柱效低Ø 色譜柱方面：· 色譜柱被污染· 過(guò)濾片部分堵塞ü 樣品、流動(dòng)相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞· 色譜柱內(nèi)的死體積ü 流動(dòng)相pH值及組成不合適造成固定相流失ü 流速急劇變化造成固定相物理?yè)p壞ü 機(jī)械震動(dòng)造成固定相產(chǎn)生裂縫ü 柱床收縮或

24、干枯Ø 儀器方面：· 連接不好造成死體積ü 進(jìn)樣器ü 檢測(cè)器ü 管路，連接口ü 保護(hù)柱ü 在線過(guò)濾器堵塞· 流動(dòng)相問(wèn)題：色譜柱未平衡好· 進(jìn)樣量太大1.4.3實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差Ø 色譜柱方面：· 色譜柱被污染· 流動(dòng)相pH值及組成不合適造成鍵合相流失· 樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定Ø 儀器方面問(wèn)題：· 梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足· 溫度波動(dòng)· 流動(dòng)相組成改變· 樣品溶劑不同· 樣品穩(wěn)定性不好· 方法的開(kāi)發(fā)

25、不好ü 緩沖液的pH值不合適ü 緩沖液的緩沖能力不足1.4.4回收率低，不出峰· “不可逆”吸附· 固定相過(guò)強(qiáng)或流動(dòng)相過(guò)弱· 非特異性吸附1.5高效液相色譜柱清洗1.5.1新購(gòu)液相色譜柱活化新購(gòu)入液相色譜柱和長(zhǎng)時(shí)間未使用的液相色譜柱最好用強(qiáng)溶劑在低流量下（0.2-0.3ml/min）沖洗10倍柱體積。沖洗時(shí)柱出口端不得接檢查器，以免未知雜質(zhì)對(duì)檢查器造成影響?；罨V柱后需要在色譜柱使用記錄上記錄：活化所用溶劑，活化所用流速及活化了多長(zhǎng)時(shí)間。硅膠色譜柱柱體積計(jì)算公式：V=*r2*l-*r2*l*0.6/dr：柱內(nèi)徑 l：柱長(zhǎng) 0.6為硅膠堆積密度

26、 d：無(wú)孔硅膠密度約為2.32g/ml常用色譜柱柱體積規(guī)格柱體積(ml)如以0.3ml/min沖洗，時(shí)間如下3.9*150mm5.313h4.6*250mm12.316.8h4.6*150mm7.394.1h3.9*300mm10.625.9h3.0*150mm3.141.7h3.0*200mm4.192.3h4.0*100mm3.722.1h 1.5.2對(duì)于污染后高效液相色譜柱的清洗因?yàn)楦咝б合嗌V柱是消耗品，隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，當(dāng)柱效降低：主要特征性現(xiàn)象有柱壓基本正常，但出現(xiàn)拖尾峰、禿峰、分叉峰、前延峰、峰變寬、基線漂移、理論板數(shù)降低、分離度降低等?？梢詫?duì)色譜柱進(jìn)行再生。再生過(guò)程

27、必須隨時(shí)關(guān)注柱壓變化，柱壓過(guò)高易導(dǎo)致硅膠變形與開(kāi)裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時(shí)要保證再生時(shí)間足夠。反相柱的再生： 一般情況下，順接色譜柱，按如下溶劑順序及條件沖洗：95%水-5%甲醇（或乙腈）（1.0ml/min，1h以上）100甲醇（1.0ml/min，1h以上）100乙晴（1.0ml/min，1h以上）75乙晴-25異丙醇（0.5ml/min，10倍柱體積以上）100異丙醇（0.5ml/min，10倍柱體積以上）100二氯甲烷（0.5ml/min，10倍柱體積以上）100正己烷（0.5ml/min，10倍柱體積以上，根據(jù)實(shí)際情況可忽略）100%異丙醇（0.5ml/min，20倍柱體積以

28、上）95%水-5%甲醇（或乙腈）（0.5ml/min，30min；再升至1.0ml/min，10倍柱體積以上）檢測(cè)用流動(dòng)相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進(jìn)樣測(cè)試。在沖洗過(guò)程中，隨時(shí)關(guān)注柱壓變化，確保不超過(guò)4000psi；若超出，可通過(guò)降低流速，升高柱溫來(lái)調(diào)整，具體操作可咨詢具備相關(guān)專業(yè)知識(shí)背景和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的人士。若上述方法效果不理想，可按如上溶劑順序和條件，先反接色譜柱沖洗再順接色譜柱，用100%乙腈以1ml/min流速?zèng)_洗約2h再用與流動(dòng)相同比例的水-有機(jī)相以1ml/min流速?zèng)_洗約30min最后用流動(dòng)相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進(jìn)樣測(cè)試即可。· 正相柱再生：順次以正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇

29、作流動(dòng)相沖洗色譜柱每步注意平衡溶劑的順序，不要顛倒每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的量為20-30倍柱體積(因異丙醇的粘度較大，沖洗過(guò)程中請(qǐng)隨時(shí)注意調(diào)整沖洗的流速)，用甲醇沖洗完后，再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必需嚴(yán)格脫水。· 離子交換柱的再生：長(zhǎng)時(shí)間在高pH值和高離子強(qiáng)度緩沖溶液中使用，將導(dǎo)致色譜柱離子交換能力降低。用稀酸緩沖溶液沖洗，可使陽(yáng)離子柱再生;反之，用稀堿緩沖溶液沖洗，可使陰離子柱再生。以上色譜柱的再生方法并不是絕對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用者可根據(jù)自己的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)和目的，選擇合適的并能溶解柱內(nèi)污染物的溶劑作流動(dòng)相，按正方向或反方向的沖洗。2. 氣相色譜柱2.1氣相色譜柱安裝2.1.

30、1選擇石墨墊石墨 (100%) 450：通用于各種毛細(xì)管色譜柱，適用于FID, NPD, ECD檢測(cè)器。裝取方便，可重復(fù)使用。不適用于MS 或氧敏感的檢測(cè)器。Vespel (85%/15%) 350：對(duì)于各種毛細(xì)管色譜柱通用，推薦使用于MS 或氧敏感的檢測(cè)器。不可重復(fù)使用。Vespel (100%) 280：適用于定溫操作。裝取方便，可重復(fù)使用 若使用于NPD，升溫程序會(huì)引起環(huán)聚物流失。金屬 >450：適用于金屬填充柱，耐高溫，不可重復(fù)使用。O-型環(huán) 250：適用于玻璃填充柱，低溫。2.1.2毛細(xì)管色譜柱的切割在聚酰亞胺涂層上輕輕地劃出一道劃痕，不要嘗試割開(kāi)毛細(xì)管玻璃推薦工具: 鉆石或人

31、造鉆石割刀、藍(lán)寶石切割工具、陶瓷片目鏡不可使用: 剪刀、銼刀2.1.3毛細(xì)管柱安裝前檢查項(xiàng)目（1）檢查氣瓶壓力以確保有足夠的載氣、尾吹氣和燃?xì)?。載氣的純度不低于99.995；（2）清潔進(jìn)樣口，必要時(shí)更換進(jìn)樣口密封墊圈，進(jìn)樣口襯管和隔墊；（3）檢查檢測(cè)器密封墊圈，必要時(shí)更換。如有必要，清洗或更換檢測(cè)器噴嘴；（4）仔細(xì)檢查柱子是否有破損或斷裂。2.1.4毛細(xì)管的安裝（1）從柱架上將色譜柱兩端各拉出大約0.5 m，以用于進(jìn)樣口和檢測(cè)器安裝，避免色譜柱銳折；（2）在柱兩端安裝柱接頭和石墨密封墊圈，向下套柱接頭和密封墊圈，離端口大約厘米；（3）標(biāo)記和切割柱子。在柱距兩端大約cm處用標(biāo)記筆標(biāo)記，拇指和食指

32、盡量靠近切割點(diǎn)抓牢，輕輕地拉并彎曲柱子, 柱會(huì)很容易折斷。如果柱子不容易折斷，不要用力強(qiáng)行折，換個(gè)在離柱端更遠(yuǎn)的地方再刻一下，使其折斷口處光滑。為確保柱兩頭切口截面沒(méi)有聚酰亞胺和玻璃碎片, 可用放大鏡檢查切口；（4）在進(jìn)樣口安裝色譜柱時(shí)，先查看儀器說(shuō)明書(shū)找到正確的插入距離，并且用涂改液把這個(gè)距離標(biāo)出來(lái)。將色譜柱插入檢測(cè)器，用手指擰緊柱螺帽直到它固定住色譜柱，然后再擰螺帽1/4-1/2圈，這樣當(dāng)加壓時(shí)色譜柱不會(huì)從接頭脫出來(lái)； （5）打開(kāi)載氣，確定合適的流速。設(shè)定柱頭壓力，分流比和隔墊吹掃至合適的水平。如果使用分流和不分流進(jìn)樣口，檢查清洗分流閥至ON(開(kāi))狀態(tài)，確認(rèn)載氣流過(guò)色譜柱，將色譜柱一端浸入

33、丙酮瓶中檢查是否有氣泡； （6）將色譜柱安裝到檢測(cè)器上時(shí)，查看儀器說(shuō)明書(shū)所提供的正確插入距離； （7）檢查有無(wú)泄漏。在未仔細(xì)檢查色譜柱有無(wú)泄漏之前對(duì)柱子不能加熱； （8）清洗系統(tǒng)中的氧氣至少數(shù)10 min，如果色譜柱被打開(kāi)暴露到空氣中很長(zhǎng)時(shí)間（幾天），那么需要更長(zhǎng)時(shí)間（12h）來(lái)清洗系統(tǒng)以排除所有的氧氣； （9）設(shè)定正確的進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度； （10）設(shè)定正確的尾吹氣和檢測(cè)器氣流。點(diǎn)火、打開(kāi)檢測(cè)器至ON狀態(tài)下； （11）注射非保留物質(zhì)甲烷（FID）、乙晴(NPD)、二氯甲烷(ECD)、空氣(TCD)、氬氣（質(zhì)譜）以檢驗(yàn)進(jìn)樣器是否正確安裝。如果出現(xiàn)對(duì)稱峰則安裝正確，如果有峰拖尾，重復(fù)進(jìn)樣口安裝程

34、序。2.2氣相色譜柱的良好用法· 柱的使用溫度要盡量比柱的耐熱溫度低，這樣可以延長(zhǎng)柱的使用壽命，減低檢測(cè)器的噪聲級(jí)。· 除去載氣中氧（特別是使用極性柱時(shí)）。使用高純度的氣體（99.999%以上）氣瓶更換時(shí)特別注意不要混入空氣。氧氣凈化器裝在GC前面。· 不要使難于揮發(fā)的成分進(jìn)入柱內(nèi)充分做好試樣的前處理使用柱襯管和石英棉安短的前置柱，一次性使用（毛細(xì)管柱）2.3氣相色譜柱的維護(hù)2.3.1毛細(xì)管柱的老化2.3.1.1平時(shí)老化 （1）在比最高分析溫度高20或最高柱溫（溫度更低者）的條件下老化柱子兩小時(shí)，如果在高溫10min后背景不下降，立即將柱子降溫并檢查柱子是否有泄漏

35、； （2）如果用Vespel密封墊圈的話，老化完后重新檢查密封程度；（3）注射非保留物質(zhì)以確定合適的平均線速度。2.3.1.2在新購(gòu)入氣相色譜柱也必須按2.3.1.1方法進(jìn)行操作。在新柱老化時(shí)不得接檢測(cè)器，以免新柱內(nèi)的雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)器造成污染。2.3.1.3老化色譜柱后需要在色譜柱使用記錄上記錄：老化所用溫度及老化了多長(zhǎng)時(shí)間。2.3.2使用注意事項(xiàng)在使用毛細(xì)管柱過(guò)程中，主要是防止固定液流失，因?yàn)楣潭ㄒ毫魇?huì)使柱效能降低。事實(shí)上色譜柱固定液流失是自然的、是熱力學(xué)平衡過(guò)程。色譜柱固定液聚硅氧烷通過(guò)聚合物本身的取代基形成環(huán)狀分子。聚合物碎片之間由于取代基作用也可形成一些短鍵聚合物碎片。當(dāng)這些碎片從色譜柱

36、流出，它們會(huì)被檢測(cè)到，從而導(dǎo)致信號(hào)的增強(qiáng)。在毛細(xì)管柱使用的全過(guò)程中這種反應(yīng)一直發(fā)生。因此，所有的色譜柱都有不同程度的流失。氧是導(dǎo)致嚴(yán)重柱流失的主要因素，在色譜分析時(shí)盡量減少色譜儀氣路系統(tǒng)氧的含量、使用好材料的部件以及選擇正確的操作條件，可降低柱固定液的流失，延長(zhǎng)柱子使用壽命。· 下面介紹幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：（1）使用高純度的載氣。氧氣含量不宜高于1 x10-6g/g；（2）利用凈化器可以除去較低級(jí)別氣體中的氧和碳?xì)浠衔镫s質(zhì)。通常雜質(zhì)含量可減少到100 x10-6g/g或更少；（3）聚合物材料通常不穩(wěn)定。因此，調(diào)節(jié)器主體，閥盤座，密封圈和隔膜應(yīng)首選金屬材料；（4）管線只能使用沒(méi)有油或其它污

37、染物的銅管或不銹鋼管，推薦使用制冷級(jí)銅管。（5）形圈或其它聚合物墊圈的閥最好用有焊接金屬、波紋形密封墊。（6）整個(gè)系統(tǒng)必須無(wú)泄露，并且確保樣品中不存在非揮發(fā)性物質(zhì)。因氧和污染物對(duì)固定液的分解有催化作用，會(huì)導(dǎo)致柱流失增強(qiáng)；（7）在柱子安裝后加熱柱箱之前，柱子必須用干凈的載氣清洗15 min。如果色譜儀是新的，或進(jìn)樣器和儀器管線進(jìn)行維護(hù)或修理過(guò)，儀器應(yīng)當(dāng)再清洗15至30 min；（8）各種固定液的熱穩(wěn)定性不一樣，柱流失對(duì)背景信號(hào)的影響隨固定液種類和所受溫度變化而變化。當(dāng)柱箱溫度接近于柱溫的上線時(shí)柱流失也會(huì)增加。所以應(yīng)當(dāng)盡量在較低的溫度下工作以延長(zhǎng)柱子的使用壽命；（9）一旦柱子損壞，由于固定液降解的

38、程度不同，重新老化后有可能改善柱性能。2.4毛細(xì)管柱污染后清洗 2.4.1色譜工作者涉及兩種類型污染：第一種不能洗脫的非揮發(fā)性物質(zhì)；第二種最終能從柱子洗脫出來(lái)的半揮發(fā)性物質(zhì)。柱子污染的癥狀為，產(chǎn)生吸附，出現(xiàn)鬼峰、脫尾峰、前延峰，發(fā)生分解，造成柱固定相過(guò)度流失和柱選擇性改變。潛在的污染源包括：注射的樣品、橡膠隔膜和金屬墊碎屑、載氣和捕集器中雜質(zhì)以及其它來(lái)自外部如器皿和注射器中的雜質(zhì)。2.4.2首先，最容易的補(bǔ)救方式是通過(guò)切除前端盤繞的色譜柱（大約50cm）。如果污染物位于柱子前端，那么色譜柱的性能會(huì)立即得到改 善。如果柱 性能沒(méi)有得到改善，則可以判定污染物沒(méi)有位于柱子的前端，下一步驟就是清洗進(jìn)樣

39、系統(tǒng)。進(jìn)樣口石英襯管將是造成柱子污染的主要原因，要及時(shí)更換清洗。如果進(jìn)樣口石英襯管沒(méi)有污染，而且污染物又不位于柱子的前端，那么，可以判定整個(gè)柱子的固定相遭到嚴(yán)重污染。沖洗柱子通常會(huì)洗脫出絕大多數(shù)非揮發(fā)性和半揮發(fā)性組分。如果固定相是化學(xué)鍵合性質(zhì)的，通常用有機(jī)溶劑沖洗，色譜柱是安全的。溶劑沖洗并不破壞鍵合型固定相。不過(guò)，要避免在Carbowax 或DB-Wax這樣的臘質(zhì)性固定相上用甲醇和水作溶劑沖洗，在管柱說(shuō)明書(shū)上通常會(huì)注明可以使用哪些有機(jī)溶劑來(lái)清洗。最佳方式是采用一組溶劑依次進(jìn)行柱沖洗。通常，最佳溶劑組為10ml甲醇，10ml二氯甲烷和10ml正己烷溶劑。如果必須用水去除鹽類的話，那么在用甲醇沖

40、洗之前，先用10ml水進(jìn)行沖洗。沖洗的方式是按照正常載氣流速的反方向，從檢測(cè)器端至進(jìn)樣口端方向進(jìn)行沖洗。在所有沖洗結(jié)束之后，色譜柱重新使用之前，要用氮?dú)馔ㄟ^(guò)柱子吹干30min至45min。在柱子加溫之前，要用載氣慢速吹干以防止損害固定相。2.4.3柱沖洗時(shí)應(yīng)注意：柱固定相膜厚度2m 會(huì)出現(xiàn)溶脹現(xiàn)象沖洗時(shí)，要將柱子一端插入沖洗溶劑內(nèi)，加壓載氣源將沖洗液從柱內(nèi)洗脫出。沖洗柱子是去除污染物的最佳方式，但一般情況下，絕大多數(shù)人還喜歡選擇高溫老化方式去除柱內(nèi)污染物。因?yàn)楦邷乩匣容^簡(jiǎn)便，因此也是一種去除污染物的有效方法。不過(guò)應(yīng)注意，高溫老化色譜柱也不是經(jīng)常有效的，因?yàn)樗鼉H僅去除揮發(fā)性和半揮發(fā)性組分。如果

41、污染物粘附在進(jìn)樣口或污染物是非揮發(fā)性的，那么長(zhǎng)期高溫老化色譜柱則難以解決這一問(wèn)題。事實(shí)上，高溫老化色譜柱所帶來(lái)的弊病遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于解決這一問(wèn)題獲得的好處。如果污染物是活性和非揮發(fā)性的，那么長(zhǎng)期高溫老化色譜柱則會(huì)縮短柱子的使用壽命。由此，這種高溫老化也可以聚合某些污染物，導(dǎo)致色譜柱永久性損傷。高溫老化色譜柱一般不超過(guò)1h至3h。色譜工作者應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到：只有半揮發(fā)和揮發(fā)性組分可以去除，當(dāng)認(rèn)為一根柱子被污染時(shí)，首先考慮的是應(yīng)該對(duì)柱子進(jìn)行沖洗，然后如果必要的話，才考慮高溫老化方式。避免污染的方法首先在于預(yù)防。所有樣品都含有殘留物，并且每一個(gè)樣品組分會(huì)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后發(fā)生改變。無(wú)論如何精心操作，每一個(gè)樣品肯定會(huì)比

42、上次注射進(jìn)樣時(shí)發(fā)生輕微改變。理由是分析樣品中含有反應(yīng)性或揮發(fā)性組分?；瘜W(xué)催化劑及某些溶質(zhì)其本身限制了柱子的使用壽命。具體表現(xiàn)為：酯類趨向于發(fā)生皂化反應(yīng)；鹽酸和內(nèi)酯易發(fā)生水解反應(yīng)；環(huán)氧化物在酸或堿環(huán)境中易發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)。適當(dāng)?shù)臉悠分苽淇勺畹拖薅葴p少色譜系統(tǒng)內(nèi)的污染。在進(jìn)樣口石英襯管內(nèi)放置石英棉，可預(yù)防柱子非揮發(fā)性殘留物的污染。應(yīng)注意在每次分析之前，要確認(rèn)溶劑是無(wú)污染的，注射器是干凈的，樣品存放器皿和容器是清潔的。如果固定相已經(jīng)在化學(xué)性質(zhì)上發(fā)生改變或損傷，那么沒(méi)有什么方法可以將柱子恢復(fù)到它的原始狀態(tài)。2.5常見(jiàn)問(wèn)題2.5.1峰丟失（進(jìn)樣后沒(méi)有峰出現(xiàn)）· 注射器有毛病，采用新注射器做驗(yàn)證&#

43、183; 未接入檢測(cè)器或檢測(cè)器不起作用，檢查設(shè)定值。· 進(jìn)樣溫度太低，檢查溫度，并根據(jù)需要調(diào)整。· 柱溫溫度太低，檢查溫度，并根據(jù)需要調(diào)整。· 無(wú)載氣流量，檢查壓力調(diào)節(jié)閥，并檢查泄露，驗(yàn)證柱樣品流速。· 柱斷裂，如果柱斷裂是在柱進(jìn)樣口端或檢測(cè)器末端，是可以補(bǔ)救的，切去斷裂部分，重新安裝。2.5.2前沿峰· 柱超載，減少進(jìn)樣量。· 兩個(gè)化合物共洗脫，提高靈敏度和減少進(jìn)樣量，使溫度降低1020，以使峰分開(kāi)。· 樣品冷凝，檢查進(jìn)樣口和柱溫，如有必要可以升溫。· 樣品分解，采用失活化進(jìn)樣器襯管或調(diào)低進(jìn)樣器溫度。2.5.3拖

44、尾峰· 進(jìn)樣器襯套或柱吸附活性樣品：更換襯套。如解決不了就將柱進(jìn)樣端截12cm，再重新安裝。· 柱或進(jìn)樣器溫度太低：升溫（不要超過(guò)柱最高使用溫度）。進(jìn)樣器溫度應(yīng)比樣品最高沸點(diǎn)高20。· 兩個(gè)化合物共洗脫：提高靈敏度和減少進(jìn)樣量，使溫度降低1020，以使峰分開(kāi)。· 柱已損壞：請(qǐng)更換柱。· 柱污染：將柱進(jìn)樣端截去12cm，再重新安裝。2.5.4只有溶劑峰· 注射器有毛?。翰捎眯伦⑸淦黩?yàn)證。· 不正確的載氣流速（太低）：檢查流速，如有必要，調(diào)整之。· 樣品濃度太?。赫?qǐng)?zhí)岣邇x器靈敏度，或增加注入量。· 柱箱溫度太

45、高：檢查溫度并根據(jù)需要調(diào)整。· 柱不能從溶劑中分離出組分：更換高膜厚的色譜柱或不同極性。· 栽氣泄露：檢查泄露處（肥皂水）。· 進(jìn)樣器襯套或柱吸附活性樣品：更換襯套。如解決不了就將柱進(jìn)樣端截去12cm，再重新安裝。2.5.5寬溶劑峰· 由于柱子安裝不當(dāng)，在進(jìn)樣口產(chǎn)生死體積：重新安裝柱。· 進(jìn)樣技術(shù)差（進(jìn)樣太慢）：采用快速平穩(wěn)進(jìn)樣技術(shù)。· 進(jìn)樣器溫度太低：提高進(jìn)樣器溫度。· 樣品溶劑與檢測(cè)相互影響二氯甲烷/ECD：更換樣品溶劑。· 柱內(nèi)殘留樣品溶劑：調(diào)整或清洗。· 隔墊清洗不當(dāng)：調(diào)整或清洗。· 分流比不正確分流排氣流速不足：調(diào)整流速。2.5.6假峰· 柱吸附樣品，隨后解吸：更換襯管，如不能解決問(wèn)題，就從柱進(jìn)樣口端去掉12圈，再重新安裝。· 注射器污染：用新的注射器及干凈的溶劑試一試，如假峰消失，就將注射器沖洗幾次。· 樣品進(jìn)樣量太大：減少進(jìn)樣量。· 進(jìn)樣技術(shù)太差、進(jìn)樣太慢：采用快速平穩(wěn)的進(jìn)樣技術(shù)。2.5.7過(guò)去工作良好的柱出現(xiàn)未分辨峰· 柱溫不對(duì)：檢查并調(diào)整溫度。· 不正確的載氣流速：檢查并調(diào)整流速。· 樣品進(jìn)樣量太大：減少樣品