考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作一考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量一、標(biāo)準(zhǔn)曲線一般用分光光度法測(cè)物質(zhì)的含量，先要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線査 出所測(cè)物質(zhì)的含量。因此，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線是生物檢測(cè)分析的一項(xiàng)基本技術(shù)。二、蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法1、凱氏定氮法2、雙縮脈法3、Folin-酚試劑法4、紫外吸收法5、考馬斯亮藍(lán)法三、誇馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一標(biāo)準(zhǔn)曲線制作(一) 、試劑：1、考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G250 lOOmg溶于5()ml 95%乙醇，加入lOOml 85% H5PO4,用蒸憎水稀釋至10(X)ml,濾紙過濾。最終試劑中含0.01% (W/V)考馬斯亮藍(lán)G250,4.7% (W/V)乙醇,8.5% (W/V)

2、 H3PO4o2、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：純的牛血清血蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度同0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/ml 蛋白溶液。(二) 、器材：1、722S型分光光度計(jì)使用及原理()。2、移液管使用（）o（三八標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:1、試管編號(hào)01234561 OOug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白(ml)0.00.10.2().30.40.50.60.15mol/L NaCI (ml)10.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍(lán)試劑（創(chuàng)）5555555搖勻，lh內(nèi)以1號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色人5951縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個(gè)點(diǎn)為10叱、20 ug. 30

3、ug、40畔、5（）u® 60 ug）,在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1）、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線査岀回歸方程。2）、用公式計(jì)算回歸方程。3）、或用origin作圖,測(cè)出回歸線性方程。即A595nm=aXX（ ）+6一般相關(guān)系數(shù)應(yīng)過0.999以上，至少2個(gè)9以上。4）、繪圖時(shí)近兩使點(diǎn)在一條直線上，在直線上的點(diǎn)應(yīng)該在直線兩側(cè)。（四）、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：樣品即所測(cè)蛋白質(zhì)含量樣品（含量應(yīng)處理在所測(cè)范圍內(nèi)），依照操作步驟1 操作，測(cè)出樣品的然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求出樣品蛋白質(zhì)含量。一般被測(cè)樣品的仏9亦值在0.10.05之間，所以上述樣品如果人9亦值太大， 可以稀釋后再測(cè)人9洵值，然后再計(jì)算。（五）、注意

4、事項(xiàng)：1、玻璃儀器要洗滌干凈。2、取量要準(zhǔn)確。3、玻璃儀器要干燥，避免溫度變化。4、對(duì)照：用被測(cè)物質(zhì)以外的物質(zhì)作空白對(duì)照。藥品的配制（磷酸緩沖液的配制）一、藥品的配制步驟（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1、準(zhǔn)備所需的藥品和玻璃儀器。2、洗滌。（怎樣洗滌算干凈？）（二）、計(jì)算：1、百分比濃度計(jì)算:1）、G/V 比 例如配1% NaCl,稱IgNaCI溶于100ml水。2）、V/V 比:例如配 75%乙醇 100ml, 75% XI00%=100% XX, X=75mlo 取 75ml 無水乙醇,加25ml蒸f留水。乙醇:乙醛:丙酮=2: 1: 2配500ml,各取200 ml, 100 ml, 200 ml混

5、合。3）G/V比：用的較少，如計(jì)算灰分中某種元素如氏的含量。2、摩爾濃度計(jì)算：注：藥品的分于量一般在標(biāo)簽中注明。1）、0.1M 或 0.1mol/L NaCl 配 lOOmLM二質(zhì)量/體積（L）稱取NaClO.l X0.1 X40=0.4g 摩爾數(shù)二G （g） /摩爾質(zhì)量2）、O.lmMNaCl 配 100mlmM二毫摩爾數(shù)/體積（L）稱取 NaC10.1X0.1X40=0.4g毫摩爾數(shù)二G （mg） /摩爾質(zhì)量3）、O.luNaCl E 100mlmM二微摩爾數(shù)/體積（L）稱取 NaC10.1X0.1X40=0.4mg微摩爾數(shù)二G （ug） /摩爾質(zhì)量稱取NaC10.1X0.1X40=0.4

6、ug3、混合溶液配制的計(jì)算：如配 3uMEOTA, 2.25mM NBT 以& 60uM溶液 100ml，用 50mM 磷酸緩沖液配制。注意：1、分別標(biāo)定體積計(jì)算2、分別配制再混合，但總體積不能 為1（）（）曲（三）、標(biāo)量:1、根據(jù)需要選擇不同量程的天平根據(jù)要求去不同精度的測(cè)量器，如量筒或移液 管。2、電于分析天平的使用。（四）、溶解:1、根據(jù)藥品配置要求選擇溶劑。蒸憎水，雙蒸水，無離于水等。2、只能用燒杯溶解。注意加入溶劑只能加入總體積的2/3左右，剩余溶劑洗滌 燒杯三次左右，直到洗滌干凈。小常識(shí)：藥品標(biāo)簽中一般標(biāo)識(shí)有藥品的溶解性能和分于式，可根據(jù)分于式和 所學(xué)的常識(shí)判斷藥品的結(jié)構(gòu)和

7、性質(zhì)特點(diǎn)（包括溶解性質(zhì)）。如酸堿兩性物質(zhì)的配制（AA蛋白質(zhì)、核昔酸等）如果溶解性能不好可以 用稀酸或稀堿促進(jìn)溶解，但pH應(yīng)在被要求的范圍內(nèi)。3、加熱促進(jìn)溶解，但注意應(yīng)在配制的范圍內(nèi)有的藥品還需水溶加熱較好。如:配0.1%的淀粉，水裕加熱（溫度在80-90" C）,過量會(huì)糊化。（五）、定容：1、用容量瓶定容；2、用玻璃棒引流或用小漏斗；3、用溶劑加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度與液體凹面相切 為止（眼睛可視）；4、上下窯洞容量瓶幾次，混合均勻即可。（注意不再定容了，防止溶液漏掉。）（六）、裝入試劑瓶，貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽應(yīng)注明以下內(nèi)容：藥品濃度、名稱、配制人、配制日期等。（七）

8、、清理實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所。二、磷酸緩沖液的配制。（一）、配制0.2m（）l/L即（）.2MpH二6.8的磷酸緩沖液。用磷酸氫二鈉一磷酸二氫 鈉做緩沖液。選用藥品：Na2HPO4 - 12H2O （堿）和 NaH2PO4 - 12H.O （酸）配緩沖液 lOOmL 書中說明。（二）、計(jì)算:1、注：書中有注明配置的量。2、計(jì)算：Na2HPO4 - 12H2O 稱取 71.64X0.1=7.164gNaH2PO4 - 12H2O 稱取 31.21 XO.仁 3.121 g3、含有不同結(jié)晶水的換算。書中配l/15mol/L的緩沖液配1L,書中用NaHPCU 2HQ需要11.870L但用Na2HP（）4 12H2O 需多少若？11.87= （178/358） XX, X=23.87ge（三）、分別配制緩沖液各100ml （根據(jù)需要確定配制的量）。即：0.2M Na2HPO4 - 2H2O 和 NaH2PO4 2H20100mL（四）、按書中的量配制取量再混合。 如：pH二68,分別去緩沖對(duì)49ml和51ml。（五）、用pH試紙cmi索賠的緩沖液的pH值，檢測(cè)配置是否準(zhǔn)確。