細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟

1、時間：二O二一年七月二十九日細(xì)胞培養(yǎng)的操縱步調(diào)之樊仲川億創(chuàng)作時間：二O二一年七月二十九日一、原代培養(yǎng)及其操縱步調(diào)原代別離細(xì)胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后,經(jīng)機(jī)械以及消化別離成單個細(xì)胞或單一型細(xì)胞群,使之在體外模擬人體生理環(huán)境,在無菌、適當(dāng)溫度和一定的營養(yǎng)條件下,生存、生長和繁衍.原代培養(yǎng)細(xì)胞常有不合的細(xì)胞成分,生長緩慢,但是更能代表所來源的組織細(xì)胞類型和表達(dá)組織的特異性特征.利用原代細(xì)胞培養(yǎng)做各類實(shí)驗(yàn),如藥物測試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗(yàn)效果很好.其操縱步調(diào)如下.1 .剪切組織先將所取得的組織,用D-Hanks或Hanks液清洗,以去除概略血污,并用手術(shù)鐐?cè)コじ降慕Y(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織.再

2、次清洗后,用手術(shù)刀將組織切成假設(shè)干小塊,移入青霉素小瓶或小燒杯中,參加適量緩沖液,用彎頭眼科剪,頻頻剪切組織,直到組織成糊狀,約1mm太小.靜置片刻后,用吸管吸去上層液體,參加適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗一次.2 .消化別離消化別離的目的是將細(xì)小的組織塊消化別離成細(xì)胞團(tuán)或別離的單個細(xì)胞,以利于進(jìn)一步的培養(yǎng),經(jīng)常使用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶.3 .培養(yǎng)細(xì)胞懸液用計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù).用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為25X105cells/ml,或?qū)嶒?yàn)所需密度,分裝于培養(yǎng)瓶時間：二O二一年七月二十九日時間：二O二一年七月二十九日中,使細(xì)胞懸液的量以籠蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜.置CO緒養(yǎng)箱內(nèi),5%CO2,37C靜置培養(yǎng)

3、.一般35d,原代培養(yǎng)細(xì)胞可以黏附于瓶壁,并伸展開始生長,可補(bǔ)加原培養(yǎng)液量1/2的新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)23d后換液,一般714d可以長滿瓶壁,進(jìn)行傳代.(1)無菌操縱：細(xì)菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的罕見原因,必須增強(qiáng)各個環(huán)節(jié)的無菌操縱不雅念,以預(yù)防為主,一旦污染,一般很難消除.(2)培養(yǎng)液：所用的培養(yǎng)液必須滿足細(xì)胞生存和生長的需要條件.由于細(xì)胞來源的動物種類、組織類型不合,對培養(yǎng)液的要求有一定的差異,需要時可用預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液.(3)小牛血清：小牛血清對于維持培養(yǎng)細(xì)胞的生存和促進(jìn)細(xì)胞增殖起著關(guān)頭性作用.可選擇多種不合批號的小牛血清進(jìn)行小樣闡發(fā).一旦確定某一廠家的某一批號小牛血清后,就堅持

4、應(yīng)用至實(shí)驗(yàn)完成.(4)膠原酶溶液：必須新鮮配制,貯存時間過長(即使是-20C低溫保管),也將影響消化效力,導(dǎo)致消化時間過長,細(xì)胞損傷增加.(5)L-谷氨酰胺：幾乎所有細(xì)胞對谷氨酰胺都有較高的要求,細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì),在缺少谷氨酰胺時,細(xì)胞會因生長不良而死亡.谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4c冰箱貯存兩周以上時,就應(yīng)重新參加原來量的谷氨酰胺.時間：二O二一年七月二十九日時間：二O二一年七月二十九日(6)靜置培養(yǎng)：原代細(xì)胞在消化別離后,置于CO籍養(yǎng)箱的頭2448h(需要時72h)內(nèi),應(yīng)處于絕對靜置狀態(tài),切忌不時地取出培養(yǎng)瓶不雅察生長狀況,這將使原代別離細(xì)胞難以貼壁,

5、更談不上伸展和增殖,初學(xué)者尤應(yīng)注意.不必?fù)?dān)憂培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分會消耗光,在細(xì)胞增殖之前對營養(yǎng)的要求其實(shí)不大.原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細(xì)胞貼壁伸展.(7)消化時間：一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可,因?yàn)榇藭r組織顆粒已經(jīng)松散,略經(jīng)吹打即成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞,過久的消化往往導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重,細(xì)胞培養(yǎng)成活率降低.(8)其他生長因子：經(jīng)過以上處理,一般原代別離細(xì)胞培養(yǎng)均可以成功.對于少數(shù)特殊類型細(xì)胞也可以考慮加一些特殊的生長因子,如胰島素能促使細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸.另外,內(nèi)毒素、EGFFGF等均有促有絲割裂作用,但用度較高.二、傳代培養(yǎng)及其操縱步調(diào)原代細(xì)胞培養(yǎng)成功以后,需要進(jìn)行

6、別離培養(yǎng),不然細(xì)胞會因生存空間缺乏或密度過大,營養(yǎng)障礙,影響細(xì)胞生長.細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)別離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng).傳代細(xì)胞允許培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增(形成細(xì)胞株),可以進(jìn)行細(xì)胞克隆,易于保管,但可能喪失一些特殊的細(xì)胞和分化特征.傳代細(xì)胞形成細(xì)胞株的最大利處在于提供了大量持久的實(shí)驗(yàn)資料,便于實(shí)驗(yàn).(1)吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液.時間：二O二一年七月二十九日時間：二O二一年七月二十九日(2)向瓶內(nèi)參加胰蛋白酶液和EDTA混合液少量.以能籠蓋培養(yǎng)瓶底為宜.(3)置37c孵箱或室溫(25c溫度)下進(jìn)行消化,25min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行不雅察,當(dāng)創(chuàng)造胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后

7、,應(yīng)立即中止消化.(4)吸出消化液,向瓶內(nèi)參加Hanks液少量,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,把殘留消化液沖掉,然后再加培養(yǎng)液.如果僅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接參加少量含血清的培養(yǎng)液,終止消化.(5)使用彎頭吸管,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,按順序頻頻輕輕吹打瓶壁細(xì)胞,使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液.吹打時動作要輕柔,以防用力過猛損傷細(xì)胞.(6)用計數(shù)板計數(shù)后,區(qū)分接種于新的培養(yǎng)瓶中,置CO第養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng).？?？(7)細(xì)胞培養(yǎng)換液時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來確定.一般23d后應(yīng)換一次生長液.待細(xì)胞鋪滿器皿底面,即可使用；也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液.(1)掌握好細(xì)胞消化的時間,消化時間過短時,

8、細(xì)胞不宜從瓶壁脫落,過長的消化會導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷.(2)掌握好消化濃度,當(dāng)消化液濃度過高時,消化時間應(yīng)縮短,過低時細(xì)胞消化時間相對延長.三、體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)及其操縱步調(diào)時間：二O二一年七月二十九日時間：二O二一年七月二十九日1 .瘤細(xì)胞懸液接種(1)無菌選取生長良好(有光澤,淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細(xì)胞.(2)在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨,經(jīng)80100目篩網(wǎng)過濾成細(xì)胞懸液.(3)培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用PBS洗兩遍.(4)計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至107108/ml.(5)常規(guī)消毒后,于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細(xì)胞懸液(0.1ml/部位,106細(xì)胞).初

9、次接種成功率低,細(xì)胞數(shù)盡可能多一些.(6)次日注意不雅察動物一般情況.初次接種一般有一段較長的潛伏期,以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短,最后固定為一個相對穩(wěn)定的時間.2 .腹水瘤的建立與腹水瘤的接種將實(shí)體瘤細(xì)胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位,引起腹水,腹水中含有瘤細(xì)胞,將這種腹水頻頻傳代,即可成為腹水瘤.初次傳代時,腹水常呈血性(含大量紅細(xì)胞),頻頻傳代后腹水逐漸釀成乳白色.腹水瘤的接種過程如下(1)將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細(xì)胞離心和洗滌,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù).(2)消毒動物,左下腹穿刺接種106腹水瘤細(xì)胞.(3)接種腹水瘤細(xì)胞后約712d,待小鼠腹部明顯膨大.用碘酒棉球消毒小鼠腹部,用9號針頭抽取腹水,也可

10、行腹部解剖后,用滴管吸取.每只小鼠可抽35ml.時間：二O二一年七月二十九日時間：二O二一年七月二十九日(4)抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min,收集上清,分裝凍存?zhèn)溆?四、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存及蘇醒細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)任務(wù)和通用技術(shù).細(xì)胞凍存在-196c液氮中,儲存時間幾乎是無限的.細(xì)胞凍存及蘇醒的原那么是慢凍快融.1 .凍存細(xì)胞(1)選對數(shù)增生期細(xì)胞(證實(shí)無支原體污染),在凍存前1d換液.(2)按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液,計數(shù),使細(xì)胞密度達(dá)5X107/ml左右密度,離心,去上清.(3)參加配制好的凍存液(培養(yǎng)液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO1ml,5.6%NaHCO30.1m

11、l),按與去上清相同的量一滴一滴參加離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸.凍存細(xì)胞時培養(yǎng)液中參加呵護(hù)劑10%二甲基亞碉(DMSO或甘油,可使冰點(diǎn)降低,使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外.(4)分裝于無菌凍存管中,每管加1.5m懸液.(5)旋好凍存管并仔細(xì)檢查,一定要蓋緊,做好標(biāo)識表記標(biāo)幟.(6)凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中,按-1C/min的速度,在3040min時間內(nèi),下降到液氮概略,再停30min后,直接投入液氮中.要適當(dāng)掌握下降冷凍速度,過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,太慢那么促進(jìn)冰晶形成.時間：二O二一年七月二十九日時間：二O二一年七月二十九日操縱時應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套,以免液氮凍傷.(1)從罐中取出凍存管.(2)迅速放入36c37c水浴,不時搖動,使其急速融化,3060s內(nèi)完成.(3)凍存管用70%酒精擦拭消毒后,翻開蓋子,用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管