肺癌組織細胞FHIT基因啟動子甲基化和轉(zhuǎn)錄表達

1、肺癌組織細胞FHIT基因啟動子甲基化和轉(zhuǎn)錄表達 作者：余宗濤， 袁亞莉， 張吉才， 高瓊， 王元元【摘要】 目的探討FHIT (fragile histidine triad,脆性組氨酸三聯(lián)體)基因表達水平及其啟動子CpG島甲基化狀態(tài)與肺癌發(fā)生發(fā)展的關系。方法用實時定量PCR檢測FHIT mRNA在肺癌組織、肺癌旁組織與去甲基化劑5氮雜2脫氧胞苷（5Aza2deoxycytidine、5AzaCdR）處理前后A549細胞株中的表達，用甲基化特異性PCR（MSPCR）檢測FHIT啟動子CpG島甲基化狀態(tài)。結(jié)果FHIT mRNA在肺癌旁組織中全部表達，在肺癌組織中表達缺失率為48.89%（22/4

2、5），且表達量低于正常肺組織（t=-15.851，<0.001），但在不同年齡和性別、腫瘤大小、惡性程度、腫瘤分類的差異無顯著性；FHIT基因啟動子在肺癌組織中發(fā)生甲基化的頻率為40%(18/45)、在癌旁組織中頻率8.7%(2/23)（2 =7.184, <0.01），18份啟動子區(qū)甲基化的肺癌標本中，10份同時伴有mRNA表達缺失。結(jié)論在肺癌組織中，F(xiàn)HIT基因啟動子甲基化頻率明顯升高，其表達缺失或下調(diào)，提示FHIT啟動子甲基化可在肺癌發(fā)生和發(fā)展中起一定作用。 【關鍵詞】 肺癌；CpG島甲基化；MSPCR；FHIT基因 1資料與方法 1.1資料 1.1.1標本來

3、源收集湖北省十堰市太和醫(yī)院2005 年3月2006 年2月手術切除肺癌新鮮標本45例，男28例、女17例。小細胞肺癌（SCLC）8例、非小細胞肺癌（NSCLC）37例。全部標本均經(jīng)病理證實。連同23例距離腫瘤邊緣2cm外正常對照組織。-80冰箱保存?zhèn)溆谩?1.1.2A549細胞株培養(yǎng)及藥物處理將對數(shù)生長期A549細胞制成5×104/ml細胞懸液，5% CO2條件下培養(yǎng)24h后，分別用5×10-6mol/L和5×10-5mol/L濃度5AzaCdR處理，24h后棄去藥液并重新更換含新鮮培養(yǎng)液的藥液，濃度同前，連續(xù)作用3d后棄去藥液，用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4d后進行實驗

4、，用同體積PBS處理的細胞作為對照組。 1.1.3主要試劑及及儀器Wizard DNA clean up、Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(美國Promega公司)； 5AzaCdR(美國Sigma公司)；人肺癌細胞株A549購自武漢大學生物保藏中心；PE7000(美國ABI公司)。 1.1.4引物合成FHIT甲基化引物4(53 ； 53)，擴增片段長度為74bp；FHIT非甲基化引物4(5TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG3；5CATAAACAACACCAACCCCACTA3)片段長度為74bp； FHITm

5、RNA引物4(5GCTCTTGTGAATAGGAAACC3； 5TCACTGGTTGAAGAATACAGG3)片段長度為532bp；GAPDHmRNA引物5 （5GAAGTTGAAGGTCGGAGTC3； 5GAAGATGGTGATGGGATTTC3）片段長度為226bp（北京賽百盛公司）。 1.2方法 1.2.1組織、細胞DNA提取以經(jīng)典酚氯仿抽提法提取組織DNA，經(jīng)紫外260nm定量后于-80保存?zhèn)溆谩?1.2.2組織、細胞RNA提取后逆轉(zhuǎn)為cDNA用Trizol操作說明書進行提取組織及細胞RNA，提取后溶于無RNA酶的雙蒸水中，立即用試劑盒A3500逆轉(zhuǎn)為cDNA備用。 1.2.3基因組

6、DNA的磺化修飾參照文獻6，取4g（總體積為50l）基因組DNA，經(jīng)變性、堿基修飾、脫鹽后回收再脫去磺化基團，用預冷酒精沉淀回收。離心干燥后重新溶于50l 去離子水中，置-40備用。 1.2.4MSPCR磺化修飾后的基因組DNA 50100ng (3l)，10×buffer 3l，2mmol/L dNTP 3l，25mmol/L氯化鎂3l，Taq 酶2U(1l)，上下游引物各2l (12pmol)，20×SYBR Green 0.75l，去離子水補齊至30l。置PE7000儀進行擴增：95變性3min，(95×60s, 58×30s, 72×6

7、0s) ×40，在72讀取熒光值，最后一個循環(huán)72延伸5min。 1.2.5RTPCR用無RNA酶的雙蒸水稀釋cDNA至100l，PCR反應體系及循環(huán)參數(shù)同MSPCR。 1.2.6FHITmRNA相對定量方法利用檢測得到的Ct值和計算得到的擴增效率，以GAPDH mRNA的量為參照，計算FHIT mRNA的相對量。FHIT mRNA/GAPDH mRNA用下述公式計算：(1+EGAPDH) Ct (GAPDH)/(1+EFHIT) Ct(FHIT)7。 1.2.7統(tǒng)計學分析用SPSS10.0軟件分析，mRNA表達水平定量測定用t檢驗，啟動子甲基化狀況用卡方檢驗。 2結(jié)果 2.1MSP

8、CR檢測結(jié)果肺癌基因組DNA標本中，有10例（其中SCLC 3例）只存在甲基化PCR產(chǎn)物，另外35例標本中都存在非甲基化PCR 產(chǎn)物，其中既有甲基化又有非甲基化產(chǎn)物的8例（其中SCLC 1例）；而在23例正常對照組織中，存在甲基化2例，且均可檢測出非甲基化產(chǎn)物的存在，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義，見表1；在年齡、性別、分化程度、腫瘤的病理類型、腫瘤大小差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。表FHIT甲基化化狀況及mRNA相對定量 組織病例注： 檢驗：2 =7.184、 P<0.01； 兩獨立樣本t檢驗：t=-15.851、 P<0.0012.2靶基因FHIT

9、mRNA的相對定量癌旁組織中，F(xiàn)HIT mRNA相對定量在0.85±0.11，而在檢出甲基化的18例肺癌組織中，10例FHIT mRNA低于檢測下限；在肺癌標本中 FHIT mRNA的相對定量在0.24±0.20，差異顯著；在A549細胞株中，F(xiàn)HIT mRNA測定比值為0.56，但用5AzaCdR處理后，其FHIT mRNA測定比值為0.97。 2.3PCR產(chǎn)物分析經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳證實了是一條特異的目的帶, 見圖13。圖1 MSPCR 檢測肺癌中FHIT 基因 甲基化狀態(tài)電泳圖M=74bp， U=74bp圖2管家基因GAPDH(226bp)內(nèi)對照電泳圖M：甲基化； U

10、：未甲基化； DW：蒸餾水； Blank：空白對照； Marker：分子量標準 圖3FHIT mRNA(532bp) RTPCR電泳圖3討論我們實驗組用SYBR Green 實時定量PCR測定FHITmRNA在45例肺癌組織中的相對定量，其表達缺失率高達48.89%(22/45)，且即使表達其表達量也顯著降低，而在相對應的23例癌旁正常組織中幾乎全部正常表達，兩者的表達差異顯著但與病人的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤的病理類型等病理因素不相關。表明FHIT的表達缺失與肺癌的發(fā)生有一定的相關性，提示FHIT可能為肺癌的候選抑癌基因。用MSPCR檢測肺癌組織FHIT啟動子甲基化率，40.00%的病例標

11、本存在FHIT基因啟動子區(qū)域CpG位點甲基化。而正常對照組織中，存在甲基化的僅有8.70%，兩者差異顯著。表明在肺癌組織中，F(xiàn)HIT基因啟動子區(qū)域確實存在CpG位點被甲基化的現(xiàn)象。在18例甲基化陽性的標本中有10例FHIT表達缺失，A549肺癌細胞株檢測甲基化陽性，用5AzaCdR處理后FHITmRNA相對定量顯著增高，這是由于5AzaCdR去甲基化，使由于啟動子甲基化而沉默的FHIT再次表達，說明基因啟動子甲基化可以使基因表達缺失或下調(diào)。根據(jù)已被廣泛證實的啟動子區(qū)域的DNA甲基化胞嘧啶的密度和基因轉(zhuǎn)錄活性的相互關系8，基因由于啟動子甲基化而失活，不僅抑制基因的表達，還改變蛋白和DNA的相互作

12、用，導致染色質(zhì)結(jié)構的改變，是抑制基因活性的一種重要機制。抑癌基因FHIT由于啟動子甲基化而完全或部分失活，失去對細胞異常增殖的抑制調(diào)控，促進肺癌的發(fā)生。總之，我們通過檢測肺癌組織中FHIT基因啟動子甲基化及在肺癌細胞株A549上的去甲基化劑5氮雜2脫氧胞苷處理，比較完整地闡述了FHIT基因啟動子甲基化導致FHIT基因表達失活機制以及在肺癌發(fā)生過程中所發(fā)揮的作用?！緟⒖嘉墨I】 1Barnes LD,Garrison PN,Siprashvili Z,et al.Fhit, a Putative Tumor Suppressor in Humans, Is a Dinucleoside 5'

13、;,5' ''P1,P3Triphosphate HydrolaseJ. Biochemistry,1996, 35(36)： 1152911535.2Ji L, Fang B, Yen N, et al. Induction of Apoptosis and Inhibition of Tumorigenicity and Tumor Growth by Adenovirus Vectormediated Fragile Histidine Triad (FHIT) Gene overexpressionJ. Cancer Res，1999, 59(14):33333

14、339.3Bird AP. CpGrichisland, and the function of DNA methylationJ. Nature，1986, 321(6067)： 209213. 4Dhillon VS, Shahid M, Husain SA. CpG methylation of the FHIT, FANCF, cyclinD2, BRCA2 and RUNX3 genes in Granulosa cell tumors (GCTs) of ovarian originJ. Mol Cancer， 2004,1（3）:33.5Kanai Y,Ushijima S,Ko

15、ndo Y,et al.DNA methyltransferase expression and DNA methylation of CPG islands and pericentromeric satellite regions in human colorectal and stomach cancersJ. Int J Cancer， 2001, 91(2): 205212.6Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islandsJ. Proc Natl Acad Sci USA， 1996, 93(18):98219826.7陳英劍,胡成