雜交瘤細胞株的建立

1、雜交瘤細胞株的建立 b淋巴細胞受外來抗原刺激后可以分泌抗體，不同的b淋巴細胞分泌的抗體不同，每個b淋巴細胞只分泌一種抗體；但是，b淋巴細胞在體外培養(yǎng)條件下存活時光很短，最多2周，然后很快死亡。用于融合的骨髓瘤細胞不分泌任何免疫球蛋白（ig)，是一種細胞系，能在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)分裂、長久存活。雜交瘤細胞便是將這兩種細胞的特性結(jié)合起來，獲得既能分泌單一抗體又能在體外長久培養(yǎng)的細胞。因此，分泌一種抗體，即單克隆抗體的雜交瘤細胞便稱為雜交瘤細胞株。 建立雜交瘤的全程技術(shù)稱為雜交瘤技術(shù)，普通需要4-6個月，包括以下階段：融合前所需細胞的預(yù)備、細胞融合或細胞雜交、雜交瘤細胞篩選、雜交瘤細胞株的凍存。 （

2、一）融合前所需細胞的預(yù)備 1動物免疫預(yù)備脾細胞 動物體內(nèi)的b淋巴細胞在特定外來抗原的刺激下，可以大量增殖變成漿細胞以分泌針對于該抗原的抗體。脾內(nèi)不同的b淋巴細胞可分泌針對抗原的不同抗原打算簇位點的抗體。當(dāng)受到特定外來抗原刺激時，相應(yīng)的b淋巴細胞克隆便大量增殖以分泌相應(yīng)的特異性抗體。動物免疫的作用就是用特定外來抗原對動物舉行一次或多次免疫，以刺激能分泌針對于該抗原抗體的b淋巴細胞大量增殖，從而得到大量的專一b淋巴細胞（圖11-4)。 動物免疫的辦法無數(shù)，普通有常規(guī)免疫法、脾內(nèi)一次性免疫法、短程免疫法和體外免疫法等。脾內(nèi)一次性免疫法具實用量少、免疫程序短、不加佐劑且所得單克隆抗體的特異性較高等特點

3、。 因為單次免疫抗原刺激后數(shù)日內(nèi)就舉行細胞融合，因此不存在所謂“優(yōu)勢克隆”的問題，從而更簡單獲得多種不同特異性的單克隆抗體，也能助于篩選出差別極小的兩種抗原的單克隆抗體。但該辦法的缺點是，其免疫效果要等雜交瘤篩選時才明白，因此在試驗時有一定的隨機性。此外對一些免疫原性較差的抗原，分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞篩選較困難。常規(guī)免疫法比較牢靠，在融合前能通過測定血清中的抗體滴度來證明免疫效果，因此試驗勝利的掌握性較大。因為免疫動物多次反復(fù)接受相同抗原的刺激，會使某些特定的淋巴細胞克隆大量增殖，易形成“優(yōu)勢克隆”，因此產(chǎn)生分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞種類較少，很可能多個克隆所產(chǎn)生的單克隆抗體都是針對于同一

4、個抗原打算簇的。免疫程序太長，費時費勁。短程免疫法和體外免疫法均各有其優(yōu)缺點。 典型的免疫程序包括初次免疫、二次免疫和加強免疫，普通需要2-3個月時光。加強免疫前，用免疫抗原構(gòu)建試劑盒測定免疫動物的血清抗體滴度，符合融合需要時，在融合前3-4d舉行加強免疫。前2次免疫均可腹腔注射免疫，加強免疫采納脾內(nèi)注射辦法。 脾內(nèi)注射的辦法是，無菌打開小鼠腹腔，裸露出脾臟，用lml無菌注射器將含有適量抗原的0.lml溶液分離注射到兩只小鼠脾臟內(nèi)。然后將脾臟輕輕復(fù)位，縫合傷口，正?；蚣訌婐B(yǎng)分舉行飼養(yǎng)備用。 2對數(shù)生長久的骨髓瘤細胞預(yù)備 在鼠源雜交瘤技術(shù)中，常用的小鼠骨髓瘤細胞為sp2/0-agl4，簡稱sp2

5、/0。也有用法ns1細胞的，與sp2/0一樣，都是不分泌ig的小鼠骨髓瘤細胞。 采納體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞，或?qū)⒐撬枇黾毎臃N到健康動物皮下生長實體瘤的辦法。實體瘤生長的骨髓瘤細胞接種需要提前10d舉行，體外培養(yǎng)的骨髓瘤細胞也需提前若干天使擴大培養(yǎng)到10，數(shù)量，要求細胞處于對數(shù)生長中晚期。所需骨髓瘤細胞可在融合前2h收集。 3.飼養(yǎng)細胞預(yù)備 在鼠源雜交瘤技術(shù)中，往往需要制備飼養(yǎng)細胞。普通取自健康小鼠腹腔，主要屬于腹腔巨噬細胞。在融合前l(fā)h收集，用含血清培養(yǎng)液制備成2×104/ml密度的單細胞懸液。 在融合后的細胞培養(yǎng)過程中，起到飼養(yǎng)層細胞的作用。由于，融合后培養(yǎng)孔內(nèi)的參加融合過程但未形成

6、脾細胞-骨髓瘤細胞雜交的細胞，如脾細胞、骨髓瘤細胞、脾細胞-脾細胞雜交細胞、骨髓瘤細胞-骨髓瘤細胞雜交細胞等，都會在hat挑選培養(yǎng)液的培養(yǎng)環(huán)境中死亡，而存活的脾細胞-骨髓瘤細胞雜交細胞密度過低不利生存，需要飼養(yǎng)層細胞增強總體活細胞密度并吞噬死亡細胞碎片。 （二）融合 細胞融合是指2個或2個以上的細胞，挨次地發(fā)生了細胞膜融合、細胞質(zhì)融合和細胞核融合等過程，然后這2個或2個以上的細胞形成1個融合細胞，即具有1套細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。 普通而言，遺傳穩(wěn)定的融合細胞僅可能來源于2個細胞之間的融合，往往保留了其中1種來源細胞的絕大多數(shù)基因組基因和另1種來源細胞的少量基因組基因，還需要準時地通過合適的分

7、別純化手段如克隆化培養(yǎng)來篩選，因此，2個細胞之間的融合并不一定能形成遺傳穩(wěn)定的新細胞。至于3個或3個以上的不同種類細胞，也有可能通過細胞融合形成1個暫時的融合細胞，但很難存活，不會形成遺傳穩(wěn)定的新細胞。綜合以上因素，在融合操作中，2種細胞的比例就顯得十分重要，如鼠源雜交瘤技術(shù)中，為了獲得高的融合效率，免疫后的脾細胞和骨髓瘤細胞普通按6：1的數(shù)量比例混合后再舉行融合操作。 細胞融合辦法普通有病毒介導(dǎo)的細胞融合、peg介導(dǎo)細胞融合及電融合等。病毒介導(dǎo)的細胞融合辦法要涉及仙臺病毒的培養(yǎng)和滅活，尤其是仙臺病毒的培養(yǎng)條件要求嚴格，過程比較復(fù)雜，因此現(xiàn)在普通不用法此辦法。電融合為20世紀80年月興起的一種

8、融合辦法，需要特定的技術(shù)條件，如需要融合儀、融合池、融合緩沖液等，通過實驗探究最佳的細胞排隊電壓、脈沖方波時程大小和脈沖間隔等融合參數(shù)才干順當(dāng)舉行。目前廣泛用法的融合辦法還是peg融合法，該辦法操作簡便、迅速省時，有較好的融合效果。 （三）雜交瘤細胞的篩選 脾臟是動物體內(nèi)b淋巴細胞集中的最大免疫器官，取出脾細胞（主要是b淋巴細胞）和骨髓瘤細胞融合后，能產(chǎn)生5種混合細胞類型：未融合的脾細胞和骨髓瘤細胞，自身融合的脾細胞和骨髓瘤細胞，以及脾細胞和骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞。 在細胞融合后，要從上述5種細胞中篩選出雜交瘤細胞，普通用法hat挑選培養(yǎng)基舉行篩選。 hat中含有次黃嘌呤(h)、氨基蝶

9、呤(a）和(t）三種成分。細胞的dna合成有內(nèi)源性途徑（主要途徑）和外源性途徑（旁路線徑）兩種方式。內(nèi)源性途徑利用谷氨酰胺或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶催化下合成dna，外源性途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hgprt）或胸腺嘧啶激酶(tk）的催化下補救合成dna,hat培養(yǎng)基中氨基嘌呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑，能有效地阻斷dna合成的內(nèi)源性途徑。b淋巴細胞具有hgprt,tk這兩種酶，因此在內(nèi)源性途徑被阻斷后仍能利用hat培養(yǎng)基中的次黃pia嘌呤和胸腺嘧啶來合成dna，可在hat培養(yǎng)基中存活，但b淋巴細胞是正常細胞，故不能長久存活。鼠源雜交瘤技術(shù)中用法的sp2/0

10、細胞為hgprt的tk缺陷型，缺乏hgprt酶和tk酶，在內(nèi)源性途徑被阻斷后不能舉行dna的外源性合成，故不能在hat培養(yǎng)基中存活。雜交瘤細胞因為繼承了b淋巴細胞和骨髓瘤細胞的雙重特性，能夠合成hgprt酶和tk酶，故在hat挑選培養(yǎng)基中能存活。因此，將融合后的混合細胞在hat挑選培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2周后，惟獨雜交瘤細胞能存活下來。 （四）分泌抗體的雜交瘤細胞檢測 存活下來的雜交瘤細胞不一定分泌抗體，因此，挑選并構(gòu)建合適的檢測辦法用于準時、迅速、精確地檢測細胞克隆生長孔內(nèi)的雜交瘤細胞是雜交瘤技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)之一。所構(gòu)建的抗體檢測辦法還能滿足在短時光內(nèi)檢測大量樣品的需求。 常用的辦法有elisa酶聯(lián)

11、免疫吸附法）、間接免疫熒光法和雙相蔓延法等，其中，elisa最常見。普通是在單細胞克隆長滿100×顯微視場時舉行分泌抗體檢測。有抗體分泌的孔稱陽性孔，單細胞克隆孔或單克隆孔的細胞克隆稱為陽性克隆，所分泌的抗體即稱為單克隆抗體。 （五）分泌抗體的雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng) 對陽性孔中的雜交瘤細胞舉行克隆化培養(yǎng)的辦法包括有限稀釋法、軟瓊脂平板法和顯微操作法等，以前者最常見。為了建立能穩(wěn)定分泌異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，往往需要舉行多次克隆化培養(yǎng)，直至全部單克隆孔的抗體表達量穩(wěn)定、全都時，便建立了一種雜交瘤細胞株（圖11-5)。 （六）細胞株凍存及其他 遺傳穩(wěn)定的分泌異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，可舉行擴大，然后命名、凍存。 雜交瘤細胞株的建立，是為了獲得持續(xù)分泌單克隆抗體的細胞株，以便制備各種用途的單克隆抗體。因此，需