熒光定量實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、RT-qPCF比較不同樣本中 miR-21的相對表達(dá)差異一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握實(shí)時熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)原理。2、掌握實(shí)時熒光定量PCR相對定量的分析方法。二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以 熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或 者外參法對待測樣品中的特定 DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR最 常用的方法是 DNA結(jié)合染料SYBR Green：的非特異性方法和 Taqman水解 探針的特異性方法。本實(shí)驗(yàn)中采用非特異性 SYBR Green染料法,SYBR Green I 是

2、一種結(jié)合于所有 ds DNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料， 在游 離狀態(tài)下會發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此 ,SYBR Green啲熒光信號強(qiáng)度與雙鏈 DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號 檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀、熒光定量PCR儀實(shí)驗(yàn)材料：MCF7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREE試劑盒四、實(shí)驗(yàn)步驟MCF7細(xì)胞 RNA提取（RNAiso PluS1）將生長至80%的MCF細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，準(zhǔn)備提取 RNA2）9000g,2min離心，棄掉培養(yǎng)基，加1 ml RNAiso

3、 Plus用移液槍反復(fù)吹吸直至 裂解液中無明顯沉淀，室溫（15-30r）靜置5分鐘；3）加入氯仿（RNAiso Plus的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳 白色，室溫靜置 5min；4）12,000 g 4C離心15分鐘。從離心機(jī)中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色的上清液（含 RNA）、中間的白色蛋白層（大部分為 DNA）及 帶有顏色的下層有機(jī)相。5）吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切勿吸出白色中間層） 。6）向上清中加入倍RNAiso Plus體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10分鐘。7）12,000g 4C離心10分鐘。一般在離心后，試管底部

4、會出現(xiàn) RNA沉淀。8）棄上清，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，充分洗滌管蓋和管壁，并輕彈 管底，讓沉淀浮起來，并靜置3-5 min；9）打開離心管蓋，室溫干燥沉淀幾分鐘。沉淀干燥后，加入適量（可以根據(jù)沉淀 的多少確定）的RNase-free水溶解沉淀。測濃度，記錄A260/280。1%瓊脂糖凝膠電泳（取少部分進(jìn)行跑電泳，留足夠的量做反轉(zhuǎn)錄）反轉(zhuǎn)錄試劑體積（101）RNA500 ngGene specific primers(2) RjT Mrimer1卩）5X ReverseTranscriptase M-MLV Buffer2卩）dNTP (10mM)卩）Reverse Tran

5、scriptase M-MLV卩）In hibitor (40 U/卩 1)卩）RNase-Free WaterUp to 10 卩)反應(yīng)條件：溫度：42C，45min;70C，15min.qPCR試劑體積（20卩1）2X SYBR Green10卩）FP (10 卩 l)RP(10y l)cDNA Template1RNase-free Water8反應(yīng)程序:1）stage 1:預(yù)變性,95 C，3min;2）Stage 2:循環(huán)反應(yīng)：40個循環(huán)95C，10s;60C，30s3）溶解曲線：95 C，15 s； 60C，1 min ; 95 C，15 s.五實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析RNA的質(zhì)量檢測結(jié)果n

6、 g/ul260/280260/230擴(kuò)增曲線:CXXHKXII4.nipjri£：-ii1kin Pkrl口 1o on星 OJQO1JO.OKi<5 EKXM!'PI*141102QZ2Vaa-XZXH31TCycH溶解曲線:如圖，為單一的峰，說明無非特異性產(chǎn)物，定量準(zhǔn)確。IT二g沽II峑聖號實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理Sample NameTarget NameReporterCtCt MeanMCF7miR21SYBR16.16.MCF7miR21SYBR16.MCF7miR21SYBRMCF7miR-130bSYBR22.22.MCF7miR-130bSYBRMCF7m

7、iR-130bSYBR22.MCF7GAPDHSYBR13.MCF7GAPDHSYBR13.PCR反應(yīng)結(jié)束后，得到如下數(shù)據(jù):MCF7GAPDHSYBR13.注：平行樣的 Ct值之間的差 < 時表示重復(fù)性較好 計(jì)算如下： CT(miR21)= CT(miR130b)= CT= CT(miR21CT(nR130b) miR21的表達(dá)量是miR130b的倍六.問題與思考1. 設(shè)計(jì)本次實(shí)驗(yàn) miR-21和miR-130b的RT-qPCF引物miR21: TAGCTTATCAGACTGATGTTGA莖環(huán)弓 I物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA

8、CTCAACAF Primer: AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTGR Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATH用 弓 I物）引物Blast結(jié)果：miR130b: CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT莖環(huán)弓 I物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCCCF Primer: CAGTGCAATGATGAAAGGGCAR Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATH用 弓 I物）引物Blast結(jié)果：二 Msw iHLAtT2. 熒光定量PCR與普通PCR有什么異同點(diǎn)原理不同：熒光定量PCR實(shí)時監(jiān)測與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光；普通PCR 通過檢測插入DNA中核酸染料的量來測定PCR最終產(chǎn)物量，一般是紫外光。反應(yīng)要求不同：熒光定量對擴(kuò)增片段有較高的要求，一般為 100-300bp；普通定 量可以擴(kuò)增長點(diǎn)的片段。如果不