薄層色譜的操作

1、薄層色譜的操作1. 方法原理薄層色譜是一種微量分析的分離過程，它將樣品點在以玻璃板或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上，利用流動相在特定的展開室中 將混合物中的組份推移到不同距離處，在色譜展開整個過程中，樣品的成份受到正反不同的力的作用。（1）流動相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過固定相。（2）樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極（誘導(dǎo)）-偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機理。由于樣品組份與流動相和固定相之間的相互作用力程度不同，整個毛細(xì)管流動過程中分離運動都在進(jìn)行?；谶@點，TLC系統(tǒng)（流動相和固定相）必須與樣品很好地

2、匹配。用顯色試劑處理，許多組份可在日光或紫外燈光下檢視。色譜可用肉眼或使用光密度計和照相機記錄或影像系統(tǒng)方法來評價。2. 薄層板2.1手工自制板2.1.1玻璃板的要求：用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔、 平整，最好使用厚薄12mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層板，玻璃板需洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用。玻璃板反復(fù)使用時，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗，保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最基本要求2.1.2制作方法：除另有規(guī)定外，將1份吸附劑加適量的水（如1份硅膠G 一般加3份水），在研缽中用研杵沿一個方向小心研磨至成均勻的有適當(dāng)粘稠度的膠漿，立即傾入涂布器中，均勻地向

3、前推進(jìn)涂布在玻璃板上；或按照不同涂布器的規(guī)定操作涂布；涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干，再在規(guī)定的溫度（一般為105 C 110 C）下烘約30分鐘活化，貯于干燥器中備用。薄層板的厚度一般為 0.250.5mm.。2.2商品化供應(yīng)的預(yù)制板和高效板2.2.1板的尺寸20x20cm10x20cm20x10cm10x10cm圖1不同的板尺寸TLC/HPTLC預(yù)制板有不同的規(guī)格供應(yīng)。常用的尺寸為 20x20，10x20，20x10，或10x10cm。使用的規(guī)格取決于TLC或HPTLC的類別和樣品的數(shù)目2.2.3TLC/HPTLC板的預(yù)洗及活化一般來說，色譜板應(yīng)用溶劑如氯仿-甲醇（8:2）,甚至用更

4、強的洗脫溶劑的混合物進(jìn)行預(yù)洗。具體操作可通過空白色譜展開來實現(xiàn)。色譜板預(yù)洗完后，應(yīng)在105° C加熱1小時進(jìn)行干燥，再在室溫下置放至少2小時（需采取保護(hù)措施以防止實驗室空氣中的污染物重新附著在其上面， 如放置在空的干燥器中）。3. 樣品點樣3. 1點狀點樣和條帶狀點樣每次點樣前，TLC/HPTLC板應(yīng)在正常光線下和紫外燈下用肉眼檢查薄層的損傷情況和雜質(zhì)，只有無損傷、清潔的TLC/HPTLC板方可使用。樣品可進(jìn)行點狀或條帶狀點樣。要想獲得最佳的薄層分辨率，必須保證移行方向中的起點要小，常規(guī)的TLC薄層點狀點樣每次點0.5至5微升， 相比之下，HPTLC薄層最大點樣量為1微升。點樣量較大

5、的樣品可使用自動化裝置點樣，噴霧成條帶狀是一種可以點樣量大而同時又能促成最有效分離的點樣方法。在常規(guī)操作過程中，人工點樣一般使用微量毛細(xì)管（0.5/1/2/3和5?1）,點樣時毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸TLC/HPTLC板面，不要損傷薄層，受損的薄層會導(dǎo)致溶劑不規(guī)律地流動而在色譜上產(chǎn)生失真的TLC譜帶。人工點樣建議使用Nanomat。它點樣位置精確并安全，使薄層免于受損。用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)干燥Nanomat也可用作單個量的多次點樣。樣品體積大于5?l，通常用如Linomat或AutomaticTLCSamplerlll的方法用氮氣噴霧成窄條。若（就是）要求點狀樣品點樣，Lin

6、omat和AutomaticTLCSamplerlll 應(yīng)將條長度設(shè)定在1至2mm。3.2樣品點樣位置起點的最佳位置如圖2和3所示。起點下緣的最小距離b取決于溶劑量。兩個起點之間的距離 c必須令平行移行的主成份不會相互觸及。點狀點樣時原點的直徑應(yīng)小于或等于3mm （高效板原點的直徑應(yīng)更?。瑮l帶的長度d由點樣樣品體積或樣品的種類和相對于板的尺寸點樣的數(shù)目來決定。到板側(cè)邊的距離a必須足夠大以避免分離區(qū)失真變形（見圖 2和3）。圖2 :斑狀樣品點樣的一般點樣位置（a=20mm,b=10mm,c=兩起點之間的距離。）圖3:條狀樣品點樣的一般點樣位置（a=20mm,b=10mm,c=兩起點之間的距離，

7、d=條的長度）。4層析4.1展開室4.1.1直立式雙槽展開室具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可控制展開箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點。4.1.2水平展開室可以從薄層板的兩側(cè)向中間水平地展開，這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個數(shù)比常規(guī)上行展開的薄層板增加一倍。4.1.3自動展開室（AMD）可使用五種溶劑對同一薄層進(jìn)行多次展開，自動控制預(yù)飽和、展開方式、展開距離和干燥條件，分離效率比傳統(tǒng)方式提高三倍（可在80mm之內(nèi)分離40種成分），符合 GLP/GMP要求。4.2.溶劑使用的溶劑必須是分析純'或色譜純”溶劑組成采用體積量比（如正丁醇-冰乙酸冰=4： 1： 1, V/V/V ），或者絕對量（如18ml甲苯+2m

8、l甲醇）。 其總量應(yīng)足以使TLC/HPTLC板的浸入深度約為5mm。展開劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用，如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上 層或下層），備用。在雙槽展開室中，對每種類型和規(guī)格和層析板，每槽通常注入的溶劑數(shù)量如表3。表3:板的規(guī)格板的尺寸（寬滴）溶劑量預(yù)制板 20X20cm2CK 10cm1CK 10cm25ml15ml8ml高效板 20X10cm1CX 10cm10ml5ml4.3展開室狀況溶劑的蒸氣相在展開箱中也參與色譜展開而形成三維的層析過程，展開箱的氣體空間在層析過程中起著重要的作用。以下有四種常見的情況（A、B、C、和 D）o4.3.1方法A （展開室不飽和

9、）方法A的特點：l不呈飽和狀態(tài)l無濾紙l只有一個槽內(nèi)有溶劑丨每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板l薄層向里（如圖4）圖4:有溶劑和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法A的操作程序：TLC/HPTLC板在倒入相應(yīng)量的展開劑后立即放至展開室中，薄導(dǎo)層板應(yīng)垂直地豎放在溶劑中，薄層向里，展開室蓋上后層析立即展開。對某些分離過程，在產(chǎn)品專用方法中有明確的說明時，另一槽可盛放一些調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。4.3.2方法B （部分飽和，無濾紙）方法B的特點：l不完全飽和l無濾紙l在兩個槽內(nèi)盛放溶劑丨每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板丨薄層向里（如圖5）圖5:有溶劑和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方

10、法B的操作程序：將展開劑倒入至兩個槽內(nèi)，蓋上蓋子，置放 15分鐘后，將蓋子移向一邊，TLC/HPTLC板涂層向時地豎放入溶劑中，蓋上展開室，讓TLC/HPTLC板開始展開。對某些分離過程，在產(chǎn)品專門方法中有明確的說明時，另一槽可放置調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。433方法C （展開室飽和，有濾紙）方法C的特點：丨用放入濾紙使飽和（至少30分鐘）丨在兩個槽內(nèi)盛放溶劑丨每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板丨薄層面向濾紙（如圖6）l圖6:有溶劑、濾紙和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法C的程序：將展開劑倒入至兩個槽內(nèi)，將與展開室相同型號的濾紙（如 CAMAG序號022.5243 ）用規(guī)定量的溶劑濕

11、潤后貼在玻璃展開室正面，蓋上蓋子，放置30分鐘（標(biāo)準(zhǔn)時間），然后將蓋子移向一邊,TLC/HPTLC板薄層面向著濾紙豎放入溶劑中，蓋好展開室讓板進(jìn)行層析。對某些分離過程，在產(chǎn)品專用方法中有明確說明時，另一槽可置放調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。4.3.4方法D （展開室飽和，薄層預(yù)穩(wěn)定）方法D的特點：丨薄層預(yù)穩(wěn)定，放置濾紙使展開室飽和丨溶劑量增加一倍丨每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板丨薄層面向濾紙（如圖7）圖7:有溶劑，濾紙和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法D的程序：將展開劑倒入至一個槽內(nèi)，將與展開室相同型號的濾紙（如 CAMAG序號022.5243 ）用規(guī)定量的溶劑濕潤后貼在玻璃展開室正

12、面，另一槽空著,TLC/HPTLC板薄層面向濾紙地置放在空槽中，除非產(chǎn)品專用方法另有規(guī)定，15分鐘（標(biāo)準(zhǔn)時間）后，穩(wěn)穩(wěn)地傾斜使足夠量的溶劑移至有TLC/HPTLC板的槽中（圖8,只有用20x20和20x10cm的展開室才能這樣做；若為10x10cm的展開室，溶劑需從外部用移液管或類似器材實現(xiàn) 轉(zhuǎn)移）。圖8 :傾斜的雙槽展開室圖9:有溶劑，濾紙和經(jīng)預(yù)穩(wěn)定TLC/HPTLC板的雙槽展開室，層析開始4.4參數(shù)4.4.1溫度薄層色譜分析一般在室溫中進(jìn)行。對這過程，溫度在 20-25?C算不上是臨界值。在這過程，中無短期的溫度波動才是更為重要（避免抽風(fēng)）。展開室應(yīng)放置在無直射陽光和不通風(fēng)處。溫度波動對層

13、析結(jié)果不利，故將展開室放在靠近窗口或熱源處是欠妥的。4.4.2空氣濕度空氣濕度極高或極低主要影響有非極性溶劑體系的無機涂層。相對空氣濕度高于 70-80%會影響薄層鈍化，使Rf值增加。樣品點樣后，TLC薄層 可置放在適當(dāng)?shù)牧蛩岷退幕旌衔锏纳厦娌簧儆?0分鐘，調(diào)整至指定的相對濕度。有關(guān)這方面的更多資料可從HPTLCVario系統(tǒng)的操作手冊中獲得。另一方面，在樣品點樣前，TLC/HPTLC板可在105?C再活化30分鐘進(jìn)行干燥。然后薄層必須用一塊玻璃板保護(hù)起來，只有起點區(qū)露出以便于樣品點樣。若空氣太干燥，可在干燥器中將 TLC/HPTLC薄層置于水的上方以達(dá)到所要求的狀況。確定合適的層析條件的有

14、效方法（用規(guī)定的濕度，溶劑蒸汽或溶劑調(diào)整使薄層達(dá)到要求的狀況）是使用HPTLCVario體系。控制相對濕度用的硫酸溶液下表：相對濕度所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml）+水（ml）32%47%42%58%65%72%88%68.010050.010057.010039.510034.010027.510010.81005. 層析后衍生作用若層析板分離的物質(zhì)肉眼看不見又不能被紫外光活化，需加試劑方能顯色或發(fā)射熒光者，則需使用適當(dāng)?shù)脑噭┙n或均勻噴灑于薄層板面上，直接觀察或加熱顯色后觀察。加熱顯色者須注意加熱時間和溫度，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板，加熱溫度過高或時間過長，容易引起板面的焦化，如用硫

15、酸等顯色劑更易造成板面的炭化而影響顯色效果。有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時間長短不同或放置時 間不同均可能使斑點的顯色有所改變。有的品種可熏以試劑或試液的蒸氣（如碘蒸氣、氨蒸氣）顯色。5.1噴霧試劑溶液以氣溶膠的形式均勻地噴灑在薄層上。電動的TLC噴霧器用最少的試劑溶液產(chǎn)生幾近理想的氣溶膠。5.2浸漬使用適當(dāng)?shù)脑O(shè)備如色譜浸漬設(shè)備III （ChromotogramlmmersionDevicelll ） ,TLC/HPTLC板浸漬具有重現(xiàn)的結(jié)果。通過設(shè)定垂直方向速度（進(jìn)入，抽 出）和規(guī)定停留時間，浸漬條件可被精確地標(biāo)準(zhǔn)化。6. 檢測6.1定性分析（同一性試驗）在相同

16、的狀態(tài)下（相同類型的TLC/HPTLC板、相同的溶劑體系組成、相同的組份點樣體積和其它TLC設(shè)備系統(tǒng)），樣品成份的Rf值、顏色、與專用的或特殊基因衍生化試劑的反應(yīng)和參考物或標(biāo)準(zhǔn)物在同一TLC/HPTLC板同時層析所得的結(jié)果相符時，未知物就可認(rèn)為是存在而被鑒別出來。分析的結(jié)果可以采用照片，照片復(fù)制品，影像記錄（如：CAMAG薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)）或 TLC掃描儀方法記錄下來。當(dāng)混合物物質(zhì)被測試時，參考標(biāo)準(zhǔn)物中單個餾份的Rf值可能會與純物質(zhì)的Rf有所不同，但測試物理學(xué)餾份和標(biāo)準(zhǔn)化餾份的hRf值必須相符，其DhRf在±3之內(nèi)。為增加測試物與參照物同一性的可信度，采用TLC掃描儀實時記錄其紫

17、外光和可見光圖譜并進(jìn)行比較。多波長測定將測試物和參照物的圖譜情況和hRf值相關(guān)聯(lián)供進(jìn)一步鑒別。6.2定量分析（儀器：CAMAGscanner-3 ;具體操作請參考操作手冊或教學(xué)軟件）定量分析采用光密度掃描法來評價。用 winCATS軟件控制薄層色譜掃描儀以及進(jìn)行掃描結(jié)果的數(shù)據(jù)處理，計算出各成分的峰高和峰面積及其 平均值和離散系數(shù)（CV）或置信窨（CI）。通過單水平或多水平校準(zhǔn)計算出結(jié)果。最后以報告形式將所有掃描參數(shù)、原始資料及圖像結(jié)果保 存及打印。掃描狹縫寬度根據(jù)被測成份斑點的大小來調(diào)整（1 ）點狀點樣得到TLC中各成份，掃描其全寬度；（2）條帶狀點樣，通?？梢話呙杵渖V帶 同心部份的50-7

18、0%。物質(zhì)的掃描波長可以通過光譜掃描來決定。TLC/HPTLC板空白部位的漫射反射光用光電倍增器（PM）來收集并定其值為10%（ =0%吸收）。掃描吸光物質(zhì)時，其吸收隨著物質(zhì)的量而 增加。對于具有熒光或可轉(zhuǎn)變成具熒旋光性衍生物的物質(zhì)的測定。光源一般使用發(fā)射光譜在254-578nm之間的高壓汞蒸汽燈，在254，302，313，366，405，436，546和578nm處有特別高強度的譜線。吸收了選擇性激發(fā)波長后TLC中各成份發(fā)射出的較長波長熒光由光倍增器記錄下來，使用銳截止濾波器或窄帶濾波器將會阻止 TLC/HPTLC板反射的激發(fā)波長光到達(dá)光電倍增器。和吸附測定一樣，熒光強度作為板上定位的函數(shù)

19、作圖得模擬曲線（熒光定位曲線）（圖 10）。TLC掃描儀的測定原理在有關(guān)的設(shè)備文獻(xiàn)中有報導(dǎo)。熒光測定比吸收測定優(yōu)越在于如下幾點：（1）檢出極限低1-3個數(shù)量級；（2）在較寬的濃度范圍內(nèi)校準(zhǔn)曲線呈線性；（3）選擇性較高。圖10： a）有好幾個成份的TLC/HPTLC板b）TLC/HPTLC板的模擬曲線在測定極限以上所有的檢測成份可被量化。在檢出極限以上而在測定極限以下的檢測成份會給出檢出和測定極限的平均值（作為結(jié)果）。7. 標(biāo)準(zhǔn)條件下述的兩個標(biāo)準(zhǔn)條件對不同的板規(guī)格適用。在產(chǎn)品專用試驗方法中，應(yīng)參考這一普通的分析方法。標(biāo)準(zhǔn)條件或?qū)?biāo)準(zhǔn)條件的偏差必須限定。7. 1HPTLC 板10x10和20x10

20、cmHPTLC預(yù)涂板的標(biāo)準(zhǔn)條件總結(jié)如下以便于參考。薄層商品化生產(chǎn)的HPTLC板規(guī)格10x10和20x10cm板；由樣品數(shù)目決定點樣用毛細(xì)管移液管或Nanomat進(jìn)行斑狀點樣或用自動點樣器作條狀點樣數(shù)量一般，斑狀點樣用20nl-1ml,窄條點樣用2-20ml定位起點在距板下緣10mm處溶劑數(shù)量限定采用體積量或絕對量。一般，對10x10cm雙槽展開室的一個槽加5ml,對20x10cm雙槽展開室的一個槽加10ml分離距離5cm展開室對10x10或20x10cm板用雙槽展開室分離模式線性（上行式或水平的）飽和（A）無濾紙放入；溶劑和TLC/HPTLC板同時加入到展開室中。（B）無濾紙放入；至少在層析展

21、開開始前 10分鐘將溶劑倒入至展開室中。（C） 放入濾紙；至少在層析展開開始前30分鐘將溶劑倒入至展開室中。（D） 放入濾紙；用溶劑蒸汽將在無溶劑的空槽中的 TLC/HPTLC板調(diào)整其狀況不少于10分鐘。將展開室傾側(cè)使層析展開開始。這方法只在用 20x10cm板的雙槽展開室適用。用10x10cm板的雙槽展開室，溶劑需從外面用移液管或類似方法注入。溫度室溫，通常為20-25?C空氣濕度無機薄層必須在室溫，相對濕度 50-60%下達(dá)到平衡檢測如各相應(yīng)的方法所規(guī)定7. 2TLC 板20x20和10x20cmTLC預(yù)涂板的標(biāo)準(zhǔn)條件總結(jié)如下以便于參考。薄層商品化生產(chǎn)的TLC板規(guī)格20x20cm , 20

22、x10cm或10x20cm （標(biāo)準(zhǔn)的）板；由點樣樣品數(shù)目決定點樣斑狀點樣用標(biāo)準(zhǔn)的用后即棄的毛細(xì)管移液管，條狀點樣用自動點樣器數(shù)量一般，斑狀點樣用1ml-5ml,條狀點樣用2-20ml定位起點在距板下緣15mm處溶劑數(shù)量限定采用體積量或絕對量。一般，對 20x10cm雙槽展開室的一個槽加15ml,對20x20cm雙槽展開室的一個槽加25ml分離距離對20x20cm 展開室為12cm，對20x10cm 展開室為7cmi展開室對20x20或20x10cm板用雙槽玻璃展開室分離模式線性（上行式或水平的） fI飽和（A）無濾紙放入；溶劑和TLC/HPTLC板同時加入到展開室中。（B）無濾紙放入；至少在色

23、譜展開開始前 10分鐘將溶劑倒入至展開室中。（C） 放入濾紙；至少在色譜展開開始前30分鐘將溶劑倒入至展開室中。（D） 放入濾紙；用溶劑蒸汽將在無溶劑的空槽中的 TLC/HPTLC板調(diào)整其狀況不少于10分鐘。將展開室傾側(cè)使色譜展開開始。這方法只在用 20x10cm板的雙槽展開室適用。用10x10cm板的雙槽展開室，溶劑需從外面用移液管或類似方法注入。溫度室溫，通常為20-25?C空氣濕度無機薄層必須在室溫，相對濕度 50-60%下達(dá)到平衡檢測如各相應(yīng)的方法所規(guī)定鋪板鋪板用的勻漿不宜過稠或過稀：過稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋； 過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水= 1:2 3,硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越 稠越難下滴。勻漿的稀