關于細胞自噬的相關研究成果

1、關于細胞自噬的相關研究成果姓名：陶宗 學院：化學化工學院專業(yè)：化學 學號：160106010012021年度諾貝爾生理學與醫(yī)學獎剛揭曉不久,獲獎者為日本科學家大隅良典 (Yoshinori Ohsumi),以獎勵他在“細胞自噬機制方面的發(fā)現(xiàn).細胞自噬這是細胞組分降解與再利用的根本過程.“自噬" (autophagy尸詞源于希 臘語前綴“auto-",意為“自我,以及另一個希臘語單詞“ phagein,意為“吞食, 因此,自噬作用的意思非常明確,那就是“自我吞噬.“自噬的概念由比利時科學家 Christian de Duve在1963年溶酶體國際會議上首 先提出,是指一些需降

2、解的蛋白質和細胞器等胞漿成分被包裹,并最終運送至溶酶體降 解的過程,自噬性降解產生的氨基酸和其他一些小分子物質可被再利用或產生能量.現(xiàn) 已明確,自噬的主要功能之一實際上是在細胞受到應激性的死亡威脅時保持細胞的存 活,這是真核細胞維持穩(wěn)態(tài)、實現(xiàn)更新的一種重要的進化保守機制.雖然廣義上的自噬 包括巨自噬(macroautophagy)微自噬(microautophagy劑分子伴侶介導的自噬 (chapeon-mediated autophagy種類型,通常所說的自噬即指巨自噬,也是目前研究最 多的.對這一過程開展研究非常困難,這也就意味著我們對其知之甚少.直到上世紀1990年代,在經過一系列出色的

3、實驗之后,日本科學家大隅良典利用 面包酵母找到了與自噬作用有關的關鍵基因.隨后他開始致力于說明酵母菌體內自噬作用的背后機制,并發(fā)現(xiàn)與之相似的復雜過程也同樣存在于我們人類的細胞內.大隅良典 的研究更新了我們關于細胞物質循環(huán)的舊有觀點,他的研究開啟了理解自噬作用在許多生理過程中關鍵作用的嶄新道路,如生物體對于饑餓的適應或者機體對于感染的反響. 自噬基因的突變會導致疾病的發(fā)生,自噬作用機制在一些類型的疾病,如癌癥和神經疾 病等病癥中也發(fā)揮了作用.我們人體的細胞內部擁有很多不同功能的細 胞器,而溶酶體只是其中的一種,其內部含有能 夠消化自身細胞器的特殊酶.在細胞體內還能觀 察到大量存在的,被稱作“吞噬

4、小體的特殊囊 體.隨著吞噬小體的形成,它會不斷包裹細胞內 部物質,如那些受損的蛋白質和其他細胞器.最 后,這些小體會與溶酶體相結合,這一機制為細 胞提供了營養(yǎng)與物質更新的途徑.20世紀70年代至80年代,研究人員主要專注于研究另一套用來降解蛋白質的系統(tǒng),學習參考 即“蛋白酶體proteasome在該研究領域,阿龍-切哈諾沃Aaron Ciechanover卜阿夫 拉姆-赫什科Avram Hershko和美國科學家歐文-羅斯Irwin Rose被授予2004年諾貝爾 化學獎,以表彰他們在泛素調節(jié)的蛋白質降解研究領域中的卓越成就.蛋白酶體雖然能 有效地逐步降解蛋白質,但該機制仍未能解釋細胞是如何消

5、除大型蛋白質復合物和受損 的細胞器.二、細胞自噬的研究方法目前,人們對自噬的檢測主要包括基于檢測自噬體的直接觀察自噬體的形態(tài)和 間接檢測自噬體外表蛋白標記的方法以及基于自噬性降解原理設計的一些方法.除 此之外,還可通過對自噬通路的調控來全面評價自噬功能對細胞行為或機體功能的影 響,如自噬抑制或激活劑、自噬相關基因的敲除及沉默等.近年來,一些自噬基因缺陷 的動物模型及體內自噬活性分析方法的建立使得自噬研究設計更為合理、結果更具有說服力.需要特別指出的是,在有些文獻上能看到通過一些熒光染料如 lysotracker、 monodansylcadaverine acridine orang8標記的方

6、法檢測溶酶體的數(shù)量和活力來反映自 噬,目前認為這種方法缺乏特異性,不能夠代表自噬的出現(xiàn).止匕外,還有檢測一些自噬 相關蛋白如Beclin-1、Atg5的mRNA及蛋白質水平表達的方法,實際上,這也不能 夠反映自噬的激活,由于在自噬過程中,這些蛋白的激活表現(xiàn)在其譯后的修飾以及蛋 白間的相互作用,而并不是表達量的增加.在對待以上兩種方法得出的結論時需理性看 待,預防盲從.一自噬性結構的電鏡下形態(tài)學觀察一一自噬檢測的金標準透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經典的方法.電鏡檢測自噬主要是基 于識別自噬體結構,半個世紀前科學家就借助電鏡最先觀察到了自噬體結構.自噬體通 常是雙層膜結構包含著未消化的

7、胞漿成分或細胞器如線粒體、內質網片段,并未與 溶酶體融合.電鏡下自噬體內容物的形態(tài)和電子密度與胞漿中的一致,因此容易識別. 自噬體融合成自噬溶酶體后,那么變成單層膜結構,其中含有降解不同階段的胞漿成分. 一般來說,降解的物質電子密度會增加,形成黑色顆粒狀或不定形的聚集,因此也能夠 識別1-2.只是對于晚期自噬溶酶體無法識別內容物質的來源.在實際操作的時候,如 沒有特殊的標記是難以區(qū)分自噬體、自噬內涵體和自噬溶酶體等不同成熟階段結構的, 因此,只能根據(jù)其內容物的結構完整情況大致用初始自噬囊泡 AVi和降解自噬囊泡 AVd來表示,其中AVi內含的胞漿物質結構完整,AVd內容物那么被不同程度降解3-

8、4.二基于自噬體標記蛋白LC3的檢測方法自噬過程由一系列自噬相關蛋白Atg蛋白介導完成,這些蛋白質在自噬體形成的學習參考不同階段發(fā)揮作用.微管相關蛋白1輕鏈3 microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3/Atg8是自噬體膜上的標記蛋白.細胞內存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-1和LC3- II.LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3- I , LC3- I散在分布 于細胞漿內.當自噬體形成后,LC3-1和磷脂酰乙醇胺phosphatidylethanolamine, PEE偶聯(lián)形成LC3- H并定位于自噬體內膜和外膜.與

9、其他一些定位于自噬性結構膜上的 Atg 蛋白不同僅在自噬過程的某一階段發(fā)揮作用,LC3-R始終穩(wěn)定地保存在自噬體膜上 直到與溶酶體融合,因此被用來作為自噬體的標記,且 LC3-R的水平在某種程度上反 映了自噬體的數(shù)量5.三基于自噬性降解的檢測一一“自噬潮分析自噬過程是動態(tài)變化的,而自噬體僅是整個自噬通路過程中的一個中間結構.要說 明細胞自噬活性的強弱,必須通觀整個自噬的過程是否順利,即通過基于自噬性降解的 自噬潮autophagic flux分析來進一步說明自噬活性.自噬潮是一個動態(tài)連續(xù)的概念, 涵蓋了自噬體的形成、自噬性底物向溶酶體的運送以及在溶酶體內降解的整個過程.顯 然,對這整個過程進行

10、監(jiān)測較單純自噬體檢測更能反映自噬活性,因此“自噬潮分析 是反映自噬活性的可靠指標6o四自噬的實驗性調控通過人為的干預來激活或者抑制自噬功能后觀察細胞行為或效應分子的變化能夠 使研究結論更具有說服力.目前,實驗性激活或者抑制自噬的方法有藥物處理、自噬基 因敲除、沉默或過表達.常用的抑制自噬及誘導自噬的藥物及機制如表1所示.這些工具藥普遍存在的缺陷就是特異性不強,在抑制自噬的同時對細胞其他代謝過程也可能會有影響.如3-MA抑制ClasslH PI3K的同時對Classi PI3K同樣也有抑制作用,繼而抑 制Akt/mTOR通路,激活自噬.表1常用的自噬抑制劑和q噬湫語劑 Table 1 InJub

11、itor and Ktiv aior of autnpli珥q街也照里理日噬抻制制*MA押物C lais Ml P13K .卻:利日咬沐2 F冰長春花修,ndWvn,*、hafllMnydn AIP1押物閂版體匕薪陶值的挈fiha日lomycin Al s,氟地綻,氟啤切斷清物體解化FMdl pep staiin X抑也瀟酷倬擊1附活件日啤用活況材工缺乏1琳回星:超M乏一比秀東 及凡MJ 杭Tiirinl ffl PP24JI ,chTOR上沖|刑Uthuiii'14押?明版單睛仲幽門公仁f；成系用酷m代ABT罔作.BiLS把 D附*加.gJ聞：,岫比；傳1I r?hak3J和 Kma

12、LL-£nLd$£uJc ？nhaiKCrs cl rapaiiytanJ1不明五體內自噬分析學習參考體內自噬分析的策略有三種：一是傳統(tǒng)的基于對組織切片標本進行電鏡觀察和LC3蛋白的檢測7.二是應用GFP-LC3轉基因小鼠實現(xiàn)體內自噬的實時監(jiān)測8, Tian等9應 用該轉基因小鼠,然后借助于體內成像技術經顱骨檢測實驗性腦卒中后缺血腦組織區(qū)域 GFP熒光強度,實驗結果與活體外的 Western blot及熒光免疫組化的結果一致.三是通 過構建自噬相關基因缺失的實驗動物, 這為研究自噬在機體水平所發(fā)揮的作用并驗證體 外試驗的結果提供了很好的平臺.但是,自噬在體內是隨時間不斷變化

13、的,要想準確反 映這種變化,必須實現(xiàn)體內自噬活性的實時監(jiān)控,而僅憑觀察到的自噬體出現(xiàn)無法說明 自噬活性的改變.自噬的研究中,首先必須分清形態(tài)學和功能學檢測的不同,預防將某一特定生理條 件下檢測到的自噬現(xiàn)象或自噬的缺失歸于自噬功能的改變.其次要清楚當前大局部 自噬檢測方法普遍反映的是自噬在某一特定“空間點的變化,自噬是一個隨時間不斷 變化的動態(tài)過程.因此,用靜態(tài)的方法去研究動態(tài)的過程得出的結論不可預防地存在一 定的局限和偏倚.換句話說,我們檢測的結果可能并未反映細胞內自噬活性的真正變化 趨勢,目前對于自噬在某些生物學過程中所發(fā)揮的作用一直沒有定論,如在自噬與月中瘤 的研究中,自噬是促進月中瘤還是

14、抑制月中瘤,不同的研究有不同的結論.作者認為,歸根 結底可能還在于我們對自噬的熟悉,即自噬檢測方法的局限性.任何一種方法單獨應用 均不能作為自噬的依據(jù),因此,在對任何一種方法得到的結果進行解釋時,必須慎重, 特別是不能僅根據(jù)自噬體的增多減少或自噬相關蛋白表達的上下就草率地得出自噬增 強或減弱的結論.實際上,這是目前許多研究無視的一個重要問題.學術界已經達成的 傾向性共識,建議在選擇自噬研究方法及結果解釋時需考慮以下問題：a.聯(lián)合不同檢測原理的方法；b.借助不同的檢測技術,預防單一技術的局限性；c.形態(tài)和功能并舉, 以形態(tài)學檢測為根底,注重整個自噬通路的變化；d.體內體外結果互相驗證；e.預防將

15、形態(tài)學的結果盲目地解釋為功能的變化,預防將體外的結果盲目地理解為體內的情 形,以求準確全面地反映自噬在各種生物學過程中的作用 10.總之,在準確可靠的自噬 功能檢測及監(jiān)控方法問世前,我們還是應該以一個理性的態(tài)度去看待不同的研究結論, 更應該慎重地將研究結論應用于臨床治療.三、細胞自噬發(fā)生的分子機制一自噬誘導階段細胞在能量缺乏、氧化應激、運動刺激或細胞器和蛋白質累積時, 能誘發(fā)細胞自噬. 經典的誘導途徑是通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mammalian target of rapamycin,mTOR與UNC-51樣酶UNC-51 like kinase 1,ULK1 復合物之間的作用來實現(xiàn)的. U

16、LK1復合物主要包括ULK1 酵母中Atg1的同系物、FIP200 酵母中Atg17的同系 物和mAtg1311.但對自噬誘導起最直接、最重要作用的是ULK1.最近發(fā)現(xiàn)一種自學習參考噬蛋白Atg101,它能與mAtg13結合并預防其降解,還能通過 mAtg13與ULK1相互作 用,從而有助于自噬體的形成12o當能量充足時,mTOR被激活,使mAtg13和ULK1高度磷酸化,此時ULK1活性 很低,細胞自噬保持根底水平.營養(yǎng)缺乏時,mTOR被抑制,mAtg13和ULK1去磷酸化并形成mAtg13-ULK1復合物,同時活化ULK1,活化的ULK1能磷酸化FIP200, FIP200 又增強mAtg

17、13-ULK1的相互作用,最終自噬得以激活13.最近有研究說明,細胞氧化 應激時,AMPK能直接磷酸化ULK1 Ser317位點和Ser777位點,從而激活ULK1 14. 而mTOR那么通過磷酸化ULK1 Ser757位點抑制ULK1.氧化應激時,mTOR受抑制,對 ULK1的磷酸化作用減弱,而AMPK那么通過增強對ULK1的磷酸化激活,誘導細胞自噬 圖 1.ULKULK1Glunnm門 'tarvnlinnA, BN»Jtrif>nT-rirhtinnfi圖1 mTOR和AMPK對ULK1復合物的調節(jié)示意圖引自 Mao K 15自噬得以誘導后,由mVps34復合物A

18、tg14-Vps15-mVps34啟動膜泡的成核反響, 并使自噬蛋白Atg21、Atg24結合到膜上,形成前自噬體pre-autophagosomalstructure,PAS 16.二自噬體形成階段PAS形成后,膜泡擴張并將底物包繞,形成自噬體.自噬體的形成涉及2種泛素化系統(tǒng),分別是Atg12-Atg5和LC3-H 酵母Atg8的同系物-磷脂酰乙醇胺LC3-II的酯化是可逆的,可在phosphatidylethanolamine, PE復合物系統(tǒng).Atg12-Atg5復合物的形成類似于泛素化 過程,需要泛素活化酶Ei和泛素結合酶E2的參與,但無E3的參與.該系統(tǒng)中扮演這種 角色的分別是Atg

19、7和Atg10.首先由Ei酶Atg7與Atg12結合并激活Atg12,后者被E2 酶Atg10催化,再與Atg5結合,最后Atg12-Atg5與Atg16形成Atg12-Atg5-Atg16多聚 體,并結合到PAS上,參與自噬體的擴張17.LC3-H-PE多聚體的形成需要通過 Atg4 裂解LC3并暴露其甘氨酸殘基,從而形成 LC3- I ,而后與Ei酶Atg7共價結合并被激 活,激活后與E2酶Atg3形成LC3- I -Atg3復合物,最后與PE以酰胺鍵形式結合成LC3- n-PE18,并與膜緊密連接參與PAS的延伸圖2學習參考Atg4的作用下水解并解離,釋放回胞漿圖2自噬體形成過程中的 2

20、種泛素化樣系統(tǒng)示意圖引自 Kang R19三成熟降解階段自噬體通過微管骨架運輸?shù)饺苊阁w,其外膜與溶酶體融合,內容物被水解酶降解.該階段有Lamp2、小GTP蛋白Rab7、紫外線放射抗性相關蛋白ultraviolet radiation re-sistance-associated gene protein, UVRAG 等因子參與.Saftig 等20發(fā)現(xiàn),Lamp2 基因 敲除小鼠細胞中,溶酶體并未聚集到特定區(qū)域,而是彌散性地分布在胞漿中,這樣自噬 體就不能與溶酶體融合.Liang等21發(fā)現(xiàn),Rab7可通過與脂分子尾部作用并定位于膜泡 外表,UVRAG能活化Rab7,后者能準確將囊泡運送到靶

21、位點.四、自噬和腫瘤的關系一自噬在腫瘤發(fā)生中的雙重作用在多種人類月中瘤中均存在自噬活性的改變. 一方面,自噬可抑制月中瘤的發(fā)生：首先, 自噬可消除受損細胞器以預防有害的氧自由基蓄積及突變的發(fā)生.其次,自噬可限制 DNA損傷,維持基因組完整性.在永生化鼠腎上皮細胞中自噬活性降低可導致細胞 DNA 損傷,基因擴增,染色體非整倍性,從而增加了致癌性突變率,促進了月中瘤的發(fā)生 220 再次,自噬可抑制細胞生長,誘發(fā)凋亡性細胞死亡.另一方面,自噬通過限制細胞壞死 和炎癥促使腫瘤細胞存活于代謝性應激的環(huán)境中,尤其是當抗凋亡基因BCL-2蛋白表達 增加抑制凋亡時.盡管大多數(shù)月中瘤細胞的自噬活性降低,但仍然有

22、一些月中瘤細胞保持了 較高的自噬活性,如大腸癌、肺癌細胞及人子宮頸癌 HeLa細胞等.自噬還是月中瘤轉移 中細胞脫離細胞外基質后成活的重要機制,對月中瘤轉移有重要的促進作用23.研究說明,在缺乏血清或氨基酸3 h情況下,HeLa細胞中的自噬從4%上升到37%. 這些月中瘤細胞所具有的高自噬活性能增強月中瘤對應激的適應性,對月中瘤細胞在惡劣環(huán)境中的生存起到了一定的保護作用.當快速生長的月中瘤細胞缺乏營養(yǎng)時,實體月中瘤內部血學習參考 供不良,癌細胞利用自噬機制對抗營養(yǎng)缺乏和缺氧,通過降解胞內蛋白質及細胞器為腫 瘤細胞的生長提供營養(yǎng)及能量,可能利于月中瘤細胞在低血管化的環(huán)境中生長.二自噬機制在腫瘤治

23、療中的應用一些抗月中瘤藥物通過誘導自噬活性來抑制月中瘤細胞的增殖.如產薈大黃素可誘導鼠C6神經膠質瘤細胞發(fā)生自噬性死亡；他莫昔芬可誘導MCF-7細胞發(fā)生自噬性死亡；三 氧化二種也可誘導細胞自噬性死亡來緩解淋巴細胞性白血病和多發(fā)性骨髓瘤的病情24 c由于在多種腫瘤中自噬活性降低,因此有人將自噬看成是月中瘤治療的一個新靶點,尤其 是針對一些對抗凋亡的月中瘤細胞,引導自噬性細胞死亡的治療方案變得很有吸引力.然 而,也有一些抗癌治療引發(fā)的自噬反響對月中瘤細胞起保護作用,抑制自噬可增強治療效 果.如用c-Myc誘導的鼠淋巴瘤,當用氯唾抑制細胞自噬活性時,可增強 p53或DNA 烷化劑誘導腫瘤細胞死亡的作

24、用,引起腫瘤消退 25.在A549細胞中,紫杉醇促使細胞 凋亡性死亡并誘導自噬,如果預先給予自噬抑制劑3-MA或siRNA對抗自噬基因Beclin-1,紫杉醇誘導細胞凋亡的作用可得到增強26o有研究者認為自噬為月中瘤細胞提供了一種逃避凋亡的機制,導致腫瘤對藥物的耐 受.Herman-Antosiewicz等27用萊版硫烷處理人前列腺癌細胞時可誘發(fā)自噬,但這種自 噬可抑制前列腺癌細胞發(fā)生凋亡性死亡而使月中瘤細胞存活.止匕外,月中瘤化療、放療后自 噬活性增強,其機制是自噬去除因電離輻射、細胞毒性而受損的大分子或線粒體,阻斷 了線粒體的凋亡信號級聯(lián)傳導,使一些月中瘤對抗月中瘤藥物產生耐藥性28.用s

25、iRNA抑制Atg蛋白可增強月中瘤細胞對化、放療的敏感性.因此,也有研究者認為努力抑制自噬 可以預防其對抗治療效果.在不同類型的細胞內,同樣的刺激會引發(fā)不同的自噬效應, 可能是細胞的遺傳背景決定了其對化療的自噬應答.在月中瘤細胞中,自噬的作用可能與 月中瘤的類型、分期、性質以及機體損傷的程度有關.自噬可能在不同月中瘤或同一月中瘤的 不同階段發(fā)揮不同的作用.因此,目前尚不能盲目地將自噬誘導劑、 抑制劑應用于臨床, 應該增強開展調控細胞自噬和癌癥信號通路網絡分子進一步探索,通過調控細胞自噬水平來提升抗癌療效的深入研究.五、結論自噬是真核細胞中一種普遍而又重要的生命現(xiàn)象,廣泛參與多種生理和病理過程.

26、 雖然近年來在自噬的分子機制和調控機制等方面取得了一些進展,但自噬與凋亡、壞死 等死亡模式之間的相互依存及轉化關系、自噬的信號轉導途徑以及自噬的起源等許多問題尚不清楚,特別是自噬與月中瘤關系的研究剛剛開始,自噬究竟是抑制月中瘤還是促進腫 瘤,藥物治療誘發(fā)的自噬究竟是殺死還是保護月中瘤細胞,這些問題在研究中越來越受到 關注.學習參考參考文獻1 Mijaljica D, Prescott M, Devenish R J. Autophagy in disease. Methods Mol Biol, 2021, 648: 79-92.2 Yla-Anttila P, Vihinen H, Joki

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