BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀操作手冊(cè)資料可編輯

1、BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀操作手冊(cè)資料BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀FACS101 Handbook 本課程介紹表面抗原流式分析有關(guān)之基礎(chǔ)工作原理。如希望 進(jìn)一步了解流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用,請(qǐng)至本公司網(wǎng)站訂閱 FACSinformation 電子報(bào) /0>.tw/bdb/index.6>html。如需要本課程手冊(cè),歡迎至本公司網(wǎng)站下載 /.tw/bdb/10-5-3-1.html。如需要免疫熒光染色方法,請(qǐng)至本公司網(wǎng)站下載 /.tw/bdb/10-5-4-1.html。一、BD FACSCalibur 基本結(jié)構(gòu)1.1 儀器本體 :1. 電源開關(guān) : 在 BDFACS

2、Calibur 儀器右側(cè)下方 , 先啟動(dòng)儀器本體 , 再打開計(jì)算機(jī)。2. 光學(xué)系統(tǒng) :BD FACSCalibur 基本配有一支波長 488 nm 的氬 離子雷射以 BD FACSCalibur 基本型為例FSC Diode 只收488 nm波長散射光SSC PMT只收488 nm波長散射光FL1 PMT 熒光光譜峰值落在綠色范圍 （波長 515-545 nm）FL2 PMT 熒光光譜峰值落在橙紅色范圍 （波長 564-606 nm）FL3 PMT 熒光光譜峰值落在深紅色范圍 （波長 650 nm）3. 儀器面板 :儀器前方面板的右下方有三個(gè)流速控制鍵、 及三個(gè)功能控制鍵。 流速控制 :LO:

3、 樣品流速 :12 l /minMED:樣品流速:35 I /minHI: 樣品流速 :60 l /min功能控制 :RUN此時(shí)上樣管加壓，使細(xì)胞懸液從進(jìn)樣針進(jìn)入流動(dòng)室。（正常顯 示綠色; 黃色時(shí)表示儀器不正常 , 請(qǐng)檢查是否失壓。 ）STANDBY: 無樣品或暖機(jī)時(shí)之正常位置 , 此時(shí)鞘液停止流動(dòng) , 雷 射功率自動(dòng)降低。PRIME去除流動(dòng)室中的氣泡，流動(dòng)室施以反向壓力，將液流從流 動(dòng)室沖入樣品管，持續(xù)一定時(shí)間后，以鞘液回注滿流動(dòng)室。PRIME結(jié)束, 儀器恢復(fù)STANDB狀態(tài)。4. 儲(chǔ)液箱抽屜 :在主機(jī)左下方之儲(chǔ)液箱抽屜。 可向前拉開 , 內(nèi)含鞘流液筒、 廢液 筒、鞘液過濾器 Sheath

4、Filter, 及空氣濾網(wǎng) Air filter 。請(qǐng)注意氣 路減壓閥VENT TOGGLE位置。鞘液筒：位于抽屜左側(cè)，容積4升。裝八分滿鞘液筒 , 儀器可以運(yùn)行大約 3 小時(shí)。筒上裝有液面感應(yīng)器 , 鞘液用完時(shí) , 儀器軟件上會(huì)有顯示。 鞘液筒蓋上有金屬環(huán)扣 , 保證鞘液 筒密閉。廢液筒 ： 位于抽屜右側(cè) , 容積 4 升。筒上裝有液面感應(yīng)器 , 廢液盛 滿時(shí) , 儀器軟件上會(huì)有顯示。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。鞘液過濾器 ：0.22m 過濾器 , 去除鞘液中的雜質(zhì) , 保證進(jìn)入流動(dòng)室 的鞘液是干凈的。氣路減壓閥 ： 沿箭頭方向移動(dòng)閥門開關(guān) , 鞘液筒減壓 , 氣壓恢復(fù)正 常。在鞘液筒添

5、加鞘液時(shí) , 需要減壓?？諝膺^濾網(wǎng) ： 用于過濾冷卻雷射的空氣。5. 上樣品區(qū) ：上樣品區(qū)是樣本管的上樣位置。 它包括三個(gè)部分 , 一個(gè)是進(jìn)樣針 Sample Injection Tube, 將樣本輸入流動(dòng)室 , 還有就是支撐架 Tube Support Arm 、和液滴存留系統(tǒng) Droplet Containment System 。進(jìn)樣針 ： 是一根不銹鋼管 , 將細(xì)胞從樣本針中吸入流動(dòng)室。 進(jìn)樣管 外有一套管 , 是液滴保留系統(tǒng)的一部分。支撐架 ： 用于支撐樣本管、并負(fù)責(zé)啟動(dòng)液滴存留系統(tǒng)。支撐架有三個(gè)位置 :位于樣本管之下的中位 , 樣本管左側(cè)或右側(cè)液滴存留系統(tǒng) : 系統(tǒng)由支撐架、真空幫

6、浦和外套管組成。當(dāng)支撐 架位于左側(cè)或右側(cè)位置時(shí) ,真空幫浦就會(huì)啟動(dòng) , 將液體從外管吸入廢 液筒內(nèi)。上樣時(shí),須注意將支撐架位于中位 , 以避免過多樣品被抽吸到 廢液筒內(nèi)（當(dāng)支撐架位于中位 ,真空幫浦停止工作 ） 。更換樣品時(shí) ,讓儀 器保持RUN勺模式，使得進(jìn)樣針可以反沖；切換到STANDB模式前，確 保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流動(dòng)室中。1.2 Macintosh 計(jì)算機(jī)與打印機(jī) : 準(zhǔn)備您勺細(xì)胞樣品理想樣品濃度調(diào)至 1-10 X 105 cells/ml? 一般實(shí)驗(yàn)只需 0.5 ml 勺樣品。細(xì)胞樣品務(wù)必放至 BD FALCON 352052試管中 , 否則無法上機(jī)。 上機(jī)前務(wù)必去除樣品

7、中之細(xì)胞團(tuán)塊 , 以防止管路堵塞 ?可使用附 濾網(wǎng)BD FALCO試管Cat. No.352235 或35-55 m的尼龍篩網(wǎng)。供流式分析勺樣品是單細(xì)胞懸浮液 , 而且大部分樣品都需經(jīng)熒光 染色。表面抗原熒光染色的方法大致有兩種 : 直接免疫熒光、間接免 疫熒光染色。研究生可至本公司網(wǎng)站下載染色方法 /.直接免疫熒光染色Lysed - No - Wash ProcedureLysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27Peripheral Blood Mononuclear Cell ProcedureLeukemia and Lym

8、phoma Procedure 1Leukemia and Lymphoma Procedure2, B-cell Clonality Assay 間接免疫熒光染色滴定抗體濃度 常用試劑如因特殊因素?zé)o法下載上述實(shí)驗(yàn)方法 , 請(qǐng) e-mail:yenchichen/. 或 austin_bdtwn/. 。二、開機(jī)、關(guān)機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作 2.1 FACS Calibur 開機(jī) 開啟細(xì)胞儀電源。開啟其它周邊配備電源，如打印機(jī)及MO機(jī)。 開啟計(jì)算機(jī)。確認(rèn)鞘流液筒有八分滿的 FACS Flow, 確實(shí)旋緊 鞘液筒容量為 4L。將廢液倒掉 , 并在廢液筒中加入 200 ml 家用漂白水 廢液筒容量 為 4L。將減

9、壓閥方向調(diào)在加壓 (Pressurize) 位置。 排除液流管路與過濾器中的氣泡。取下樣品管 , 執(zhí)行 PRIME 功能兩次。使用1ml PBS,HIGH RUN兩分鐘可開始分析樣品。2.2 FACS Calibur 關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)前必要?jiǎng)幼?: 清洗進(jìn)樣管和外套管 , 防止進(jìn)樣管堵塞、 或有染 料殘留。將樣品支持架左移，取2 ml FACSCIean（10%Bleach上樣品，讓儀 器的真空系統(tǒng)抽取約 1 ml 的液體。將樣品支持架回正 , 按 HI RUN, 然后讓 FACSClean 清洗管路 10 分鐘。按Standby,取下樣品管，執(zhí)行PRIME功能兩次。取 2 ml dH2O, 重復(fù)上述

10、步驟 1-3。注意最后只留約 1 ml dH2O 在試管中。按STANDBY五分鐘,使風(fēng)扇冷卻雷射后，關(guān)閉細(xì)胞儀（必要?jiǎng)幼鳎?以保護(hù)雷射光源。 ）倒掉廢液 , 并回填 200 ml 漂白水。將減壓閥放在VENT漏氣位置。將鞘流液筒充填至八分滿。退出軟件“ File ”“Quit ”如有對(duì)話選項(xiàng) , 選擇“ Dont save ”。 確認(rèn)退出計(jì)算機(jī)中所有BD應(yīng)用軟件,所有數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)已儲(chǔ)存?zhèn)浞?。關(guān)閉計(jì)算機(jī)?！癝pecial ”“Shutdown”。三、上機(jī)分析流程 建 議首次試機(jī)避免進(jìn)行大量試驗(yàn) , 僅需準(zhǔn)備下列樣品。（1）Negative Control（不加任何抗體 ） 。（2）CD3-FITC

11、（FL1 單染 ）。（3）CD19-PE（FL2 單染） 。（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 雙染） 。3.1 Calibur 開機(jī)1. 先開啟細(xì)胞儀本體再打開計(jì)算機(jī)。 * 秘技 1: 如順序相反 , 儀 器 和 計(jì) 算 機(jī) 之 間 無 法 建 立 正 常 通 訊 , 無 法 執(zhí) 行 “ connect to cytometer ”。 解決之道 , 兩者都關(guān)機(jī)、然后以正確方式重開。2. 向前拉開儲(chǔ)液箱抽屜 , 檢查鞘液筒、廢液筒水量 , 如需充填鞘 液,將減壓閥方向調(diào)在VENT位置（箭頭方向）。3. 儀器會(huì)對(duì)鞘流液筒打氣加壓 , 請(qǐng)確認(rèn)筒蓋確實(shí)旋緊。 * 秘技 2:將減

12、壓閥方向調(diào)在加壓（向前）位置。減壓閥如在 VENT箭頭方向） 位置,按RUN功能鍵時(shí)將顯示橙黃色（表示儀器不正常，請(qǐng)檢查是否失 壓）, 正常為綠色顯示。3.2 開啟 CellQuest 軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件4. 在蘋果菜單下點(diǎn)擊 CELLQuest 啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)出現(xiàn)一' Untitled ' 實(shí)驗(yàn)文件 , 可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕 , 將實(shí)驗(yàn)文 件窗口放大5. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。 在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊 , 拖曳 對(duì)角線至適當(dāng)大小 , 然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對(duì)話方框。6. 在 出 現(xiàn) 的 散 點(diǎn) 圖 對(duì) 話 方 框 中 點(diǎn) 擊 Plot Source, 選 擇

13、 Acquisition 收取 , 確認(rèn) X 和 Y 軸參數(shù)預(yù)設(shè)為 FSC-H 1024、 SSC-H 1024。在顏色方框中點(diǎn)擊 Multicolor Gating（ 收取樣品時(shí) , 門內(nèi)細(xì)胞 將出現(xiàn)顏色）。點(diǎn)擊0K此時(shí)實(shí)驗(yàn)文件會(huì)出現(xiàn)FSC/SS（散點(diǎn)圖。7. 說明：散點(diǎn)圖（Dotplot）,又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用 圖譜,它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中,橫坐標(biāo)X軸為為熒光1強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù),縱坐標(biāo)Y軸則通常表示熒光2或光 散射強(qiáng)度的相對(duì)值。 儀器使用者可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來修改所有圖譜中顯 示之參數(shù)。第一圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H 1024 SSC-H 1024;

14、第二圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改動(dòng)作 為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC:細(xì)胞大小,SSC:細(xì) 胞折射率,FL1:FITC 綠色熒光，F(xiàn)L2:PE橙色熒光，F(xiàn)L3:PerCP紅色熒 光）。8. 從屏幕上方 Plots 菜單中選擇 Dot Plot 功能 , 可復(fù)制一個(gè)同 樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X軸:FL1-H 1024,Y軸:FL2-H 1024。點(diǎn)擊OK,FL1/FL2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖 移至原圖右方。9. 在工具板中選擇四象限工具 , 在 FL1/FL2 散點(diǎn)圖上拖動(dòng) Quadrant 的中心將它設(shè)定在 (

15、x,y)=(101,101) 處, 這些象限將指定陰 性/ 陽性區(qū)域。建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊10. 從 Acquire 菜單中選擇 Connect to Cytometer, 此時(shí)會(huì)出現(xiàn) Acquisition Control 對(duì) 話 方 框 。 如 果 無 法 選 擇 Connect to Cytometer, 參考秘技 #1 。如果沒見到 Acquisition Control 對(duì)話, 可到屏幕上方Windows菜單中選擇Show Acquisition Control 。儀器設(shè)置文件注意 : 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量 , 取決于最適化儀器設(shè)定文件。 儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改 , 研究人員

16、必須在第一次就使用正確的儀器 設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件 (Instrument settings), 含信號(hào)器高壓（Detector/ Amps）, 閾值 （Threshold）, 熒光補(bǔ)償 （Compensation） 等儀 器條件的組合。一般而言 , 儀器設(shè)定的順序?yàn)?Detector/Amps -Threshold - Compensation 。11. 檢 查 現(xiàn) 有 儀 器 條 件 , 從 Cytometer 菜 單 中 選 擇 Detectors/Amps 。出現(xiàn) Detectors/Amps 窗口。在 Detectors/Amps 窗口確認(rèn)FSC與 SSC為LIN（線性放大）,其它

17、FL1-3為LOG對(duì)數(shù)放大）, 將其拖至空白區(qū)。12. 從 Cytometer 菜單中選擇 Threshold, 出現(xiàn) Threshold 窗口在Threshold窗口 ：確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。 將其拖至空白區(qū)。13. 從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation, 確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值 皆為零。將其拖至空白區(qū)。 3.3 上樣品、設(shè)置儀器14. 使儀器處于High RUN,支撐架左移，上陰性對(duì)照管樣品，支撐 架回位。確認(rèn) Acquisition Control 窗口中 Setup 前需打叉或打勾 即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù) , 點(diǎn)擊 Acquire 。調(diào)節(jié)FSC/SS（探測(cè)

18、器（電壓）15.觀察FSC/SSC圖的變化。FSC 電壓Voltage預(yù)設(shè)為E00,可調(diào)節(jié)Amp Gain從1.00?9.99使主要細(xì) 胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC電壓設(shè)置于E-1;較小細(xì)胞，將 FSC電壓設(shè)置于E01）。調(diào)節(jié)SSC電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào) 節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群 不與其它族群、 細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。 調(diào)整定位后 , 點(diǎn)擊 Acquisition Control 窗口中的 Pause。Gating 圈選 細(xì)胞檢品中 , 常含有大小不同、 性質(zhì)相異的細(xì) 胞群體。我們常用前方散射與側(cè)方散射的二維位圖 , 即散射光圖譜 （

19、Scatter Plot）, 來圈選出不同細(xì)胞群的范圍 , 選擇性顯示出有意義 的細(xì)胞群體,如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。 16. 在工具板中 選擇多邊形的Region,在FSC/SSC點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1區(qū)域（如 下圖 ） 。分析樣品時(shí) , 區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色 , 可移動(dòng)或改變形狀 來圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除 R1 區(qū)域,您可以在工具列中點(diǎn)選 Gates t Region list ,以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。17. 選取希望 Gate 的 FL1/FL2 散點(diǎn)圖 , 從 Plots 菜單中選擇 Format do

20、t plot 。在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)，將No Gate改選G1R1。點(diǎn) 擊 OK。調(diào)節(jié)FL1、FL2的探測(cè)器（電壓）18. 點(diǎn) 擊AcquisitionControl 窗口中的 Restart 。在 Detector/Amps 窗口中調(diào)節(jié) FL1、 FL2 的電壓, 使 Negative Control 細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之 100-101 處。19.在Threshold窗口，適當(dāng)?shù)靥岣逨SC閾值52,以去除碎片或 低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。 20. 點(diǎn) 擊Acquisition Control 窗口中的 Pause、Abort 。移去陰性對(duì)照管 , 關(guān) 閉 Detec

21、tor/Amps 、Threshold 窗口 , 我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自 體熒光。調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說明 : 最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（ 如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過此步驟 ） 如是 2 色樣本 , 必要時(shí)需調(diào)節(jié) FL2-%FL1,FL1-%FL2若 3 色樣本,必要時(shí)需調(diào)節(jié) FL2-%FL1 FL1-%FL2 FL3-%FL2 FL2-%FL3的補(bǔ)償）。21. High RUN,換上單染 CD3-FITC管。點(diǎn)擊 Acquisition Control 窗口中的 Acquire 。調(diào)節(jié) FL2-%FL1 使FITC陽性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點(diǎn) 擊來選擇或直接拖

22、動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢 , 點(diǎn)擊 Acquisition Control 窗口中的 Pause。22. 移去單染 CD3,換上單染 CD19-PE管。點(diǎn)擊 Acquisition Control 窗口中的 Restart。調(diào)節(jié) FL1-%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL1/FL2 散 點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢 , 點(diǎn)擊 Acquisition Control 窗口中的 Pause。23. 最后以 CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊 AcquisitionControl 窗口中的 Restart, 確定三群細(xì)胞工整垂直。 當(dāng)您已完成 2色 熒光之光譜重迭時(shí) , 點(diǎn)擊 Acquisi

23、tion Control 窗口中的 Pause、Abort 。24. 移去樣本管，換上dH2O管,讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。 關(guān)閉 Compensation 窗口。您已完成 2 色熒光之最適化。 3.4 收集實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)25. 預(yù)設(shè)之儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)為 10000。如需修改 , 從 Acquire菜單中選擇 Acquisition & Storage, 并在出現(xiàn)的 窗口功, 確認(rèn) Collection Criteria從 10000 of All, 再點(diǎn)擊 OK。 26. 找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。 從 Acquire 菜單中選擇 Parameter Descripti

24、on, 出現(xiàn) Parameter Description 對(duì)話方框。點(diǎn)擊 Folder, 并在隨后出現(xiàn) 之對(duì)話方框 , 選擇 Your Folder 或新建活頁夾 , 點(diǎn)擊此對(duì)話方框的 Select 'Your Folder '。 27. 命 名 即 將 儲(chǔ) 存 之 文 件 名 : 點(diǎn) 擊 Parameter Description 對(duì)話方框的 File, 出現(xiàn)文件名編輯窗口。在 Custom Prefix 中：輸入文件名20031231,點(diǎn)擊此對(duì)話方框的 OK日 期為最常用之文件名系統(tǒng)。 28. Optional: 如有需要 , 可選擇或在 P1-P5 后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)

25、名。如 P1：Size, P2：Granularity, P3QD3FITC。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。計(jì)數(shù)器Counters29. 從 Acquire 菜單中選擇 Counters. 窗口會(huì)顯示樣品分析速 率、與總數(shù)進(jìn)度。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)30. 你可以開始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)了。HIGH RUN將第一管樣品放到檢測(cè)區(qū) , 在 Acquisition Control 窗口中 , 將 Setup 改成 Setup,此時(shí) CellQuest 會(huì)自動(dòng)顯示 Your Folder:20031231.001 為資料文件 名。點(diǎn)擊“ Acquire ” 便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。當(dāng)計(jì)算 機(jī)成功

26、地收取足夠數(shù)據(jù) , 會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件 20031231.001, 并會(huì)以 “嘟”聲告知 ,CellQuest 會(huì)自動(dòng)升冪附加檔名成 20031231.002。等 待下一指示。31.你可以換上下一管樣品，點(diǎn)擊“Acquire ”啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存?？衫^續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。3.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之儲(chǔ)存與備份 :32. 不建議長期使用硬盤儲(chǔ)存數(shù)據(jù)數(shù)據(jù) , 可考慮以燒光盤 ( 如配 有CD-RW、口袋硬盤(Flash Drive)來備份大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以免占用 原有硬盤的內(nèi)存 , 影響數(shù)據(jù)處理速度。 可將備份后之?dāng)?shù)據(jù) , 拿到另一蘋 果計(jì)算機(jī)或個(gè)人PC進(jìn)行離機(jī)分析。33. 確認(rèn)所有檔案皆

27、己備份后 , 以鼠標(biāo)圈選欲刪除數(shù)據(jù) , 將其拖 拉至 Trash 筒。退出軟件34. 檢品分析完畢后 , 記得從屏幕上方 File 指令欄選擇 Save As, 儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文件 , 以備日后使用 , 不需每次重新編輯。35. 從屏幕上方 Cytometer 指令欄 , 選擇 Instrument Setting, 出現(xiàn) Instrument Setting 窗口。點(diǎn)系 print 打印此次實(shí)驗(yàn)條件 , 可貼 入實(shí)驗(yàn)筆記留底，再點(diǎn)擊Save以儲(chǔ)存此一實(shí)驗(yàn)的儀器條件，供日后再 使用。點(diǎn)系SAVE后會(huì)出現(xiàn)文件保存對(duì)話方框，選擇文件目錄及文件名(例:Your Folder:/Your Setting1)

28、,點(diǎn)擊 Save。點(diǎn)擊 Dona 36.檢品 分析 完畢后 , 用 鼠標(biāo)從屏幕上 方 Acquire 指令欄 中, 選 取 Disconnect to Cytometer 以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不 分析數(shù)據(jù) , 您可退出軟件“ File ”“Quit ”遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇“ Don t save”, 進(jìn)行關(guān)機(jī)程序。管路清洗37. 以 2 ml 10% 漂白水取代樣品 , 將樣品架置于左位以外管吸 除約1 ml,再將樣品架置于中位 HI RUN十分鐘。改用2 ml DI water。 重復(fù)上述程序，樣品架上留約1 ml DI water。按STANDB五分鐘。關(guān)主機(jī)、關(guān)計(jì)算機(jī)四、數(shù)據(jù)分

29、析FCS list mode 數(shù)據(jù)文件 :說明 :FCS list mode 數(shù)據(jù)文件是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式檔案 (FCS2.0) 。該文件含有從流式細(xì)胞儀收取的平均 10,000 個(gè)細(xì)胞數(shù)的 資料,含有46個(gè)參數(shù)。一般軟件無法打開list mode數(shù)據(jù)文件，需藉 助如 CellQuest, WinList, WinMDI, 等 Flow 分析軟件 , 才可開啟、 繪圖、并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。4.1 開啟一 CellQuest 實(shí)驗(yàn)文件1. 從屏幕上方File 菜單中選擇New桌面會(huì)出現(xiàn)一Un titled ' 實(shí)驗(yàn)文件 , 可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕 , 將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。4.2 散

30、點(diǎn)圖之統(tǒng)計(jì)分析 ( 雙色)2. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。 在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊 , 然后 拖動(dòng)對(duì)角線至適當(dāng)大小。 Plot 拖曳完成后可以在右方看到 Dot Plot對(duì)話框3. 在Dot Plot方框中,Plot Source應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis,可點(diǎn)擊Select File 鈕, 并用隨后之方框來開啟預(yù)存之 Sample Files, 它們 的路 徑 位于 Mac HD:BD Applications:CellQuest Folder:Sample Files 。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄 , 找到檔案后 , 點(diǎn)擊 Open 來開啟NORMOO檔案。X與Y 參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值 ？FSC

31、-H 256與SSC-H 256,在Color方框中點(diǎn)擊Multicolor Gating,確認(rèn)無誤之后，點(diǎn)擊OK 便完成了一個(gè)NORM001的FSC /SSC散點(diǎn)圖。4.工具板中選擇多角 形區(qū)隔工具，將Cursor移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周 邊畫出范圍,連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成 R1 區(qū)域的界定,我 們將以此區(qū)域來圈選淋巴細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域,您可以在工具列 中點(diǎn)選Gates t Region list,以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。5.從Plots菜單中選擇 Dot Plot 可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散

32、點(diǎn)圖 , 屏幕上會(huì)出現(xiàn)一Dot Plot 對(duì)話方框。點(diǎn)擊 X Parameter鈕來顯示NORM001檔案中 所有的參數(shù)項(xiàng) FSC, SSC, FL1, FL2 將 X 參數(shù)項(xiàng)改成 FL1-H 256 Gamma-1 ,Y 參數(shù)項(xiàng)改成FL2-H 256 Gamma-2。從Gate輸入欄中 將 NoGate 改成 G1 R1。6. 點(diǎn)擊 OK 便完成了一個(gè)以 G1 圈選的 FL1/ FL2 散點(diǎn)圖,可 將復(fù)制圖移至原圖右方。NORM00檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對(duì)照組，我 們將以之來界定陰性與陽性之界限。 7. 從屏幕左列工具板中 , 選取 Quadrant Marker 工具, 然后在 FL1/ F

33、L2 散點(diǎn)圖中心處點(diǎn)擊并拖曳 至定點(diǎn) , 一般而言是緊挨著陰性細(xì)胞聚落。 8. FL1/ FL2 二維散點(diǎn) 圖現(xiàn)在被區(qū)隔出四個(gè)象限 ,欲計(jì)算各象線中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù) , 從屏幕 上方 Stats 菜單中選擇 Quadrant Stats 。可以得到該圖之四象限統(tǒng) 計(jì)結(jié)果。UL:左上象限，UR:右上象限丄L:左下象限丄R:右下象限打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值 9. 從屏幕上方 File 菜單中選擇 Print One, 可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。 10. 點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表 , 從 屏幕上方 File 菜單中選擇 Export Statistics 可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至 Excel 檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案

34、, 并決定欲存放檔案匣 , 點(diǎn)擊 Save。 4.3 開啟其它 List Mode Data11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案 , 可用鼠標(biāo)以拖曳 方式選取所有圖表 文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊 , 表示被 選擇上 , 接著從 Plots 菜單選擇 Next Data File, 軟件會(huì)自動(dòng)以新檔 案來替換現(xiàn)有檔案 , 您只要確認(rèn)圈選范圍、與 Quadrant Marker 的位 置是否恰當(dāng) , 即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。 12. 對(duì)于存在不同 檔案匣之系列檔案 , 可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 文件中所有 圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊 , 表示被選擇上 , 接著從 Plot

35、s 菜單選擇 Change Data Files, 并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框 , 選擇所在新目錄與欲 分析檔案。點(diǎn)擊OPEN可調(diào)整圈選區(qū)域，Quadrant Marker陰陽界限， 軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。13.常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件 內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、 以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告 , 我們建議您將它另存新檔 File ? Save As, 以備后需 , 分析其它檔案便輕而易舉。4.3 直方圖之統(tǒng)計(jì)分析 （單色） 1. 從屏幕上方 File 菜單中選擇 New桌面會(huì)出現(xiàn)一Un titled '實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上 角的放大鈕 , 將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。 2. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖

36、圖 示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊 , 然后拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小。 Plot 拖 曳完成后可以在右方看到 Dot Plot 對(duì)話框。3.在Dot Plot方框中,Plot Source應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis,可點(diǎn)擊 Select File 鈕, 并用隨后之方框來開啟預(yù)存之 Sample Files, 它們 的 路 徑 位 于 Mac HD:BD Applications:CellQuest Folder:Sample Files 。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄 , 找到檔案后 , 點(diǎn)擊 Open 來開啟 NORMOO檔案。X與Y 參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值 ？FSC-H 256與SSC-H 256, 在 C

37、olor 方框中點(diǎn)擊 Multicolor Gating, 確認(rèn)無誤之后 , 點(diǎn)擊 OK 便完成了一個(gè)NORM001的FSC /SSC散點(diǎn)圖。4.工具板中選擇多 角形區(qū)隔工具，將Cursor移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上,并沿著淋巴球聚落 周邊畫出范圍 , 連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成 R1 區(qū)域的界定 , 我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細(xì)胞。 如果要?jiǎng)h除 R1 區(qū)域, 您可以在工具 列中點(diǎn)選Gates f Region list, 以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按Delete鍵刪 除 R1 區(qū)域。刪除 R1 區(qū)域后 , 可用繪圖工具板 , 重畫 R1。 5. 從 Plots 菜單中選擇 Histogram,

38、屏幕上會(huì)出現(xiàn)一 Histogram 對(duì)話方框。點(diǎn)擊 Select File 鈕,再點(diǎn)擊Open來開啟NORM001檔案。說明：直方圖 (Histogram) 表明一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系 , 在圖中 , 橫坐標(biāo) X 軸為熒光或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值 , 單位是道數(shù) (channel number), 縱 坐標(biāo)丫軸則通常表示細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，即相對(duì)細(xì)胞數(shù)。6. 點(diǎn)擊 Parameter鈕來顯示NORM001檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)，將參數(shù)項(xiàng)改成FL2-H 256 Gamma-2。從 Gate 輸入欄中將 No Gate 改成 G1 R1, 點(diǎn)擊OK便完成了一個(gè)以G1圈選的FL2直方圖，圖形的X軸為橙黃

39、色熒光強(qiáng)度，丫軸為細(xì)胞頻率，NORM001檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對(duì)照 組, 我們將以之來界定陰性與陽性之界限。7. 從屏幕左列工具板中 ,選取 Histogram Marker 工具, 然后在圖的左緣處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn) 一般而言是陰性信號(hào)的右緣。放開鼠標(biāo)后即完成 Marker 1M1 。重復(fù) 前述步驟以增畫另一 Marker, 一般而言 M2 始自 M1 的右緣 , 終于圖 的右界。 8. FL2 直方圖現(xiàn)在被區(qū)隔出兩個(gè)區(qū)域 , 欲計(jì)算各區(qū)域中細(xì) 胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù) , 可從 Stats 指令欄中選擇 Histogram Stats 。打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值 9. 從 屏 幕 上 方 File 菜 單

40、 中 選 擇 Print One, 可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。 10. 點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表 , 從 屏幕上方 File 菜單中選擇 Export Statistics 可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至 Excel 檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案 , 并決定欲存放檔案匣 , 點(diǎn)擊 Save。4.3 開啟其它 List Mode Data11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案 , 可用鼠標(biāo)以拖曳 方式選取所有圖表 文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊 , 表示被 選擇上 , 接著從 Plots 菜單選擇 Next Data File, 軟件會(huì)自動(dòng)以新檔 案來替換現(xiàn)有檔案 , 您只要確認(rèn)圈選范圍、與 Quadrant

41、Marker 的位 置是否恰當(dāng) , 即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。 12. 對(duì)于存在不同 檔案匣之系列檔案 , 可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 文件中所有 圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊 , 表示被選擇上 , 接著從 Plots 菜單選擇Change Data Files, 并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框 , 選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊OPEN可調(diào)整圈選區(qū)域Markers界限,軟件會(huì)重新計(jì) 算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。13.常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件 內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、 四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告 , 我們建議您將它另存新檔 File ? Save As, 以備后需 , 分析其它檔案便輕而易舉。五、錯(cuò)誤信號(hào)、疑難排除5.

42、1儀器狀態(tài)(Status):在CELLQuest菜單位于Cytometer菜單中。用來在收取的任何時(shí)候查看流式細(xì)胞儀的運(yùn)行狀態(tài) , 以利解決儀 器運(yùn)行中出現(xiàn)的問題。狀態(tài) : 顯示儀器運(yùn)行模式Not Ready: 激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿。Ready: 樣本管放置在進(jìn)樣區(qū) , 且支撐臂位于中位 , 樣本管加壓 , 儀 器在RUN犬態(tài)。Standby: 儀器在 Standby 狀態(tài)、或儀器在 Run 狀態(tài)而無樣本管 在進(jìn)樣區(qū)上、或支撐架位于側(cè)位、或樣本管未完全加壓。 Standby 時(shí) 儀器的雷射電源降低。5.2 常見故障排除程序 5.2.1 樣品試管上不去 誤用不適合的試管。 (請(qǐng)用

43、BD Falcon 352052) 試管支持架需調(diào)整。旋轉(zhuǎn)調(diào)整試管支持架 ( 順時(shí)鐘向下、逆時(shí)鐘 向上)。Bal Seal 磨損。 (汰換 Bal seal) 5.2.2 儀器處于 N0T READY狀況檢查以下情況 :鞘液筒中的鞘液是否用完。 廢液筒中的廢液是否已裝滿。 開機(jī)需要 5 分鐘時(shí)間預(yù)熱。鞘液筒的液面檢測(cè)器連接是否松動(dòng)、或未連接。 5.2.3 儀 器 處于STANDB狀況（儀器失壓）如果儀器未加壓，上樣管放好后，雖然控制面板處于RUN模式，但 儀器仍未能達(dá)到READY狀況，此時(shí)儀器仍處于STANDB狀況。這可能 是由于鞘液筒蓋漏氣、壓力閥未加壓 , 樣本管不能被加壓等原因造成 的壓

44、力問題。此時(shí) , 樣本不能良好地進(jìn)入流動(dòng)室 , 無法檢測(cè)。此時(shí) , 檢查以下情況 :壓力閥未加壓。鞘液筒是否漏氣 （ 蓋緊鞘液筒蓋 ） 。樣本管是否有破損。上樣針上的 Bal seal 是否己磨損。 鞘液筒上的藍(lán)色接頭是否連接好。 5.2.4 儀器訊號(hào)噪聲過高 鞘液過濾器中有氣泡 , 儀器記錄了氣泡產(chǎn)生的信號(hào) , 造成了噪聲 數(shù)據(jù)的干擾。氣泡還可以改變樣本流 , 造成檢測(cè)結(jié)果不理想 ; 此時(shí) , 儀 器需要做PRIME排除液路中的氣泡干擾。如果鞘液筒吸干了 ，應(yīng)該重 新裝滿鞘液，然后先取下樣品管進(jìn)行5-10次PRIME再換上3ml dH20 上樣管 HI RUN 30 分鐘, 待鞘液流中的氣泡

45、排除之后 , 再進(jìn)行樣本測(cè) 定。 5.2.5 計(jì)算機(jī)屏幕上見不到細(xì)胞顯示檢查以下情況 :如果儀器一直處于 STANDB狀態(tài),則檢查System Status。如果STATUS窗日顯示READY則檢查樣本管中細(xì)胞濃度是否夠， 上樣前是否混勻了。檢查實(shí)驗(yàn)的 Instrument Settings 是否正確。檢查閾值是否設(shè)置過高 , 導(dǎo)致無法檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞群。檢查CELLQues軟件Cytometer目錄下的Status窗口，是否己被 更新。如果未更新 , 說明儀器與計(jì)算機(jī)之間的通訊發(fā)生了故障 , 此時(shí), 應(yīng)關(guān)閉計(jì)算機(jī)和 FACSCalibur, 重新打開儀器 , 繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。PRIME儀器液流,去除流

46、動(dòng)室中可能存在的氣泡。若流動(dòng)室中存 在氣泡 , 可能使樣本流的位置偏離激光束 , 導(dǎo)致無細(xì)胞信號(hào)。 5.2.6 加樣針有鞘液反流檢查以下情況 :檢查上樣針外管是否安好 , 可以將外管旋下 , 向上推動(dòng) , 重新擰 緊。更換上樣針上部的0型膠環(huán)。檢查液流保存系統(tǒng)的真空幫浦是否工作。 如果樣本管支撐架位于 旁位時(shí) , 聽不到真空幫浦的工作聲音 , 可能是真空幫浦停了 , 關(guān)閉 FACSCalibur, 再啟動(dòng) ; 移開支撐架時(shí) , 如果馬達(dá)仍然不動(dòng) , 請(qǐng)致電 BD 客戶服務(wù)部門尋求幫助。實(shí)驗(yàn)文件 1:2 Color ACQ實(shí)驗(yàn)文件 2:2 Color ANA表一、常用熒光染劑測(cè)量參數(shù) 熒光染劑 吸光波長 nm 熒光波長 nm 標(biāo)示抗體用染劑 Fluorescein, FITC 490 520 Phycoerythrin-R,