紫外可見(jiàn)光譜分析技術(shù)_第1頁(yè)
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1、紫外可見(jiàn)光譜分析技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用醫(yī)學(xué)院 宋宗輝 2016201632 紫外-可見(jiàn)吸收光譜法概述分子的紫外-可見(jiàn)吸收光譜法是基于分子內(nèi)電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜進(jìn)行分析的一種常用的光譜分析法。分子在紫外-可見(jiàn)區(qū)的吸收與其電子結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。紫外光譜的研究對(duì)象大多是具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的分子。紫外-可見(jiàn)以及近紅外光譜區(qū)域的詳細(xì)劃分如下圖所示。紫外-可見(jiàn)光區(qū)一般用波長(zhǎng)(nm)表示。其研究對(duì)象大多在200-380 nm的近紫外光區(qū)和/或380-780 nm的可見(jiàn)光區(qū)有吸收。紫外-可見(jiàn)吸收測(cè)定的靈敏度取決于產(chǎn)生光吸收分子的摩爾吸光系數(shù)。該法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單,應(yīng)用十分廣泛。如醫(yī)院的常規(guī)化驗(yàn)中,95%的定量分析都用紫外

2、-可見(jiàn)分光光度法。在化學(xué)研究中,如平衡常數(shù)的測(cè)定、求算主-客體結(jié)合常數(shù)等都離不開(kāi)紫外-可見(jiàn)吸收光譜。紫外可見(jiàn)區(qū)域1.1分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜1.1電子能級(jí)和躍遷從化學(xué)鍵性質(zhì)考慮,與有機(jī)物分子紫外-可見(jiàn)吸收光譜有關(guān)的電子是:形成單鍵的電子,形成雙鍵的電子以及未共享的或稱(chēng)為非鍵的n電子。有機(jī)物分子內(nèi)各種電子的能級(jí)高低次序下圖所示,*>*>n>>。標(biāo)有*者為反鍵電子。電子能級(jí)及電子躍遷示意圖可見(jiàn),*躍遷所需能量最大,max<170 nm,位于遠(yuǎn)紫外區(qū)或真空紫外區(qū)。一般紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)不能用來(lái)研究遠(yuǎn)紫外吸收光譜。如甲烷,max =125 nm。飽和有機(jī)化合物的電子躍遷在遠(yuǎn)

3、紫外區(qū)。1.2生色團(tuán)*所需能量較少,并且隨雙鍵共軛程度增加,所需能量降低。若兩個(gè)以上的雙鍵被單鍵隔開(kāi),則所呈現(xiàn)的吸收是所有雙鍵吸收的疊加;若雙鍵共軛,則吸收大大增強(qiáng),波長(zhǎng)紅移,max和max均增加。如單個(gè)雙鍵,一般max為150-200nm,乙烯的max = 185nm;而共軛雙鍵如丁二烯max = 217nm,己三烯max = 258nm。 n*所需能量最低,在近紫外區(qū),有時(shí)在可見(jiàn)區(qū)。但*躍遷幾率大,是強(qiáng)吸收帶;而n*躍遷幾率小,是弱吸收帶,一般max<500。許多化合物既有電子又有n電子,在外來(lái)輻射作用下,既有*又有n*躍遷。如-COOR基團(tuán),*躍遷max=165 nm,max=40

4、00;而n*躍遷max=205nm,max=50。*和n*躍遷都要求有機(jī)化合物分子中含有不飽和基團(tuán),以提供軌道。含有鍵的不飽和基團(tuán)引入飽和化合物中,使飽和化合物的最大吸收波長(zhǎng)移入紫外-可見(jiàn)區(qū)。這類(lèi)能產(chǎn)生紫外-可見(jiàn)吸收的官能團(tuán),如一個(gè)或幾個(gè)不飽和鍵,C=C,C=O,N=N,N=O等稱(chēng)為生色團(tuán)(chromophore)。某些生色團(tuán)的吸收特性見(jiàn)下表。某些生色團(tuán)及相應(yīng)化合物的吸收特性有些基團(tuán)本身在200 nm以上不產(chǎn)生吸收,但這些基團(tuán)的存在能增強(qiáng)生色團(tuán)的生色能力(改變分子的吸收位置和增加吸收強(qiáng)度),這類(lèi)基團(tuán)稱(chēng)為助色團(tuán)(auxochrome)。一般助色團(tuán)為具有孤對(duì)電子的基團(tuán),如-OH, -NH2, -S

5、H等。 含有生色團(tuán)或生色團(tuán)與助色團(tuán)的分子在紫外光區(qū)有吸收并伴隨分子本身電子能級(jí)的躍遷,不同官能團(tuán)吸收不同波長(zhǎng)的光。作波長(zhǎng)掃描,記錄吸光度對(duì)波長(zhǎng)的變化曲線(xiàn),就得到該物質(zhì)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。 1.2 其他生色的物質(zhì):某些無(wú)機(jī)金屬離子也會(huì)產(chǎn)生紫外-可見(jiàn)吸收。如含d電子的過(guò)渡金屬離子會(huì)產(chǎn)生配位體場(chǎng)吸收帶。依據(jù)配位場(chǎng)理論,無(wú)配位場(chǎng)存在時(shí),能量簡(jiǎn)并;當(dāng)過(guò)渡金屬離子處于配位體形成的負(fù)電場(chǎng)中時(shí),5個(gè)簡(jiǎn)并的d軌道會(huì)分裂成能量不同的軌道。不同配位體場(chǎng),如八面體場(chǎng)、四面體場(chǎng)、正方平面配位場(chǎng)等使能級(jí)分裂不等。金屬離子一定時(shí),分裂能級(jí)差DE=10Dq的值依下列順序增大: ;配位體一定時(shí),DE=10Dq的值的增大順序?yàn)?/p>

6、M2+<M3+<M4+,3d<4d<5d。在外來(lái)輻射激發(fā)下,d電子從能量低的軌道躍遷到能量高的軌道時(shí)產(chǎn)生配位體場(chǎng)吸收帶。一般配位體場(chǎng)吸收帶在可見(jiàn)區(qū),emax約0.1-100 l/molcm,吸收很弱。因此配位體場(chǎng)吸收帶對(duì)定量分析用處不大。 鑭系及錒系離子5f電子躍遷產(chǎn)生的f電子躍遷吸收譜帶出現(xiàn)在紫外-可見(jiàn)區(qū)。由于f軌道為外層軌道所屏蔽,受溶劑性質(zhì)或配位體的影響很小,故譜帶窄。 少數(shù)無(wú)機(jī)陰離子,如NO3-(lmax=313 nm)、CO32-(lmax =217 nm)、NO2-(lmax =360 、280 nm)、N3-(lmax =230 nm)、CS32-(lma

7、x =500 nm)等也有紫外-可見(jiàn)吸收。2 影響紫外-可見(jiàn)吸收光譜的因素2.1各種因素對(duì)吸收譜帶的影響:表現(xiàn)為譜帶位移、譜帶強(qiáng)度的變化、譜帶精細(xì)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)或消失等。 譜帶位移包括藍(lán)移(或紫移,hypsochromic shift or blue shift)和紅移(bathochromic shift or red shift)。藍(lán)移(或紫移)指吸收峰向短波長(zhǎng)移動(dòng),紅移指吸收峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)。吸收峰強(qiáng)度變化包括增色效應(yīng)(hyperchromic effect)和減色效應(yīng)(hypochromic effect)。前者指吸收強(qiáng)度增加,后者指吸收強(qiáng)度減小。各種因素對(duì)吸收譜帶的影響結(jié)果如下圖所示。藍(lán)移

8、、紅移、增色、減色示意圖2.2取代基的影響在光的作用下,有機(jī)化合物都有發(fā)生極化的趨向,既能轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)。當(dāng)共軛雙鍵的兩端有容易使電子流動(dòng)的基團(tuán)(給電子基或吸電子基)時(shí),極化現(xiàn)象顯著增加。給電子基為帶有未共用電子對(duì)的原子的基團(tuán)。如-NH2, -OH等。未共用電子對(duì)的流動(dòng)性很大,能夠和共軛體系中的p電子相互作用引起永久性的電荷轉(zhuǎn)移,形成p-p共軛,降低了能量,lmax紅移。吸電子基是指易吸引電子而使電子容易流動(dòng)的基團(tuán)。如: 等。共軛體系中引入吸電子基團(tuán),也產(chǎn)生p電子的永久性轉(zhuǎn)移,lmax紅移。p電子流動(dòng)性增加,吸收光子的吸收分?jǐn)?shù)增加,吸收強(qiáng)度增加。給電子基與吸電子基同時(shí)存在時(shí),產(chǎn)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移吸

9、收,lmax紅移,emax增加。給電子基的給電子能力順序?yàn)椋?N(C2H5)2>-N(CH3)2>-NH2>-OH>-OCH3>-NHCOCH3>-OCOCH3>-CH2CH2COOH>-H吸電子基的作用強(qiáng)度順序是:-N+(CH3)3>-NO2>-SO3H>-COH>-COO->-COOH>-COOCH3>-Cl>-Br>-I2.3 溶劑的影響一般溶劑極性增大,pp*躍遷吸收帶紅移,np*躍遷吸收帶藍(lán)移。分子吸光后,成鍵軌道上的電子會(huì)躍遷至反鍵軌道形成激發(fā)態(tài)。一般情況下分子的激發(fā)態(tài)極性大于基態(tài)

10、。溶劑極性越大,分子與溶劑的靜電作用越強(qiáng),使激發(fā)態(tài)穩(wěn)定,能量降低。即p*軌道能量降低大于p軌道能量降低,因此波長(zhǎng)紅移。而產(chǎn)生np*躍遷的n電子由于與極性溶劑形成氫鍵,基態(tài)n軌道能量降低大,np*躍遷能量增大,吸收帶藍(lán)移。2.4 質(zhì)子性溶劑的影響質(zhì)子性溶劑容易與吸光分子形成氫鍵。當(dāng)生色團(tuán)為質(zhì)子受體時(shí)吸收峰藍(lán)移,生色團(tuán)為質(zhì)子給體時(shí)吸收峰紅移。如下所示的化合物存在兩種平衡態(tài),為質(zhì)子受體,其在甲醇中的吸收波長(zhǎng)最短,溶液呈黃色。3 吸收定律摩爾吸收系數(shù)表示吸光物質(zhì)對(duì)指定頻率光子的吸收本領(lǐng),因此由可以估計(jì)分光光度法所能達(dá)到的理論靈敏度。只有當(dāng)光子在近似分子大小范圍內(nèi)與吸光分子碰撞時(shí),才能產(chǎn)生吸收。分子截面

11、積越大,碰撞的幾率越大。光束強(qiáng)度越大,總光子數(shù)越多,吸收躍遷幾率越大,產(chǎn)生的吸收越大。因此, 式中,為阿伏伽德羅常數(shù);為吸收躍遷幾率,如果每次碰撞對(duì)光吸收都有效, ;是吸光分子的截面積,約為;是光束強(qiáng)度;代表分子隨機(jī)取向的統(tǒng)計(jì)因子;表示吸收層厚度。3.1 吸收定律的適用性吸收定律俗稱(chēng)比爾定律,其成立條件是待測(cè)物為均一的稀溶液、氣體等,無(wú)溶質(zhì)、溶劑及懸濁物引起的散射;入射光為單色平行光。 a比爾定律在有化學(xué)因素影響時(shí)不成立。b解離、締合、生成絡(luò)合物或溶劑化等會(huì)對(duì)比爾定律產(chǎn)生偏離。c比爾定律在有儀器因素影響時(shí)也不成立。d非單色光對(duì)比爾定律產(chǎn)生偏離。e雜散光(非吸收光)也會(huì)對(duì)比爾定律產(chǎn)生影響。f其他

12、影響因素包括溶劑、光效應(yīng)等也應(yīng)考慮。 4 紫外可見(jiàn)光譜技術(shù)的發(fā)展4.1紫外吸收檢測(cè)器的發(fā)展紫外吸收檢測(cè)器又分二維檢測(cè)器和三維檢測(cè)器。三維檢測(cè)器有掃描型和二極管陣列式。4.1.1紫外-可見(jiàn)光(UV-VIS)檢測(cè)器原理:基于Lambert-Beer定律,即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸收,且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。很多有機(jī)分子都具紫外或可見(jiàn)光吸收基團(tuán),有較強(qiáng)的紫外或可見(jiàn)光吸收能力,因此UV-VIS檢測(cè)器既有較高的靈敏度,也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感,所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS檢測(cè)器。用UV-VIS檢測(cè)時(shí),為了

13、得到高的靈敏度,常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng),但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長(zhǎng),另外,應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒(méi)有背景吸收的流動(dòng)相。4.1.2紫外檢測(cè)器是二維檢測(cè)器,選擇一個(gè)特定的波長(zhǎng)檢測(cè),一般用于已有文獻(xiàn)和已知樣品最大吸收波長(zhǎng)的定量檢測(cè);而二級(jí)管陣列可以在200-800nm選擇一個(gè)波長(zhǎng)范圍檢測(cè),可以用于不知道樣品最大吸收波長(zhǎng)的情況下,選擇一個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行定量,也可以通過(guò)觀察紫外光譜,可以做到一定程度上的定性。一般用于紫外分光光度計(jì)。紫外檢測(cè)器是在同一時(shí)間測(cè)量一個(gè)波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù),而二極管陣列是在同一時(shí)間分別測(cè)量N個(gè)波長(zhǎng)下的數(shù)據(jù)。由于要同時(shí)測(cè)量N點(diǎn)數(shù)據(jù),所以

14、要用損失精度來(lái)?yè)Q取,也就是說(shuō),紫外檢測(cè)器的檢測(cè)精度要遠(yuǎn)高于二極管陣列,但二極管陣列可以在同一時(shí)間給出不同波長(zhǎng)的譜圖,也就是三維譜圖。4.1.3二極管陣列檢測(cè)器(diode-array detector, DAD):以光電二極管陣列(或CCD陣列,硅靶攝像管等)作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器.它可構(gòu)成多通道并行工作,同時(shí)檢測(cè)由光柵分光,再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào),然后,對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù),得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測(cè)器不同的是,普通UV-VIS檢測(cè)器是先用單色器分光,只讓特定波長(zhǎng)的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列UV-VIS檢測(cè)器是先讓所有波長(zhǎng)的

15、光都通過(guò)流動(dòng)池,然后通過(guò)一系列分光技術(shù),使所有波長(zhǎng)的光在接受器上被檢測(cè)。二極管陣列檢測(cè)器可以獲得全波長(zhǎng)的樣品信息,而且可以根據(jù)吸收光譜輔助定性。但相對(duì)來(lái)說(shuō),專(zhuān)門(mén)的紫外檢測(cè)器靈敏度能高一些。5 紫外可見(jiàn)光譜技術(shù)的應(yīng)用5.1 定性分析5.1.1判斷異構(gòu)體:紫外吸收光譜的重要應(yīng)用在于測(cè)定共軛分子。共軛體系越大,吸收強(qiáng)度越大,波長(zhǎng)紅移。 如:和前者有紫外吸收,后者的lmax<200nm。同樣,CH3COCH2CH2COCH3的最大吸收波長(zhǎng)要短于CH3CH2CO-COCH2CH3。下面兩個(gè)酮式和烯醇式異構(gòu)體中,烯醇式結(jié)構(gòu)的摩爾吸光系數(shù)要遠(yuǎn)大于酮式,也是由于烯醇式結(jié)構(gòu)中有雙鍵共軛之故。CH2COCH

16、2COOC2H5 CH3C(OH)=CHCOOC2H5酮式(lmax =275 nm, e =100) 烯醇式(lmax =245 nm, e =18,000)5.1.2判斷共軛狀態(tài):可以判斷共軛生色團(tuán)的所有原子是否共平面等。如二苯乙烯(ph-CH=CH-ph)順式比反式不易共平面,因此反式結(jié)構(gòu)的最大吸收波長(zhǎng)及摩爾吸光系數(shù)要大于順式。順式: lmax =280 nm, e =13,500; 反式: lmax =295 nm, e =27,0005.1.3已知化合物的驗(yàn)證:與標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì),紫外-可見(jiàn)吸收光譜可以作為有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)測(cè)定的一種輔助手段。5.2定量分析紫外-可見(jiàn)吸收光譜是進(jìn)行定量分析最

17、廣泛使用的、最有效的手段之一。尤其在醫(yī)院的常規(guī)化驗(yàn)中,95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的優(yōu)點(diǎn)是:a可用于無(wú)機(jī)及有機(jī)體系。b一般可檢測(cè)10-4-10-5 mol/l的微量組分,通過(guò)某些特殊方法(如膠束增溶)可檢測(cè) 10-6-10-7 mol/l的組分。c準(zhǔn)確度高,一般相對(duì)誤差1-3%,有時(shí)可降至百分之零點(diǎn)幾。5.2.1分析條件的選擇5.2.1.1溶劑的選擇所選擇的溶劑應(yīng)易于溶解樣品并不與樣品作用,且在測(cè)定波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)吸收小,不易揮發(fā)。下表為某些常見(jiàn)溶劑可用于測(cè)定的最短波長(zhǎng)。常見(jiàn)溶劑可用于測(cè)定的最短波長(zhǎng)可用于測(cè)定的最短波長(zhǎng)(nm)常見(jiàn)溶劑200蒸餾水,乙腈,環(huán)己烷220甲醇,乙醇,異丙醇,醚

18、250二氧六環(huán),氯仿,醋酸270N,N-二甲基甲酰胺(DMF),乙酸乙酯,四氯化碳 (275)290苯,甲苯,二甲苯335丙酮,甲乙酮,吡啶,二硫化碳(380) 5.2.1.2測(cè)定濃度的選擇溶液吸光度值在0.2-0.8范圍內(nèi)誤差小(A=0.434時(shí)誤差最小),因此可根據(jù)樣品的摩爾吸光系數(shù)確定最佳濃度。 5.2.1.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 一般選擇最大吸收波長(zhǎng)以獲得高的靈敏度及測(cè)定精度。但所選擇的測(cè)定波長(zhǎng)下其他組分不應(yīng)有吸收,否則需選擇其他吸收峰。5.2.2定量分析方法 5.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,由低濃度至高濃度依次測(cè)定其吸收光譜,作一定波長(zhǎng)下濃度與吸光度的關(guān)系曲線(xiàn),在一定范圍內(nèi)

19、應(yīng)得到通過(guò)原點(diǎn)的直線(xiàn),即標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可求得未知樣品的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法示意圖 5.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)加入法樣品組成比較復(fù)雜,難于制備組成匹配的標(biāo)樣時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)加入法。將待測(cè)試樣分成若干等份,分別加入不同已知量0, C1, C2, Cn的待測(cè)組分配制溶液。由加入待測(cè)試樣濃度由低至高依次測(cè)定上述溶液的吸收光譜,作一定波長(zhǎng)下濃度與吸光度的關(guān)系曲線(xiàn),得到一條直線(xiàn)。若直線(xiàn)通過(guò)原點(diǎn),則樣品中不含待測(cè)組分;若不通過(guò)原點(diǎn),將直線(xiàn)在縱軸上的截距延長(zhǎng)與橫軸相交,交點(diǎn)離開(kāi)原點(diǎn)的距離為樣品中待測(cè)組分的濃度。標(biāo)準(zhǔn)加入法示意圖5.3 常見(jiàn)紫外可見(jiàn)光譜法的儀器5.3.1紫外分光光度計(jì)是利用物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收現(xiàn)象,進(jìn)行物質(zhì)的

20、定性和定量分析的光電式分析儀器,也是一種光譜儀器。根據(jù)電磁輻射原理,不同的物質(zhì)具有不同的選擇吸收,也即具有不同的吸收光譜。通過(guò)對(duì)吸收光譜的分析可方便的判斷物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成。隨著工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,以及人們對(duì)物質(zhì)認(rèn)識(shí)的不斷深化,迫切要求發(fā)展新的先進(jìn)的分析技術(shù)和儀器,分光光度計(jì)就是在這種歷史條件下問(wèn)世和發(fā)展的。 分光光度計(jì)是分光儀器和光度計(jì)的一種組合。按工作光譜原理的不同,分光光度計(jì)可分為研究物質(zhì)分子吸收光譜的分光光度計(jì)、研究物質(zhì)中原子吸收的原子吸收分光光度計(jì)、研究物質(zhì)分子熒光發(fā)射的熒光分光光度計(jì)和研究物質(zhì)原子熒光發(fā)射的原子熒光分光光度汁、研究分子喇曼散射光譜的喇曼光譜儀等。由于

21、分光光度法具有分析精度高、測(cè)量范圍廣、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn),分光光度計(jì)已成為探索自然、改造自然、發(fā)展科學(xué)技術(shù)和生產(chǎn)的強(qiáng)有力的工具,是現(xiàn)代化分析實(shí)驗(yàn)室必備的常規(guī)儀器之一。5.3.2分光光度計(jì)的基本組成a、光源光源指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜,并有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性,在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的變化。實(shí)際上許多光源的強(qiáng)度都隨波長(zhǎng)變化而變化。為了解決這一問(wèn)題,在分光光度計(jì)內(nèi)裝有光強(qiáng)度補(bǔ)償裝置,使不同波長(zhǎng)下的光強(qiáng)度達(dá)到一致醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。可見(jiàn)光分光光度計(jì)常用光源是鎢燈,能發(fā)射出350nm2500nm波長(zhǎng)范圍的連續(xù)光譜,適用范圍是360nm1000nm.現(xiàn)在常用光源是鹵鎢燈,其特點(diǎn)是發(fā)光效率大大提高,燈的使用壽命也大大延長(zhǎng)。紫外光光度計(jì)常用氫燈作為

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