“生物檢驗(yàn)檢疫”課程實(shí)驗(yàn)教案授課人：陳勇實(shí)驗(yàn)一：病料的采

1、1 / 11生物檢驗(yàn)檢疫”課程實(shí)驗(yàn)教案授課人：陳勇實(shí)驗(yàn)一：病料的采集及病原菌的分離和培養(yǎng)方法（ 一 ） 病料采集學(xué)習(xí)目的：了解常見(jiàn)病料的采集部位，掌握病料采集注意事項(xiàng)，學(xué)會(huì)進(jìn)行常見(jiàn)病料采集。 一：血液的采集根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目及需要血液料的多少，可以選用靜脈采血或心臟采血。（一）靜脈采血 魚(yú)是尾靜脈；馬，牛，羊犬，貓一般多在頸靜脈；成年豬在耳靜脈；6個(gè)月以內(nèi)的豬在前腔靜脈；禽 在翅靜脈采血。前腔靜脈的采血術(shù)是：豬仰臥，拉直兩前肢使兩前肢向后與體中線平行。手持針管，針頭斜向后內(nèi)方二） 末梢或小靜脈采血豬羊兔等可穿刺耳邊緣小靜脈。（三） 心臟采血 禽或試驗(yàn)小動(dòng)物需要血量較多時(shí)可采用本法。 禽的采血：右側(cè)臥

2、保定，左側(cè)胸部向上，取一個(gè)10毫升注射器，接上長(zhǎng)約5厘米的針頭，從胸骨脊前端至背部下凹處連接線的中點(diǎn)，垂直或稍向前內(nèi)方刺入23厘米即可。兔或豚鼠等的采血：在胸部左側(cè)觸及心臟跳動(dòng)處垂直刺入，邊刺邊抽注射器內(nèi)塞，將血 取出。 二：其他病料采集（一） 乳汁的采集 乳頭及術(shù)者的手用新潔爾滅消毒，將最初擠出的乳汁棄去，采1020毫升左右乳汁與滅菌容器中。（二）膿汁，鼻液，水皰液，水腫液的采集 用滅菌棉拭子蘸取膿汁于滅菌試管中。未破的膿腫，水皰液，水腫液等無(wú)菌注射器吸取， 注入無(wú)菌容器中。尸體剖檢后胸水，心包液，關(guān)節(jié)囊液等可用滅菌吸管吸取，置于滅菌容器中（三）糞便的采集 以清潔玻棒挑取新鮮糞便少許（約1克

3、）或用棉拭子自直腸內(nèi)掏取，置于小瓶?jī)?nèi)。（四）腸管的采集 用線扎緊一段腸管（約6厘米）兩端，結(jié)外剪下置于滅菌容器中。（五）膽汁的采集 整個(gè)膽囊置于塑料袋中或以無(wú)菌注射器吸取膽汁于滅菌容器中。（六）腦和脊髓的采集 采取腦，脊髓于適當(dāng)保存液中，或?qū)⒄麄€(gè)頭割下，包于鋟過(guò)0.1%升汞的紗布中，于木箱中送檢。（七）實(shí)質(zhì)臟器的采集選擇典型病變連同一部分正常組織，切下一，二塊，每塊不小于 八）魚(yú)體表、鰓表面的采集(二)病原菌的分離和培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1)掌握無(wú)菌操作的概念和基本操作技術(shù)。(2)了解細(xì)菌常用培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件(3)了解平板劃線分離菌種的原理和操作要點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)原理：微生物的接種技術(shù)是微生物學(xué)研究

4、中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。在微生物學(xué)的科學(xué)試驗(yàn)及發(fā)酵生產(chǎn)中， 都要把一種微生物移接到另一滅過(guò)菌的新鮮培養(yǎng)基中，使其生長(zhǎng)繁殖并獲得代謝產(chǎn)物。根據(jù)不同的接種方 法，如斜面接種、液體接種、平板接種、穿刺接種等。接種方法不同，常有不同的接種工具，如接種針、 接種環(huán)、接種鉤、滴管、移液管、涂布器等。接種的菌種都是與地面呈60度角，向右側(cè)或左側(cè)胸前窩刺入，進(jìn)針23厘米即可抽出血液。術(shù)后局部常規(guī)消毒。馬?？稍诙獠坎裳壕植考裘?，酒精消毒，用18號(hào)針頭刺入1厘米左右，血液即可流出。4厘米*2厘米*2厘米。2 / 11純培養(yǎng)的微生物，為了解保純種不被雜種菌 污染，在接種過(guò)程中必須進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。三、實(shí)驗(yàn)材

5、料：燒杯、玻璃棒、天平、電爐、培養(yǎng)基、蒸餾水、接種環(huán)、培養(yǎng)皿(12個(gè))、 試管(20支)、高壓滅菌鍋、無(wú)菌操作臺(tái)、酒精燈、溫箱四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、 配制培養(yǎng)基：用天平稱(chēng)取瓊脂培養(yǎng)基粉末45克，加入100毫升的蒸餾水，用電爐加熱直至培養(yǎng)基 徹底溶解。2、分裝試管：將溶解的培養(yǎng)基分裝入試管，且分裝入的培養(yǎng)基應(yīng)不超過(guò)試管高度的三分之一，塞上 木塞。3、 滅菌：將裝入培養(yǎng)基的試管、培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿用報(bào)紙包扎好，一起放入高壓滅菌鍋，126度滅菌15分鐘，等冷卻后將試管斜放，制成斜面(斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管長(zhǎng)的一半)。4、制平板培養(yǎng)基：將火完菌的培養(yǎng)皿與培養(yǎng)基移至無(wú)菌操作臺(tái)，在無(wú)菌條件下制成平板培養(yǎng)基，待 用。5

6、、取菌種：(1)每個(gè)試管中放入1毫升的生理鹽水。分成三組。(2)用接種環(huán)取魚(yú)鰓、身體與尾部的細(xì)菌，分別放于1號(hào)試管中。(3)1號(hào)試管取一半帶菌液體放入2號(hào)試管中，振蕩，再取一半帶菌液體加入3號(hào)試管，振蕩，取一半液體加入4號(hào)試管，振蕩。6、 分離細(xì)菌：(1)在無(wú)菌條件下操作，點(diǎn)燃酒精燈后，左手持皿，底朝下蓋朝上，以無(wú)名指和小指托底，用拇指、食指和中指將皿蓋揭開(kāi)成20左右的角度(角度愈小愈好，以免空氣中細(xì)菌進(jìn)入皿中將培養(yǎng)基污染)。(2) 右手持接種環(huán)于酒精燈上灼燒滅菌，待冷，取帶菌液體于平板培養(yǎng)基上劃線分離 培養(yǎng)。(3) 劃線完畢，燒灼接種環(huán)，將培養(yǎng)皿蓋好，用標(biāo)簽做好標(biāo)記，倒置，待培養(yǎng)。7、 培養(yǎng)

7、細(xì)菌：將培養(yǎng)皿放入37 C溫箱中培養(yǎng)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：培養(yǎng)出多個(gè)單菌落。3 / 11實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定方法（ 一 ） 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)和菌落培養(yǎng)特征。二、實(shí)驗(yàn)原理：（一）菌體形態(tài)觀察 細(xì)菌個(gè)體微小，觀察個(gè)體大小、外形、排列、特殊結(jié)構(gòu)時(shí)，一般借助普通光學(xué)顯微鏡。 細(xì)菌的基本形態(tài)可分為三類(lèi)：球菌、桿菌和螺旋菌。1、球菌 菌體呈球形。 按其分裂的方向和分裂后排列情況不同， 可分為雙球菌、 鏈球菌、 葡萄球菌等。 雙球菌在一個(gè)平面上分裂，分裂后菌體成對(duì)排列，如腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌；鏈球菌連續(xù)不斷地 在一個(gè)平面上分裂，呈鏈狀排列，如化膿鏈球菌；葡萄球菌是在多個(gè)不

8、同角度平面上做不規(guī)則分裂，分裂 后菌體堆積成葡萄串狀，如金黃色葡萄球菌。2、桿菌 菌體呈桿狀或近似桿狀。各種桿菌長(zhǎng)短粗細(xì)差別很大，短的幾乎呈球形，長(zhǎng)的可呈絲狀，桿 菌的兩端形狀在鑒定細(xì)菌時(shí)具有一定的意義。 大多數(shù)桿菌兩端鈍圓， 如大腸桿菌； 有的平切， 如炭疽桿菌； 有的尖細(xì)，如梭狀桿菌；有的末端膨大似棒狀，如百喉?xiàng)U菌；有的呈球桿形，如多殺性巴氏桿菌。桿菌大 多數(shù)呈散在排列，也有的呈鏈狀排列，如炭疽桿菌，有些形成側(cè)枝稱(chēng)分枝桿菌，如結(jié)核分枝桿菌。3、螺旋菌 菌體彎曲。根據(jù)其彎曲的程度和螺旋數(shù)，又可分為孤菌、螺菌和彎桿菌。 孤菌的菌體只有一個(gè)彎曲呈孤?tīng)睿?如霍亂孤菌； 螺菌的菌體有兩個(gè)以上彎曲呈螺

9、旋形， 如鼠咬癥螺菌； 彎桿菌呈孤形、螺旋形或S形，如結(jié)腸空腸彎桿菌。某些細(xì)菌除具有基本結(jié)構(gòu)外，還具有某些特殊結(jié)構(gòu)，如莢膜、鞭毛、芽孢等，通過(guò)特殊染色法加以觀 察，對(duì)鑒別細(xì)菌的種類(lèi)具有一定意義。（二）菌落性狀觀察 各種細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，常表現(xiàn)出一定的特征，如在特殊培養(yǎng)基內(nèi)所表現(xiàn)的發(fā)育情況，菌落的 形態(tài)和色素的產(chǎn)生等。這對(duì)于細(xì)菌菌屬的鑒別，具有重要的意義。細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，由單個(gè)菌細(xì)胞固定一點(diǎn)而大量繁殖，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間（一般為1824小 時(shí)）的孵育，在培養(yǎng)基表面出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)，這種集團(tuán)稱(chēng)為菌落。每一種細(xì)菌有它一定的菌落形 態(tài)，其大小、隆起或扁平、表面的性質(zhì)、光澤、色素的產(chǎn)生、邊

10、緣的形狀等各有特點(diǎn)，所以，菌落的形態(tài) 在識(shí)別細(xì)菌上有一定的意義。例如葡萄球菌在瓊脂平皿上，由于產(chǎn)生色素的不同，形成各種顏色之圓形而 突起的菌落； 炭疽桿菌形成扁平、 干燥、 邊緣不整齊的波紋狀菌落， 用放大鏡觀察時(shí)， 它們呈卷發(fā)樣構(gòu)造； 腸道桿菌屬的細(xì)菌形成圓形、濕潤(rùn)、黏稠、扁平、大小不等之菌落；巴氏桿菌和豬丹毒桿菌形成細(xì)小露珠 狀菌落。觀察菌落形態(tài)特征時(shí)，通常先用肉眼觀察，再用放大鏡檢查，必要時(shí)用顯微鏡檢查。 觀察的內(nèi)容和方法主要有以下幾個(gè)方面：（1）大小 菌落的大小以毫米來(lái)表示，一般不足1毫米者為露滴狀菌落，12毫米者為小菌落，24毫米者為中等大菌落，46毫米或更大者稱(chēng)為大菌落或巨大菌落。

11、（2） 形狀 菌落的外形有圓形、不整形、樹(shù)根形、葡萄葉形等。（3） 邊緣 邊緣有整齊、鋸齒狀、網(wǎng)狀、樹(shù)葉狀、蟲(chóng)蝕狀、放射狀及卷發(fā)狀等。（4） 表面性狀 觀察其是否平滑或粗糙，是否有皺仄狀，蝸旋狀，甚至有子菌落等。(5)隆起度 有隆起、輕度隆起、中央隆起；反之，略有扁平、陷凹或堤狀等。(6)顏色及透明度 有無(wú)色、灰白色及產(chǎn)生各種色素者；有無(wú)光澤、透明、半透明及不透明等區(qū) 另嘰(7)硬度 有黏液狀、脂狀、干燥或濕潤(rùn)等。三、實(shí)驗(yàn)器材：解剖鏡四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：觀察多種多個(gè)單菌落。4 / 11(二)細(xì)菌的染色觀察一、實(shí)驗(yàn)原理：(1)簡(jiǎn)單染色：只用一種染料使細(xì)菌染色，該法可用于觀察細(xì)菌的形態(tài)，難于辨別細(xì)菌的細(xì)

12、胞結(jié)構(gòu)。(2)革蘭氏染色：G+和G-其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分不同，G-菌的細(xì)胞壁中含有較多的易被乙醇溶解的類(lèi)脂質(zhì)，并且肽聚糖層較薄、 交聯(lián)度低，在使用乙醇或丙酮脫色時(shí)，因類(lèi)脂質(zhì)溶解增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌被脫色，再經(jīng)石炭酸復(fù)紅復(fù)染后即成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類(lèi)脂質(zhì)含量少，脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。(3) 芽孢染色：細(xì)菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁較厚，對(duì)染料的透性差，不易著色，但 是一旦著色又難以脫色。通常，芽孢染色采用弱堿性染料孔雀綠在加熱條件下進(jìn)行。染色完畢，用自來(lái)水 沖洗。

13、因孔雀綠是弱堿性染料，與菌體結(jié)合力較差，因此易被水沖洗掉，而進(jìn)入芽孢中的孔雀綠卻難以溶 出。水洗后，再用一種呈紅色的堿性染料復(fù)染，使菌體和芽孢呈現(xiàn)不同的顏色。二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：染色劑的配置：1、堿性美藍(lán)染色液甲液：美藍(lán)0.3克95%酒精30毫升乙液：0.01%苛性鉀溶液100毫升先配美藍(lán)飽和液(甲液)，將美藍(lán)放入研缽中，徐徐加入酒精研磨均勻后，把甲、乙兩液混合，越 夜后用濾紙過(guò)濾即成。新鮮配制的美藍(lán)染色不好，陳舊的染色好。2、革蘭氏染色液(1) 草酸銨結(jié)晶紫溶液甲液：結(jié)晶紫2克95%酒精20毫升乙液：草酸銨0.8克蒸餾水80毫升將結(jié)晶紫放入研缽中，加酒精研磨均勻，然后將完全溶解的乙液與甲液混合即成

14、。(2) 盧戈氏碘液碘1応 碘化鉀2克，蒸餾水300毫升。將碘化鉀放入研缽中， 加入少量蒸餾水，使其溶解, 在放入已磨散的碘片，徐徐加水，同時(shí)充分磨勻，待碘片完全溶解后，把余下的蒸餾水倒入， 再裝于瓶中。(3) 稀釋石炭酸復(fù)紅溶液取堿性復(fù)紅酒精飽和溶液(堿性復(fù)紅10克溶于95%酒精100毫升中)1毫升和5%石炭酸水溶液9毫升混合，即成稀釋石炭酸復(fù)紅溶液。3、瑞氏染色液取瑞氏染料0.1克，純中性甘油1毫升，在研缽中混合研磨，再加甲醇60毫升，使其溶解，裝入中性瓶中越夜，次日過(guò)濾，盛于棕色瓶中，保存于暗處。保存越久，染色越好。4、姬姆薩染色液 取姬姆薩染料0.6克，加入甘油50毫升，置于5560

15、C水浴箱中，2小時(shí)后加入甲醇50毫升, 靜置1天以上，過(guò)濾后即可使用。三、實(shí)驗(yàn)步驟：一）、一般染色1、美藍(lán)染色法經(jīng)涂片、干燥、固定后，滴加美藍(lán)于涂片上， 使之覆蓋涂面， 染色23分鐘，用水沖洗，晾干或用吸水紙輕壓吸干后即可鏡檢，菌體呈藍(lán)色。2、革蘭氏染色法經(jīng)涂片、干燥、固定后滴加適量草酸銨結(jié)晶紫液于涂面上（以蓋滿細(xì)菌涂面為度），初染1分鐘后水洗。 再滴加盧戈氏碘液覆蓋1分鐘， 水洗（此步水洗可省略） 。加95%酒精脫色約30秒至1分鐘，立即水洗。最后滴加石炭酸復(fù)紅稀釋液復(fù)染1分鐘，水洗，自干或 用吸水紙吸干后鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。（二）、特殊染色法 對(duì)細(xì)菌的莢膜、芽孢、

16、鞭毛等特殊結(jié)構(gòu)，因其不易著色，通常采用特殊的莢膜染色法、芽 孢染色法、鞭毛染色法來(lái)進(jìn)行染色。1、莢膜染色法5 / 11（1）希司氏莢膜染色法細(xì)菌涂片，甲醇固定后，用一小塊濾紙片覆蓋于涂膜上，滴加結(jié)晶紫染液，并置于火焰上略加熱至發(fā)生蒸汽為止（約近1分鐘），傾去染液，除去 濾紙片，再用20%硫酸銅溶液沖洗，待干后鏡檢。菌體呈紫色，莢膜呈淡藍(lán)色。（2）駱氏美藍(lán)莢膜染色法細(xì)菌涂片、固定后，用久貯的駱氏美藍(lán)液染色12分鐘，水洗、干燥后鏡檢。菌體呈藍(lán)色，莢膜呈淡紅色。2、芽孢染色法固定后的涂膜上滴加5%孔雀綠液微微加熱染色0.51分鐘，到發(fā)生蒸汽為止，待冷后水洗，再滴加沙黃液復(fù)染0.5分鐘，水洗、干燥后鏡

17、檢。芽孢成綠色， 菌體呈淡紅色。3、鞭毛染色法取鞭毛菌液，干燥后滴加戶田氏染色液，染色約0.55分鐘，水洗、干燥后鏡檢。菌體呈深紅色，鞭毛呈淡紅色。6 / 11實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的生化特性鑒定細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)是菌種鑒定的重要依據(jù)，通過(guò)細(xì)菌的生理生化反應(yīng)了解細(xì)菌在不同基質(zhì)中的各種代謝途徑和產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物及在菌種鑒定中的重要性，本實(shí)驗(yàn)選做其中的9個(gè)實(shí)驗(yàn)，包括硫化氫試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚實(shí)驗(yàn)）、糖發(fā)酵試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P試驗(yàn)）、甲基紅試驗(yàn)（M.R試驗(yàn)）、尿素酶 試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)。一、硫化氫試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?）了解硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)的用途及原理。（2）學(xué)習(xí)硫

18、化氫產(chǎn)生試驗(yàn)的操作技術(shù)。2、實(shí)驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸）生成硫化氫，硫化氫遇到鉛（或 鐵、鉍）等重金屬鹽，能形成黑色的硫化鉛（或硫化亞鐵、硫化鉍）沉淀物。由于反應(yīng)形成的硫 化氫易被氧化，通常采用穿刺接種，以及在培養(yǎng)基中加入硫代硫酸鈉，使硫化氫不致被氧化。3、實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)菌 培養(yǎng)基酒精棉球酒精燈接種針恒溫箱等4、實(shí)驗(yàn)步驟用穿刺接種法接試驗(yàn)菌于硫酸亞鐵瓊脂培養(yǎng)基中，37 C培養(yǎng)24天5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)基中有黑色物質(zhì)者，為硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。二、 靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)）：1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?）了解吲哚試驗(yàn)的反應(yīng)原理和用途。（2）學(xué)習(xí)吲哚試驗(yàn)的操作技術(shù)。2、實(shí)驗(yàn)原理：某些細(xì)菌具有色氨酸水解酶，能分解