同型半胱氨酸對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的影響

1、    同型半胱氨酸對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的影響        摘要目的：探討同型半胱氨酸(HCY)對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖和成纖維細(xì)胞膠原生成的影響。方法：在培養(yǎng)的兔氣道平滑肌細(xì)胞和大鼠成纖維細(xì)胞上，用3H-胸腺嘧啶和3H-脯氨酸摻入方法觀察不同濃度HCY對(duì)細(xì)胞增殖和成纖維細(xì)胞膠原生成的影響。結(jié)果：HCY(0.11.0 mmol/L)呈濃度依賴性刺激氣道平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性刺激氣道成纖維細(xì)胞的膠原合成與分泌。蛋白激酶C抑制劑H7及多粘菌

2、素B可抑制HCY誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖。結(jié)論：HCY刺激氣道平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)成纖維細(xì)胞的膠原合成和分泌。HCY刺激氣道平滑肌細(xì)胞增殖可能通過PKC信號(hào)傳導(dǎo)途徑。主題詞半胱氨酸；肌，平滑；細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；膠原中分類號(hào)R543文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)04-0333-04 The effect of homocysteine on airway smooth muscle cells and fibroblastsWANG Jian-li, ZHAO Ming-wu,(The Third Hospital, Beijing Medical Univer

3、sity, Beijing 100083 China)WANG Xiao-hong,LI Shu-lian,FU Ming-gui, TANG Chao-shu(The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034 China)Abstract AIM： To study the effect of homocysteine (HCY) on proliferation of airway smooth muscle cells and fibroblasts and the effect of HCY on collag

4、en production of airway fibroblasts.METHODS:H-TdR incorporation was measured in cultured airway smooth muscle cells. The H-TdR and H-proline incorporation were measured in cultured airway fibroblasts.RESULTS:HCY induced proliferation of airway smooth muscle cells and fibroblasts in a concentration-d

5、ependent manner. HCY also induced collagen production of airway fibroblasts in a concentration-dependent manner. The inhibitors of protein kinase C, H7 and polymyxin B, inhibited HCY-induced proliferation of airway smooth muscle cells.CONCLUSIONS:HCY induced proliferation of airway smooth muscle cel

6、ls and fibroblasts, HCY also induced collagen production of airway fibroblasts. The HCY-induced proliferation of airway smooth muscle cells may be related to the pathway of PKC signal transduction.MeSHCysteine; Muscle, smooth; Cells; Fibroblasts; Collagen同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)是甲硫氨酸代謝過程中產(chǎn)生的一種含硫氨基酸。

7、具有損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和刺激血管平滑肌細(xì)胞合成與分泌膠原的作用1，2。高同型半胱氨酸血癥是血管損傷性疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。吸煙是慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的主要病因之一，Nygard等3報(bào)道，吸煙者血漿中HCY濃度高于非吸煙者。高同型半胱氨酸血癥對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)的兔氣道平滑肌細(xì)胞和大鼠氣道成纖維細(xì)胞上觀察HCY對(duì)細(xì)胞增殖及膠原分泌的影響，以探討HCY在伴有氣道重塑的呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中的可能作用。材料和方法一、氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle

8、 cells, ASMC)的培養(yǎng)4體重2 kg的雄性新西蘭大白兔，戊巴比妥鈉50 mg/kg體重腹腔注射麻醉后無菌摘取氣道，放入盛有RPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗，剝?nèi)夤芡饨M織及粘膜層，剪取膜部平滑肌條。將膜部平滑肌條剪成1 mm×1 mm×1 mm左右小塊，用1 mg/mL 型膠原酶37反復(fù)消化2次，分離的細(xì)胞置于含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37，5%CO，95%空氣條件下傳代培養(yǎng)，經(jīng)抗平滑肌-肌動(dòng)蛋白驗(yàn)證為平滑肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用第三代細(xì)胞。二、氣道成纖維細(xì)胞(airway fibroblasts, AFB)的培養(yǎng)體重180 g的sprague-d

9、awley大鼠，戊巴比妥鈉50 mg/kg體重腹腔注射麻醉后無菌摘取氣道，放入盛有RPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗，剝?nèi)夤芡饨M織及粘膜層，剪去膜部平滑肌條，將氣道剩余部分剪成1 mm×1 mm×1 mm左右小塊，用含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液以貼塊法培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)用第三代細(xì)胞。三、氣道平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞3H-胸腺嘧啶摻入測量將細(xì)胞懸液按1×105個(gè)/mL接種于24孔板，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，換用含1%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液孵育24 h，使細(xì)胞同步化于Go期，然后分組加處理因素。氣道平滑肌細(xì)胞分組為(1)對(duì)照

10、組：不加任何處理因素：(2)HCY組：分0.1，0.5，1.0 mmol/L 3個(gè)亞組；(3)H7(50 mol/L)組；(4)H7(50 mol/L)+HCY(0.5 mmol/L)組；(5) polymyxin B(0.48 g/L)組；(6) polymyxin B (0.48 g/L)+HCY(0.5 mmol/L)組。氣道成纖維細(xì)胞分組為(1)對(duì)照組；(2) HCY組：分0.1，0.5，1.0 mmol/L 3個(gè)亞組。加入處理因素12 h后，每孔加入37 kBqH-胸腺嘧啶，再培養(yǎng)12 h，用冷PBS終止反應(yīng)，在Millipore上經(jīng)微孔濾膜收集細(xì)胞，并用10%的三氯醋酸處理，濾膜置

11、于閃爍瓶中，干燥后加入閃爍液過夜，最后在液閃計(jì)數(shù)儀上測量H的放射活性。四、氣道成纖維細(xì)胞3H-脯氨酸摻入測量將細(xì)胞懸液按1×10個(gè)/mL接種于24孔板，分為對(duì)照組及HCY組(0.1,0.5,1.0 mmol/L 3個(gè)亞組)，按方法三中H-胸腺嘧啶摻入法在細(xì)胞中摻入H-脯氨酸(37 kBq/孔)，結(jié)束孵育后，收集培養(yǎng)介質(zhì)以備測膠原含量，H-脯氨酸放射活性測量同方法三。五、介質(zhì)中膠原含量的測定5方法四中移出的介質(zhì)每管各加入25 L 5 mol/L醋酸，25 L胃蛋白酶溶液(溶于0.5 mol/L醋酸中，活性約800 U)，50 L未標(biāo)記的脯氨酸(10 mg/mL)，4放置3 h，加250

12、 L 1.2 mol/L三氯醋酸(4預(yù)冷)，2 h后用微孔濾膜收集沉淀的膠原。用0.6 mol/L三氯醋酸洗膜2次后，再用PBS洗膜2次，濾膜干燥后加入閃爍液過夜，最后在液閃計(jì)數(shù)儀上測量H的放射活性，以反映培養(yǎng)介質(zhì)中膠原含量。六、材料新西蘭兔及sprague-dawley大鼠由北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；HCY，H7，polymyxin B,型膠原酶和胃蛋白酶是Sigma公司產(chǎn)品；H-胸腺嘧啶，H-脯氨酸購自中國科學(xué)院原子能研究所；其它試劑為市售分析純產(chǎn)品。七、統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，以組間t檢驗(yàn)判定均數(shù)是否有顯著差異。結(jié)果一、HCY對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增

13、殖的影響HCY在0.1,0.5,1.0 mmol/L濃度時(shí)可使氣道平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞H-TdR摻入分別比對(duì)照組高46.0%，89.9%，134.5%(P0.01)和41.7%，64.1%，87.7%（P0.05)，呈劑量依賴性(見1)。二、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)抑制劑H7和polymyxin B對(duì)HCY誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響H7和polymyxin B分別與加有0.5 mmol/L HCY的氣道平滑肌細(xì)胞孵育后，H-TdR摻入較單獨(dú)予0.5 mmol/L HCY分別少39.4%和34.8%(P0.01)。單獨(dú)予H7或polymyxin B與氣道平滑

14、肌細(xì)胞孵育，H-TdR摻入與對(duì)照組相比差別無顯著(P0.05)(見2)。Fig 1 The effect of homocysteine on the proliferation of airway smooth muscle cells(ASMC) and airway fibroblast(AFB) (±s,n=6， *P0.01, vs 0 group)1HCY對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig 2 The effect of PKC inhibitors H7 and polymyxin(PB) on the HCY-induced proliferation of

15、 airway smooth muscle cells. (±s,n=6，*P0.01, vs control group)2 PKC抑制劑H7和多粘菌素B對(duì)HCY誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響表1HCY對(duì)氣道成纖維細(xì)胞膠原合成和分泌的影響Tab 1The effect of HCY on collagon production ofairway fibroblasts （±s，n=6）HCY(mmol/L)H-proline incorperation (Counts.min-1）CellulerMedium01282±2542441±5950.118

16、61±498*3237±632*0.51928±625*3505±752*1.02478±585*4359±843*P0.05,*P0.01,vs 0 group 三、HCY對(duì)氣道成纖維細(xì)胞膠原合成和分泌的影響HCY刺激氣道成纖維細(xì)胞H-脯氨酸攝入和膠原蛋白的釋放。HCY在0.1，0.5，1.0 mmol/L濃度時(shí)分別可使細(xì)胞中H-脯氨酸摻入比對(duì)照組高45.2%，50.4%，93.3%(P0.05)，使培養(yǎng)介質(zhì)中膠原蛋白含量比對(duì)照組高32.6%，43.6%，78.6%(P0.05)(見表1)。討論HCY是甲硫氨酸代謝過程中產(chǎn)生的一種含

17、硫氨基酸，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。Tsai等6研究表明，HCY以濃度依賴方式刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖，并對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖起抑制作用。Majors等2發(fā)現(xiàn)，HCY可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞合成和分泌膠原。此外，HCY尚可促進(jìn)氧自由基的生成，激活血小板的粘附和聚集，是心血管疾病發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。HCY對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的影響尚未見報(bào)道。本工作以H-胸腺嘧啶摻入作為DNA合成和細(xì)胞增殖的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)的兔氣道平滑肌細(xì)胞和大鼠氣道成纖維細(xì)胞予不同濃度的HCY刺激后，細(xì)胞增生明顯，呈劑量依賴性。為進(jìn)一步探討HCY刺激氣道平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，將PKC抑制劑H7和polymyxin B分別與HCY同時(shí)加入培養(yǎng)的

18、氣道平滑肌細(xì)胞中孵育，發(fā)現(xiàn)H7和polymyxin B均可抑制HCY誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖，提示HCY刺激氣道平滑肌細(xì)胞增殖可能有PKC信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與。Dalton等研究表明，HCY通過激活PKC促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，這與我們的研究結(jié)果一致7。此外，HCY尚可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的c-myb和c-fos的表達(dá)9，增加細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1和cyclinA的mRNA表達(dá)8，增加轉(zhuǎn)錄因子NF-B的活性9，提示HCY刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖還可能有核內(nèi)癌基因和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白信息傳導(dǎo)途徑參與。HCY刺激氣道平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖是否也通過上述途徑有待進(jìn)一步探討。膠原蛋白分子中約1/3

19、的氨基酸是脯氨酸，本工作以H-脯氨酸摻入作為成纖維細(xì)胞膠原合成的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)HCY以濃度依賴方式促進(jìn)氣道成纖維細(xì)胞的膠原合成。經(jīng)酸處理和胃蛋白酶消化法分離培養(yǎng)介質(zhì)中的膠原蛋白，測量其中H-脯氨酸以代表膠原蛋白含量，發(fā)現(xiàn)HCY也以濃度依賴方式促進(jìn)氣道成纖維細(xì)胞的膠原分泌。Tyagi10發(fā)現(xiàn)在血管平滑肌細(xì)胞膜上存在HCY的氧化還原受體，HCY與此受體結(jié)合后以劑量和時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)膠原表達(dá)。HCY刺激氣道成纖維細(xì)胞膠原合成和分泌是否通過此機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在健康人群中，吸煙者血漿HCY濃度高于不吸煙者，在吸煙者中，血漿HCY濃度與每日吸煙量正相關(guān)3。在伴有早發(fā)血管疾病的病人中，吸煙者

20、血漿HCY濃度也高于不吸煙者。吸煙是COPD的主要致病因素，可引起氣道平滑肌細(xì)胞增生，肥大及纖維化等改變，在COPD的氣道重塑中起重要作用。本工作發(fā)現(xiàn)，HCY既可刺激培養(yǎng)的氣道平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖，又促進(jìn)氣道成纖維細(xì)胞的膠原合成和分泌，HCY是否參與伴有氣道重塑的呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程值得進(jìn)一步探討。王建麗（北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100083）趙鳴武（北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100083）王曉紅（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管研究所，北京 100034）李淑蓮（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管研究所，北京 100034）符民桂（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管研究所，北京 10

21、0034）唐朝樞（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心血管研究所，北京 100034）參考文獻(xiàn)1Welch GN, Loscalzo J. Homocysteine and atherothrombosis J. N Engl J Med, 1998, 338(15)10421050.2Majors A, Ehrhart LA, Pezacka EH. Homocysteine as a risk factor for vascular disease: Enhanced collagen production and accumulation by smooth muscle cells J. Arter

22、ioscler Thromb Vasc Biol, 1997, 17:20742081.3Nygard O, Vollset SE, Refsum H, et al. Total plasma homocysteine and cardiovascular risk profile. The Hordaland Homocysteine Study J. JAMA, 1995, 274(19)15261533.4方秋紅，趙鳴武，任光民，等. 香煙煙霧提取物對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)皮素釋放的影響J. 中華醫(yī)學(xué)雜志，1997，77(3)：201204.5劉菱芬. 細(xì)胞生物學(xué)方法應(yīng)用于細(xì)胞外間質(zhì)成分的研究. 見：李玉瑞主編. 細(xì)胞外間質(zhì)的生物化學(xué)及研究方法M. 第1版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1988. 222223.6Tsai JC, Perrella MA, Yoshizumi M, et al. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: A link to atherosclerosisJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6369