因表達(dá)相對定量RESTC軟件分析與2△△CT法比較

1、 956 -文震編號16723619(2007)KM)95M)3Journal of Tropical Medicine Vol.7 No. 10 Oct.2007基礎(chǔ)研究論著實(shí)時RT-PCR基因表達(dá)相對定最REST©軟件分析與2(兩)法比較泌、劉建平 莊志雄-楊淋清(.張仁利-葉小明，.程錦泉"(1深圳市疾病預(yù)防控制中心分子生物學(xué)研亠亠 2?華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)陀公共衛(wèi)生學(xué)I人晦用達(dá)【摘要】目的 利用實(shí)時RT-PCR技術(shù)逮立一種簡便、準(zhǔn)確的基t 支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE) cDNA為棋板5倍系列稀釋，分別作DN (GAPDH)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以不同劑量反式二脛環(huán)氟笨并(an

2、ti-BPDE 及肺癌細(xì)胞株(H1299)cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時定量RT-PCR。以GAh相對定位。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用2s)法及REE軟件分析。結(jié)果5倍系列橋釋法制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)較好 的線瑕關(guān)系(Rsq 0.997)o POLK及GAPDH菇因擴(kuò)增效率分別為117.5%和103.5%o采用2法卄算出的表達(dá) 比值均比REST0軟件分析高"結(jié)論 實(shí)時RT-PCR技術(shù)結(jié)合REST軟件分折是一種簡便、準(zhǔn)確的基因表達(dá)相財 定昱分析手段?！娟P(guān)鍵詞】實(shí)時RT-PCR；相對定就；標(biāo)準(zhǔn)曲線；基因農(nóng)達(dá)中圖分類號:R446.61 文猷標(biāo)識碼:AQuantitative Analysis of Real-

3、Time PCR Expression Productionby REST© and 2(")YU Lei1, UU Jian-ping1-2, ZHUANG Zhi-xiong1, YANG Lin-qing ZHANG Ren-li1,YE Xiao-ming19 CHENG Jin-quanle(/. Shenzhen Center for Disease Control and Prevention 9 Shenzhen 518020； 2. School of Public Health 9Tongfi Medical College Huazhong Unive

4、rsity of Science and Technology 9 Wuhan 4300309 China)Abstract Objective To develop a simple and accurate method for the quantificalion of real-time KT-PCR gene products. Method Standard curvet of POLK and GAPDH genes were made from 5-fold serially diluted cDNA samples from the normal 16HBE cells. T

5、he levels of POLK mRNA in the malignant transformed 16UBE cells and human lung cancer cells (H1299) treated with various concentTaiiofw of BPDE were determined. GAPDH gene was used as the rcfeimce gene. The relative expression levels were analyzed by REST。and 2'a)method. Result A good linear rel

6、ationship ( Rmj 0.997) was obtained from the slandard curves The efficiency of amplification of POLK and GAPDH genci» was 117.5% and 103.5%, respectively. The expwwion ratios calculated by wing 2<'4ACT) method were higher than the rations obtained from the REST® Condusioo Real-time

7、RT-PCR in combination with REST® is a simple and accurate method for relative quantification of gene exprowion.Key words) real*time RT-PCR； relative quantification; standard curve； gene expra>sion分子流行病學(xué)研克中一個非常重要的內(nèi)容就是在群 體研究茶砒上,從分子或基因水平探索疾病的病因和發(fā)病 機(jī)理。目前實(shí)時RT-PCR已成為基肉表達(dá)定董的強(qiáng)有英金駙目：深圳I市科技計劃頊目(No.TH2

8、0050530(M99A)o 作青筒介：W«(1964-)t女博士 劇主任賞師主宴從事生物化 學(xué)與分子瘴理學(xué)研究。通饑作奢:程侃泉.博士主任醫(yī)師.E-mail： cjinquan«oha.CTMD力的工具，具有高敏性好及定fit范俺廣的待點(diǎn)待 別是定徽低豐度的mRNA及揭示微小的基因表達(dá)變化叫 由于其操作簡單而彼廣泛應(yīng)用但傳統(tǒng)的法定童誤菱 大本文介紹丁一種簡便、準(zhǔn)確的站因表達(dá)相對定傲實(shí) 時RT-PCR方法包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理。1材料與方法1.1材料采用的細(xì)胞株為永生化人支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)。 957 1611BE.anti BPDE轉(zhuǎn)化的I6HBE及

9、肺癌H1299細(xì)胞和 BPDE境品由廣州醫(yī)學(xué)院化學(xué)致鴉研丸所紀(jì)衛(wèi)東博士瞬送。1.2方法121細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞用含10%小牛血清 的MEM培粹液培養(yǎng)。Anti-BPDE誘導(dǎo):antiBPDE需存液 （OMSO溶解）用含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)液稀釋成 絆濃度分別為0.25.05 J >unol/L的洛液。待細(xì)胞長至 80%融合時棄上清，加入含BPDE的堆養(yǎng)液誘導(dǎo)24九 用PBS洗23次細(xì)陋按1:1傳代待細(xì)艙長至80僥融合 時，再加anti-BPDE誘異共3次，以10%小牛！ftl清MEM 培養(yǎng)液作為對照。1.2.2總KNA提取 收集細(xì)胞，用TRhd試劑（Invitrogen

10、Life Technologies公可產(chǎn)品），按照試捌盒操作步驟提取總 RNA。1.2.3 cDNA合成 以各處理組的總RNA為模板進(jìn)行逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用ExScrip產(chǎn)RT-PCR試劑盒（TdGRa公 司）。20 口反應(yīng)緩沖依妖含病機(jī)引物（Random 6 mera）50 pmol/L、逆轉(zhuǎn)錄科（ExScrip產(chǎn)RT*） 50 U.KNA醉抑制劑 10 叭 dNTPs 各 0.5 mmol/L 及總 RNA 1 口。于 PCR 儀 （Gene Amp PCR Sydlein 97001 Applied Bioeystems 公司產(chǎn) 品）42* 15 01111,95%： 2 mino1.2.

11、4實(shí)時定£ RT-PCR基因表達(dá)分析1.2.4.1 TaqMan MGB«針及引物設(shè)計 基因表達(dá)分析的 引物、探針用 Wmer Express 軟件（Applied Biosydtems 公司 產(chǎn)品）設(shè)計（表1）由丄梅幕康主物技術(shù)公司合成。»1甚因寰達(dá)分析的引笹探針序列Tab.l Summary o< the assays wed in gene expresioo個樣本設(shè)3個復(fù)幾同時設(shè)置無模板對照（NTC）o以G4PWZ基因作為內(nèi)參照進(jìn)行POLK基因表達(dá)相對定儀器軟件 （Straugene公司產(chǎn)招）自動分析給岀基因相對表達(dá)盤 （Relative quant

12、ity）或表達(dá)比值（Expression ratio=2<'CT）0 1.2.5數(shù)據(jù)分析 實(shí)隸數(shù)據(jù)分別采用下列2種方法分析。2（s）法：儀器軟件自動分析給出表達(dá)比值使用分析：在相丿 值軟件分析ZfiQ2結(jié)果2.1標(biāo)冷曲以正常5倍及10倍系列稀釋制作尺兒K和GAPDH基兇標(biāo)瓶曲線結(jié)果 表明5倍系列稀釋呈現(xiàn)較好的線型關(guān)條（Rsq 0.997）。 POLK及CAPDH基因擴(kuò)增效率分別為117.5%.和103.5%, 基本一致（圖1,圖2）。0.52 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 3S 4004» 尸 MM引39

13、探針（5 J 3）CAPDII CCATCAATCACCCCTTCATTCCATCGCTGCAATCArATFGCAACrcCTCA ACTACATCOTr ACP -AIUlVtlAAllll ItllArGAUAAlV tAlUA-LAALLlUAAibr GCTCTCTCTGGCECTGAACA :F代衣FAM.P代表MCBX團(tuán)BB1 2LK標(biāo)*曲銭的擴(kuò)壊曲錢Flg.l AmpHflotton curves rf POLK gene standard curves1.2.4.2實(shí)肘定誡RT-PCR 采用Premix Ex加恥試劑盒 （TaKaRa公可產(chǎn)品）。25反應(yīng)緩沖體系含引物各0.4

14、junol/L.探針 02 toI/L.ROX 參考染料及 cDNA 1 口。 反應(yīng)奩MM000熒光定MPCR儀（Straiagee公司產(chǎn)品）上 進(jìn)行。反應(yīng)條件：95弋預(yù)變性10 “再95P 5叭60丫 30片 40個循斤。-1.2.43 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以正t 16HBE cD«A為棋板 分別進(jìn)行2、5、10倍比稀釋。如5倍系列稀釋:1 ”S叫 訊、5七5二分別作X?山和GAPDH祕標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng) 體系及條件見I.2.4.2,儀器軟件（Sen血妙匕谷司產(chǎn)品）自 動分析給出擴(kuò)堆效率（PCR Efficicy,E»10>-!）o 1.2.4 4基因衷達(dá)相對定債分析血不同

15、劑fi anti-BPDE 誘導(dǎo)的16HBE、miBPDE轉(zhuǎn)化的16HBE及肺癌H1299細(xì) 胞cDNA為楔板，進(jìn)行實(shí)時定fit RT-PCR.參見1242。毎S2 POLK因標(biāo)準(zhǔn)曲墳Flg.2 Standard curves of FOUL gene2.2 POLK基因相對定分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用2（f 法及REST9軟件分析（表2）。如肺癌H1299慕興表達(dá)比值采用2（士唯計算為549, 而采用RESlt軟件分析為3.71,可見采用2cs醫(yī)分析的 表達(dá)比值均比REST*軟件分析高。熱帶咲學(xué)雜去2007年10月第7卷第10期 958 Journal of Tropical Medicine V

16、oL7 No. 10 Oct.2007«2 POLK基因相對定表達(dá)比值Tab.2 The rdativt odds nfim of POLK gtnt expression樣本劑«(pmol/L)衣達(dá)比值(Pffl)2<->RESTO1E 常 16HBE1.00L00nti.BPDK 3 次詼9 16MRE0 253.86(0.039)2.50(0855)0.54.33(0.005)2.88(0.887)12.63(0.237)1.85(0.726)H12995.49(0.000)3.71(0.660)anti-BPDE 轉(zhuǎn)化 16HBE2.25(0.407)1

17、.56(0.985)3討論采用實(shí)時RT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)分析包括絕對 定童及相對定雖法。由于研究君多關(guān)注目的基因的表達(dá)變 化即實(shí)驗(yàn)組與對鹽組目的碁忸表達(dá)比值的變化。相對 定St法已成為基因表達(dá)分析最常用的手段。目前市面上侑 售的熒光定 fit PCR 牧如 Stratagrne 公可、Applied Biosytftrnw 公司等多采用的相對定域法。臾其將PCR的擴(kuò)增效 率設(shè)定為1 但實(shí)際的擴(kuò)增效率不可能達(dá)到丨隕此該法計 算出的相對定fit結(jié)果通常比實(shí)際結(jié)果要離。REST0 軟件(rejUive expression software tool)是專門 設(shè)計用于實(shí)時RT-KJR技術(shù)相對定

18、試基與表達(dá)分析。 其具有如下優(yōu)勢：PCR擴(kuò)增效率的修正，表達(dá)比值9 卄算包括了目的垃因及參號里因的擴(kuò)增效率.結(jié)果更準(zhǔn) 確，并不一定要像法要求耳的基因及簽考基因的擴(kuò) 增效率一致;統(tǒng)計學(xué)分析，采用簡單的統(tǒng)計學(xué)隨機(jī)檢驗(yàn) (randomization test),克服了傳統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)分析的復(fù)雜性特 別是能用于組間(如實(shí)驗(yàn)組與對照組)務(wù)個基因表達(dá)分析。 本文采用TaqMan MCB探針實(shí)時RT-PCR法相對定fit POLK基因表達(dá)，將*3法與RES”軟件分析進(jìn)行了比 較，表明采用2亠6法計算的表達(dá)比值均比RESTO軟件分 析高。FaiohB等播岀若目的基因與參考基因的擴(kuò)增效 率相差超過5%最好采用REW軟

19、件分析。采用實(shí)時RT PCR技術(shù)相對宦就基因表達(dá)，關(guān)鍵一步 就是標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作即獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計算擴(kuò)增 效率。一般儀器說明書建議使用2倍稀釋法。本文分別 用 了 £" Hr 12. / 2 £ iM XK 丘 4 vwr Xn PDfJ基因標(biāo)準(zhǔn)曲線型關(guān)系(Rsq0.9總之二結(jié)合泉一種簡便J1 俞噸衣陳聲林.我國分子淹行病學(xué)研究進(jìn)WJ.中華潦 行病學(xué)聚匕2000, 21(5)： 383-3862 PFAFFL MW, HORGAN CW. DEMOTE L. et al. RdMive expression software tool (REST) for gr

20、oup-wise comparison and Katiytical Analysis of rehtive expedition reeuite in rctl- time PCRfJ). Nuclek Acds Res, 2002, 30 (9)； e363 張弛宇檢喉U«f*. 一種紙穎簡便的熒光實(shí)時RT- PCR相對定方法的建立J生物化學(xué)與生物物理逬展. 2005, 32(9)： 883-8874 江慶詔李瑣元曾嶺等掄腋二甲雙肌時菲灑箱性冊 防胖大艮庸肪組織腫制壞死因子a墓因表達(dá)的影響J. 中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版).2006 , 27(4). 383-3865 FA1OLA

21、 B. FUI4JEK E3. W0«G VA. & al. Gene expzlon profile in bone marrow aid hematopoietic «tem cells in mice expoeed to inhaled benzeie J. Mutadon Rest 2OO4v 549 (U2)： 195-2116 Mx4000TM Multiplex Quinlitative PCR System In&tn>ction Anual： 119-120.(收稿 fl 期：2(«7-05-23：修回日期：2007-07

22、-06)(上按第947頁)reaponse at m *pSen lymphocyte*J. Neunoeci Ret. 1987. 18： 134-139.14 OTTEN Ut EHRfURD P, PECK R. Nerve growth (actor induces growth and diflerratiation (/ human B lymphocytes J仏 Nad Acad Sci USA. 1989 , 86： 10059-10063.15 KIMATA H, YOSHIDA A, (SHIOKA C. & al. Nerve growth factor spedflcaDy indocet human lgG4 production J. Eur lmmmol, 1991, 21； 137-M1.16 HAMADA A, WATANABE H9 OHTOMO H Nerve growth fiar enhances oundval and cytoto