蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

1、蛋白質(zhì)印跡技術(shù) 蛋白質(zhì)印跡（western blotting）是一種檢測固定在固相基質(zhì)上的蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)辦法，又稱免疫印跡（immunoblotting )。1979年，towbin等將分析dna的southern blotting技術(shù)擴展到蛋白質(zhì)的討論領(lǐng)域，并且和特異、敏捷的免疫分析技術(shù)相結(jié)合，稱之為“western blotting"（蛋白質(zhì)印跡）。免疫印跡可分為兩個步驟：將蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn)移至固相基質(zhì)上；特異性抗體檢測。 試驗原理 蛋白質(zhì)印跡法是將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)sds-page后，分別為不同的條帶，其中含有能與特異性抗體相結(jié)合的待檢測的蛋白質(zhì)（抗原蛋白），將凝膠上的蛋白質(zhì)以電

2、轉(zhuǎn)印的方式，轉(zhuǎn)印至固相支持物（如硝酸纖維素膜，nc膜）上，再用特異抗體作為探針對靶蛋白舉行檢 測的辦法。因為該辦法結(jié)合了page的高辨別率和固相免疫反應(yīng)的高特異性等多種優(yōu)點，可檢測到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。 儀器和材料 電轉(zhuǎn)移裝置（電源）；搖床；暗匣；轉(zhuǎn)印夾；淺盤（30cm×15cm×3cm)；玻璃棒；雜交袋或雜交盒；膠片；保鮮膜；濾紙；0. 22m孔徑的硝酸纖維素膜。 試劑 (1) running buffer (tris-甘氨酸電泳緩沖液，1×2500ml) ; 25 mmol/l tris 7. 55g 250mmol/l甘氨酸 47. 0

3、g 10%sds 25m1 (2) transfer buffer ( tris-甘氨酸電轉(zhuǎn)膜緩沖液，1× 2500m1，ph8.3）： 48 mmol/l tris 14. 50g 39mmol/l 甘氨酸 7. 25g 10% sds 9. 25ml 20 甲醇 500m1 (3) ttbs緩沖液（ph 7.5，2 ×2500ml)： 20 mmol/l tris 12. l l g 0. 5 m nacl 146. 1 g 0.05%tween 20 2. 5 ml (4) stripping buffer（ph2. 0，1000m1)： 甘氨酸 1. 8768 sd

4、s 10. 0g (5) 10牛奶封閉液： 稱取10. 0g脫脂奶粉，溶于80m1 ttbs（ph7. 5 )中，攪拌徹低溶解，后加入ttbs定容至100m1，再加入10l thimerosal混勻。 (6) 10 ×麗春紅染液 麗春紅 2. 0g 三氯乙酸30.0g 磺基水楊酸 30. 0g 蒸餾水 100m1 (7）第一抗體（以-actin為例）。 (8) 酶聯(lián)其次抗體（如：辣根過氧化物酶標志的羊抗鼠二抗）。 操作步驟 蛋白質(zhì)經(jīng)sds-page分別后，必需從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物具有牢固結(jié)合蛋白，又不影響蛋白質(zhì)抗原活性，而且支持物本身還有免疫反應(yīng)惰性等特點。常用的支

5、持物有：硝酸纖維膜（nc膜）或pvdf膜。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過程普遍采納電轉(zhuǎn)印法，分為半干式和濕式轉(zhuǎn)印兩種模式。 (1) 半干式電轉(zhuǎn)印 1) 將nc膜和濾紙切成與凝膠一樣大小，置轉(zhuǎn)移緩沖液中潮濕5-l0min。 2) tris/甘氨酸-sds-page結(jié)束后，戴手套取出凝膠，在tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取凝膠辦法：用刀片將兩玻璃板分開，將多余的凝膠劃去，上部以濃縮膠為準所有棄去。將玻璃板放入轉(zhuǎn)移緩沖液中，掀起凝膠的一角緩慢從玻璃板上取下凝膠。 3）根據(jù)以下挨次放置：濾紙，凝膠和nc膜到半干槽中。 4）每層之間的氣泡要所有去除。可以用玻璃棒輕輕在上一層滾動去除氣泡。然后，用一絕緣的塑

6、料片中間挖空與凝膠一樣大小或略小一點，以防電流挺直從沒有凝膠處通過造成短路，蓋好加上陽極電極板。 (2) 濕式電轉(zhuǎn)印 1) tris/甘氨酸-sds-page結(jié)束后，取出凝膠，在tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取出凝膠的辦法同半干式電轉(zhuǎn)印。 2）打開電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海綿墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，普通用3層濾紙就可以了。濾紙與nc膜，凝膠大小相同，將nc膜平放在陽極側(cè)濾紙上，之后將凝膠平放在nc膜上再蓋上3層濾紙，用玻璃棒輕拼濾紙以去除氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。 3) 電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，銜接好電極，接通電流，普通用400ma轉(zhuǎn)印3-4h。轉(zhuǎn)印夾的nc

7、膜應(yīng)對電泳槽的正極。（轉(zhuǎn)膜液事先預(yù)冷至4）。 印跡膜上總蛋白染色 在確定印跡中是否存在總蛋白之前，通過對硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋白的組成狀況，并可確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標志物的位置和轉(zhuǎn)印是否勝利。同時，該辦法也清晰地顯示出轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的復(fù)雜性。但條件試探成熟后，不建議用此法。 麗春紅s印跡膜染色法： 麗春紅s適用于酸性水溶液，但是染色不持久，在后續(xù)的處理中紅色染料易被洗去。因為與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆性的，該染色辦法適用于全部顯示抗原的技術(shù)，而不影響后續(xù)的免疫檢測。麗春紅s帶負電荷，可與帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合，同時麗春紅也可與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合，從而形成紅色條帶。 操作步驟： 1)

8、轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取出印跡膜至于麗春紅s應(yīng)用液中，并在室溫下攪動5-l0min。 2) 將膜放入ttbs洗數(shù)次，每次1-2min，并且更換ttbs。 3）按照需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標準位置舉行標志。 至此膜可以用于封閉和加入抗體。 免疫檢測 (1) 膜封閉在舉行抗體雜交之前，需要先對轉(zhuǎn)印膜舉行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉普通采納異源性蛋白質(zhì)，常用的有20% bsa、10馬血清，以及10脫脂奶粉等。至于挑選哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測試劑相適應(yīng)，如采納葡萄球蛋白a (spa）作用檢測試劑，就不能用全血清封閉。此外，應(yīng)盡可能使非特異著色背景淺，封閉液以20% bsa效果最好，第二是10脫脂

9、奶粉。 封閉過程： 1) 洗轉(zhuǎn)印膜：室溫ttbs漂洗3次，每次l0min，盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的sds，防止影響后面的抗體結(jié)合。 2）取出漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入10脫脂奶粉的封閉液內(nèi)，搖床振動，室溫封閉lh左右。回收封閉液，以備重復(fù)用法。 3）用蒸餾水沖洗膜數(shù)遍后，再用1×ttbs ( ph7. 5 )洗液，室溫漂洗3次，每次l0min。 (2) 抗體雜交抗體雜交主要采納間接法。即先加入未標志的特異性抗體（一抗）與膜上抗原結(jié)合，再加入標志的抗抗體（二抗）舉行雜交檢測，標志二抗的物質(zhì)有發(fā)射性核素、酶，以及生物素等。 雜交過程： 1) -actin兔抗鼠單克隆抗體按1：1000比例稀釋于20m1

10、ttbs液中，并加入0. 01 % thimerosal。 2）封閉后的nc膜放入雜交袋或雜交盒中，加入抗體稀釋液稀釋的-actin一抗?jié)舛葹?：1000 (v/v )，4孵育過夜或室溫搖動孵育3-4h。然后，回收抗體，4下，保存，以備重復(fù)應(yīng)用。 3) 蒸餾水沖洗膜數(shù)遍后，用ttbs液洗膜3次，每次l0min。 4) 辣根過氧化物酶(hrp）標志的抗兔igg 1 : 5000稀釋于20mlti'bs液中，在雜交盒內(nèi)室溫孵育1h。 5）棄二抗溶液，蒸餾水沖洗膜數(shù)遍，再次用ttbs液洗膜，共3次，每次10min。 (3）信號檢測按照標志二抗的標志物不同，其雜交結(jié)果的檢測辦法也不同，較常用的

11、檢測系統(tǒng)有hrp標志二抗的增加化學(xué)發(fā)光(ecl）和dab檢測系統(tǒng)。辣根過氧化物酶-dab法： 1) dab顯色液的配制：根據(jù)lml h2o加顯色劑a、b、c各1滴，混勻。 2) 顯色：將適量dab顯色液平鋪在二抗雜交后的印跡膜上，室溫放置觀看，可浮現(xiàn)顯然的棕褐色蛋白顯色帶。 3）終止：用tris·hcl緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應(yīng)。 辣根過氧化物酶-ecl法： 增加化學(xué)發(fā)光（ecl）檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，生成一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，其衰變時在暗室內(nèi)形成顯然的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶，利用x線膠片感光原理，將結(jié)果記錄下來： 1）依據(jù)supersignal west p

12、ico chemiluminescent substrate試劑盒的解釋，取發(fā)光劑和增加劑各1 ml，按1：1比例混合，倒入盛有 nc膜的雜交盒內(nèi)，用手輕輕搖動雜交盒，使發(fā)光劑及氧化劑混合勻稱并與膜表面充分接觸。 2) 5min后，取出膜，用保鮮膜小包，排凈氣泡，將nc膜貼在暗盒上，進入暗室曝光。 3）取一張x線膠片，將感光面向準nc膜，放在膜的正上方，合上暗盒，開頭計時，曝光5min后取出x線膠片，立刻投入顯影液中。顯影5min，用水漂洗x線膠片數(shù)次，然后把x線膠片移入定影液中定影10-20min。曝光完畢即可得到有清楚-actin條帶的x線片，流水沖洗數(shù)分鐘，懸掛晾干。不同條件下（如檢測信

13、號強弱不同），曝光時光不同，可短至幾秒，也可以長到數(shù)小時。試驗結(jié)果應(yīng)用gel doc凝膠成像系統(tǒng)中的quantity one圖像分析軟件舉行半定量分析。 以低氧預(yù)適應(yīng)對小鼠海馬組織內(nèi)絲裂原和應(yīng)激激活蛋白激酶(msk )磷酸化水平影響為例，圖15.1和15.2分離為磷酸化msk(p-msk）和內(nèi)參照-actin的典型免疫印跡結(jié)果；圖15.3為p-msk的定量分析結(jié)果。 5注重事項 (1) 濕式電轉(zhuǎn)印開頭前，要先打開循環(huán)冷凝系統(tǒng)，蛋白轉(zhuǎn)印條件為：4、400ma。 (2）首次轉(zhuǎn)移時，可同時轉(zhuǎn)兩塊膠，一塊染色，用以檢查轉(zhuǎn)移效率，另一塊舉行免疫印跡。 (3）檢測的目的蛋白分子量較小時，要用小孔徑的nc膜，如：0. 22 m 。 (4）免疫印跡雜交的敏感度與檢測系統(tǒng)有關(guān)，因此，凝膠電泳時的蛋白上樣量應(yīng)當保證被檢測抗原量不至于太低。假如過低，樣品應(yīng)當重新純化和濃縮后再用法。建議做一次梯度稀釋，挑選最佳上樣量。 (5）為削減蛋白質(zhì)條帶的蔓延，上樣后應(yīng)盡快舉行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)挺直舉行轉(zhuǎn)印。 (6）取出凝膠后，應(yīng)注重分清上下方向，可用刀片切去凝膠的一角作為標志（如左上角）。轉(zhuǎn)膜時也應(yīng)用同樣的辦法，對nc膜做標志（如左上角）以分清正反面和上下關(guān)系。 (7）轉(zhuǎn)膜時，應(yīng)依次放好nc